新藥T-006對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的改善作用

宋　奇，王　琴，吳韋黎，邵　敏，張　宇，張?jiān)谲?，王玉?qiáng)，陶　亮

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州　510080；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州　510632)

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新藥T-006對(duì)東莨菪堿所致記憶障礙模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的改善作用

宋奇1，王琴1，吳韋黎1，邵敏1，張宇1，張?jiān)谲?，王玉強(qiáng)2，陶亮1

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州510080；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州510632)

摘要：目的探討新藥T-006對(duì)東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及其作用機(jī)制。方法將72只♂昆明小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組(給予東莨菪堿)、陽(yáng)性藥對(duì)照組(多奈哌齊+東莨菪堿)、T-006組(T-006+東莨菪堿，包括T-006 1 mg·kg-1組、T-006 3 mg·kg-1組和T-006 10 mg·kg-1組)。連續(xù)給藥14 d，給藥d 11進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d，前4 d為定位航行實(shí)驗(yàn)，d 5為空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)，除正常對(duì)照組外，每天每只小鼠于入水前20 min腹腔注射2 mg·kg-1東莨菪堿造模，正常對(duì)照組腹腔注射等量無(wú)菌生理鹽水?？臻g探索實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不再給予東莨菪堿造模并且不進(jìn)行T-006給藥。5 d水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即取樣并檢測(cè)大腦海馬和皮層抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)以及乙酰膽堿酯酶活性。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低，海馬和皮層中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)含量明顯下降，丙二醛(MDA)含量明顯升高，乙酰膽堿酯酶(AchE)活性明顯增高；各劑量的T-006均能明顯改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，所試劑量(3、10 mg·kg-1)的T-006明顯提高腦組織中SOD活性和GSH含量，并降低MDA含量和AChE活性。結(jié)論T-006能明顯改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，該作用機(jī)制可能與其抗氧化作用以及抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：T-006；東莨菪堿；Morris水迷宮；昆明小鼠；海馬；皮層；學(xué)習(xí)記憶能力

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知功能障礙等精神癥狀[1-2]。AD 典型的病理變化包括大腦組織中老年斑沉積(主要由Aβ蛋白形成)，神經(jīng)元纖維纏結(jié)和膽堿能神經(jīng)元丟失[3]。AD的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，“Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說”是目前較為公認(rèn)的 AD 發(fā)病學(xué)說之一[3-4]，該學(xué)說認(rèn)為，AD發(fā)生時(shí)，Aβ蛋白異常沉積引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激毒性、神經(jīng)炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)破壞等，直接或間接地?fù)p傷神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致Aβ沉積，周圍膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，從而產(chǎn)生記憶損傷。

目前國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)用于AD治療的藥物多為膽堿酯酶抑制劑，代表藥為多奈哌齊，其主要通過抑制乙酰膽堿酯酶活性而抑制乙酰膽堿降解，增加局部乙酰膽堿濃度，從而改善神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能。但多奈哌齊只針對(duì)輕、中度AD，隨著病程發(fā)展，功能完整的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，多奈哌齊的作用也會(huì)隨之減弱。因此，開發(fā)治療AD 的新型藥物十分重要。川芎嗪(TMP)來(lái)源于中藥川芎的干燥根莖，具有抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡等多方面藥理作用，但生物利用度不高[5]。J147是美國(guó)索克生物研究所合成的化合物，具有保護(hù)神經(jīng)突觸功能的作用[6]。T-006是我們將TMP分子連接到J147上，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾而得到的新型化合物，前期體外實(shí)驗(yàn)證明，T-006在應(yīng)激細(xì)胞模型中可表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激作用，可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于損傷[5]，提示該化合物有可能成為治療AD的新型藥物。本研究以東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作為模型，就T-006對(duì)該模型中小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。

Fig 1　Flowchart of animal experiments

1材料與方法

1.1試劑與儀器

T-006由暨南大學(xué)藥學(xué)院合成；多奈哌齊由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供；氫溴酸東莨菪堿和AchE試劑盒均購(gòu)自Sigma公司；SOD試劑盒、GSH試劑盒、MDA試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)購(gòu)自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

1.2動(dòng)物與分組

健康♂成年昆明小鼠72只，體質(zhì)量(20±2) g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK(粵) 2011-0015]。動(dòng)物隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組(給予東莨菪堿)、陽(yáng)性藥對(duì)照組(多奈哌齊+東莨菪堿)、T-006組(T-006+東莨菪堿，包括T-006 1 mg·kg-1組、T-006 3 mg·kg-1組和T-006 10 mg·kg-1組)，每組12只。隨機(jī)分組后d 2開始給藥，連續(xù)給藥14 d，實(shí)驗(yàn)流程圖見Fig 1。每只小鼠采用灌胃方式給藥，正常組與模型組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物溶劑(0.64 mol·L-1DMSO)。

1.3東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙模型的建立

模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組和T-006 3個(gè)劑量組分別在水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠入水前20 min腹腔注射2 mg·kg-1東莨菪堿造成記憶障礙，正常對(duì)照組小鼠注射相應(yīng)劑量無(wú)菌生理鹽水。

Fig 2　Results of Morris water maze assays(n=12)

1:Control;2:Model;3:Donepezil;4:T-006 1 mg·kg-1;5:T-006 3 mg·kg-1;6:T-006 10 mg·kg-1;*P<0.05vsmodel group.

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[7]，并作適當(dāng)修改。實(shí)驗(yàn)時(shí)間總共5 d，以定位航行、空間探索為指標(biāo)。定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行4 d，觀察和記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找并爬上隱藏平臺(tái)所需時(shí)間。最后1 d(水迷宮實(shí)驗(yàn)d 5)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄動(dòng)物第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間(即潛伏期)、穿越平臺(tái)位置的次數(shù)以及在目標(biāo)象限活動(dòng)的時(shí)間和路程。

1.5乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，以冰冷生理鹽水灌流后將動(dòng)物斷頭取腦、分離海馬和皮層。分別按海馬和皮層重量加9倍蛋白裂解液制備腦組織勻漿，10 000×g離心30 min，取上清于-20℃冰箱保存。根據(jù)Sigma乙酰膽堿酯酶活性測(cè)試盒的說明書測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。

1.6SOD活性及GSH、MDA含量測(cè)定

按上述方法制備海馬和皮層組織勻漿，10 000×g離心30 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的SOD活性、GSH含量和MDA含量測(cè)定說明書，測(cè)定SOD活性及GSH和MDA含量，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。

1.7數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計(jì)

2結(jié)果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，正常對(duì)照組動(dòng)物找到隱藏平臺(tái)時(shí)間逐漸縮短，表明該訓(xùn)練方法有效。與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物找到平臺(tái)時(shí)間的平均值無(wú)明顯變化，表明東莨菪堿致記憶障礙模型建模成功；與模型組相比，多奈哌齊組動(dòng)物找到平臺(tái)時(shí)間的平均值明顯縮短，表明陽(yáng)性藥多奈哌齊在該模型中可以有效逆轉(zhuǎn)東莨菪堿造成的學(xué)習(xí)記憶障礙；與模型組相比，T-006 3個(gè)劑量組動(dòng)物找到平臺(tái)時(shí)間均值明顯縮短(P<0.05)，效果與多奈哌齊相當(dāng)，見Fig 2A。

水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，多奈哌齊組動(dòng)物潛伏期與模型組相比明顯縮短(P<0.05)，T-006 3個(gè)劑量組動(dòng)物潛伏期與模型組相比明顯縮短(P<0.05)，見Fig 2B。與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)明顯減少(P<0.05)，多奈哌齊組動(dòng)物穿越平臺(tái)次數(shù)與模型組相比明顯增加(P<0.05)，T-006 3個(gè)劑量組動(dòng)物穿越平臺(tái)次數(shù)與模型組相比明顯增加(P<0.05)，見Fig 2C。與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物在目標(biāo)象限游泳路程明顯減少(P<0.05)，多奈哌齊組動(dòng)物在目標(biāo)象限路程與模型組相比明顯增加(P<0.05)，T-006 3個(gè)劑量組動(dòng)物在目標(biāo)象限路程與模型組相比明顯增加(P<0.05)，見Fig 2D。與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)，多奈哌齊組動(dòng)物目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間與模型組相比明顯增加(P<0.05)，T-006 3個(gè)劑量組動(dòng)物目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間與模型組相比明顯增加(P<0.05)，見Fig 2E；各組動(dòng)物之間的平均游泳速度沒有明顯差異(P>0.05)，排除了動(dòng)物體力差異對(duì)結(jié)果的影響，見Fig 2F。

Fig 3　AchE activities in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group.

2.2乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組海馬和皮層中AChE活性均明顯升高(P<0.05)。在海馬組織中，與模型組相比，T-006(10 mg·kg-1)組和多奈哌齊組AChE 活性明顯降低(P<0.05)；在皮層組織中，與模型組相比，T-006(1、3、10 mg·kg-1)組和多奈哌齊組AChE 活性明顯降低(P<0.05)，見Fig 3。

2.3GSH、SOD及MDA含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1SOD測(cè)定結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬和皮層SOD活性明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組海馬和皮層SOD活性無(wú)明顯升高(P>0.05)，T-006(1、3、10 mg·kg-1)組海馬和皮層SOD活性明顯升高(P<0.05)；與多奈哌齊組相比，T-006(10 mg·kg-1)可明顯升高海馬SOD活性(P<0.05) ，見Fig 4。

Fig 4　SOD activities in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsdonepezil group.

2.3.2GSH測(cè)定結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬和皮層GSH含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組海馬和皮層GSH含量無(wú)明顯升高(P>0.05)；與模型組相比，T-006(3、10 mg·kg-1)組海馬GSH含量明顯升高(P<0.05)，T-006(1、3、10 mg·kg-1)組皮層GSH含量明顯升高(P<0.05)；與多奈哌齊組相比，T-006(10 mg·kg-1)可明顯升高海馬GSH含量(P<0.05) ，見Fig 5。

2.3.3MDA測(cè)定結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬和皮層MDA含量明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組海馬和皮層MDA含量無(wú)明顯降低(P>0.05)；與模型組相比，T-006(3、10 mg·kg-1)組海馬和皮層MDA含量明顯降低(P<0.05)；與多奈哌齊組相比，T-006(3、10 mg·kg-1)可明顯降低皮層MDA含量(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 5　GSH levels in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsdonepezil group.

3討論

本實(shí)驗(yàn)使用東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作為模型，東莨菪堿是乙酰膽堿的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，小鼠腹腔注射東莨菪堿能阻滯M膽堿受體傳遞，模擬乙酰膽堿分泌不足造成的可逆性學(xué)習(xí)記憶障礙[9-10]。因此，東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙模型被認(rèn)為是AD藥物研究經(jīng)典的初篩模型。本研究在該模型上評(píng)價(jià)了新型化合物T-006對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T-006可明顯改善癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，T-006作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激作用和抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。

AD的發(fā)病機(jī)制至今尚未被完全闡明，目前公認(rèn)的AD發(fā)病假說有“Aβ級(jí)聯(lián)假說”和“膽堿能假說”。Aβ級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為，腦組織中沉積的Aβ蛋白會(huì)產(chǎn)生一系列的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，作用于膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞，其中包括氧化應(yīng)激損傷[4]，而SOD、GSH和MDA是反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)的主要標(biāo)志物[8,11]；AD膽堿能假說認(rèn)為，乙酰膽堿酯酶活性升高會(huì)導(dǎo)致中樞乙酰膽堿含量降低，影響神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T-006可顯著升高腦組織中SOD、GSH含量，降低MDA含量，且效果優(yōu)于多奈哌，并且T-006可有效拮抗東莨菪堿引起的乙酰膽堿酯酶含量升高，提示T-006的作用還可能與增強(qiáng)腦內(nèi)中樞膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。

Fig 6　MDA levels in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsdonepezil group.

T-006是一種經(jīng)過篩選得到的具有開發(fā)價(jià)值的新型化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于多奈哌齊等傳統(tǒng)單靶點(diǎn)藥物，而是來(lái)源于多功能的中藥單體，故T-006應(yīng)具有多方面藥理活性。本研究首次發(fā)現(xiàn)，T-006具有多方面藥理作用，其增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與抑制乙酰膽堿酯酶合成，從而減少乙酰膽堿分解，提高腦內(nèi)乙酰膽堿水平有關(guān); 并且該化合物也可能通過抗氧化損傷作用，保護(hù)膽堿能神經(jīng)元，改善膽堿能系統(tǒng)功能，從而促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力。綜上所述，T-006是一種有前景的多靶點(diǎn)AD治療新藥，但仍需運(yùn)用其它能夠多方面模擬AD病理特征的模型，如大鼠側(cè)腦室注射Aβ蛋白模型和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，對(duì)其藥效進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證并探究其深層次的機(jī)制。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室陶亮課題組完成，受試藥T-006由暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所提供。實(shí)驗(yàn)參與人員有：宋奇，吳韋黎，邵敏，張宇。)

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Effects of new drug T-006 on improving learning and memory abilities in scopolamine-induced dementia Kunming mice

SONG Qi1，WANG Qin1，WU Wei-li1，SHAO Min1，ZHANG Yu1,ZHANG Zai-jun2，WANG Yu-qiang2，TAO Liang1

(1.DeptofPharmacology，ZhongshanSchoolofMedicine，SunYat-SenUniversity，Guangzhou510080，China；2.InstituteofNewDrugResearch，CollegeofPharmacy，JinanUniversity,Guangzhou510632，China)

Abstract:AimTo explore the effects of new drug T-006 on improving learning and memory abilities in scopolamine-induced dementia mice and its possible mechanism.Methods72 male Kunming mice were randomly divided into six groups: normal control group, model group, donepezil treatment group, T-006 treatment group with different doses(1, 3 and 10 mg·kg-1). All mice were treated by intragastric administration for 14 consecutive days. Learning and memory abilities were tested by a five-day Morris water maze trial from the 11th day. the first 4 days of the five-day Morris water maze, the navigation test was performed, the last day of Morris water maze is the spatial probe test.During the navigation test, mice were intraperitoneally given 2 mg·kg-1scopolamine 20 minutes before entering the water, while normal control group mice administrated with sterile saline instead. Mice were not given T-006 nor scopolamine in spatial probe test.After Morris water maze, all mice were sacrificed for hippocampus and cortex. The activities of AchE and SOD and the levels of GSH and MDA in hippocampus and cortex were measured after tissue harvesting.ResultsCompared with model group, T-006 could obviously improve learning and memory abilities in scopolamine-induced mice, significantly increase the levels of SOD and GSH and decrease the levels of MDA and AchE.ConclusionT-006 can significantly improve cognitive abilities in scopolamine-induced dementia mice, and its relevant mechanism may be closely related to its antioxidative effect and the ability to decrease AchE level.

Key words：T-006;scopolamine;Morris water maze; Kunming mice; hippocampus; cortex; learning and memory abilities

收稿日期:2016-02-01,修回日期:2016-03-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81373439)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No 2014A020209032)；廣州市科技局科技攻關(guān)引導(dǎo)項(xiàng)目( No 201300000158)

作者簡(jiǎn)介：宋奇(1991-)，男，碩士生，研究方向：細(xì)胞縫隙連接與疾病，E-mail:toyota87@163.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.015

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0812-06

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R322.81；R338.64；R745.7；R977.3

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.030.html

陶亮(1959-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞縫隙連接與疾病，通訊作者，E-mail: taol@mail.sysu.edu.cn