• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用

    2016-07-05 15:40:22郭海龍
    中獸醫(yī)學(xué)雜志 2016年5期
    關(guān)鍵詞:痘病毒血樣膿皰

    常 亮,黨 巖,郭海龍

    (甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?44000)

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用

    常 亮,黨 巖,郭海龍

    (甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?44000)

    以GenBank上羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒(ORFV)B2L基因序列,用Primer premier 5.0軟件設(shè)計1對引物并合成,經(jīng)PCR條件優(yōu)化,確定了最佳的PCR反應(yīng)條件,建立了羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法。結(jié)果顯示,設(shè)計的引物能擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為540bp左右,與預(yù)期大小一致;同時檢測山羊痘病毒,結(jié)果均為陰性;該方法能檢出羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒最低量為5pg。經(jīng)證實(shí),建立起羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法具有良好的特異性和敏感性,可用于臨床病料檢測。

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒;PCR;特異性;靈敏度

    羊接觸傳染性膿皰皮炎,又稱羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿瘡、羊口瘡,是由羊傳染性膿皰病毒又稱羊口瘡病毒感染引起綿羊、山羊的接觸性、嗜上皮性傳染病[1],以口唇等處的皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂為特征,羊群的發(fā)病率高達(dá)90%,病死率1%-25%[2],給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。人、犢牛、駱駝等也可感染本病。目前本病診斷有電子顯微鏡檢查、病毒分離、接種試驗(yàn)和AGP等方法[3-7]。由于本病與羊感染口蹄疫病毒、羊痘病毒臨床癥狀相似,特別在繼發(fā)感染或混合感染難以區(qū)分,這就為本病的確診增加了難度。為了準(zhǔn)確、快速檢測本病,本研究建立了羊傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法,經(jīng)初步應(yīng)用取得良好的檢測效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒株及臨床樣品

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒毒株,由本實(shí)驗(yàn)室保存;臨床血樣采集甘肅省平?jīng)鍪小c陽市和張掖市肅南裕固族自治縣等地羊只,低溫保存。

    1.1.2 試劑盒及試劑

    Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計與合成

    根據(jù)GenBank中ORFV的全基因序列中較保守的B2L基因序列,設(shè)計引物1對,預(yù)計擴(kuò)增目的片段大小為 540bp。上游引物為 P1:5’-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3’, 下游引物 P2:5’-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3’,預(yù)計產(chǎn)物大小為540bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供。

    1.2.2 病毒DNA的提取

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒細(xì)胞毒DNA提取:取500μL細(xì)胞毒液于離心管中,煮沸10min,冰水水浴3min,10000r/min離心10min,取上清做模板。

    臨床樣品血樣DNA提?。喝⊙獦?00μL至2.0mL離心管中,依次加入00μL滅菌雙蒸水、400μL6mol/L的碘化鈉、800μL氯仿-異戊醇(24:1),顛倒混勻,14000r/min 離心 10min;吸上層水相500μL于另一離心管中,加入300μL異丙醇,80μL3mol/L醋酸鈉,混勻后 -20℃靜置10min,14000r/min離心 10min;棄上清,加 70%乙醇 1mL,混勻,14000r/min離心 5min,棄去乙醇,晾干,加20μL滅菌雙蒸水4℃保存。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增

    25μL 反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 混 合 物 (各 2.5mmol/L)3μL、Taq DNA 聚合酶 (2.5U/μL)0.2μL、上引物 P1、P2(10pmol/μL)各 1.0μL、DNA 模板 2.5μL、滅菌雙蒸水(ddH2O)加至 25μL。

    經(jīng)優(yōu)化后PCR條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性 30s,56℃退火 30s,72℃延伸 30s,32個循環(huán),最后72℃延伸10min。

    取擴(kuò)增產(chǎn)物8μL與溴酚藍(lán)緩沖液2μL混勻,加樣于2%瓊脂糖凝膠中,電泳后,觀察結(jié)果。

    1.2.4 PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)

    用建立的PCR方法分別檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒和健康羊血樣。

    1.2.5 PCR擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)

    以羊接觸傳染性膿皰皮炎DNA為樣本,經(jīng)722型紫外可見分光度計測定OD260nm值,計算出樣本DNA的含量。按10倍比稀釋樣本,分別以不同含量的羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測所建立方法的敏感性。

    1.2.6 臨床樣品的檢測

    用建立的PCR方法對收集的10份發(fā)病羊的血樣進(jìn)行檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR擴(kuò)增

    從圖1看出,用ORFV提取的病毒DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增出約540bp的特異性條帶,與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小相吻合;健康羊血樣DNA未擴(kuò)增出條帶。結(jié)果與預(yù)期一致,說明建立的該方法可用于羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的擴(kuò)增。

    圖1 ORFVB2L基因序列PCR擴(kuò)增

    注:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL600;1.空白對照;2.陰性對照(山羊痘病毒);3.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋 103倍);4-5.ORFV 病毒 DNA;6-7.健康羊血樣提取DNA后擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.2 PCR的特異性

    從圖2可知,采用PCR方法擴(kuò)增山羊痘病毒和健康羊血樣DNA提取物,除羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒擴(kuò)增出約540bp的條帶外,山羊痘病毒、健康羊血樣均為陰性。結(jié)果顯示,該方法具有良好的特異性,如病料中含山羊痘病毒不受影響。

    圖2 ORFV病毒B2L基因序列PCR特異性檢測

    注:M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL600;1-4.山羊痘病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;5.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋103倍);6-9.ORFV病毒 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物;10-13.健康羊血樣提取DNA后擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.3 PCR擴(kuò)增的敏感性

    按DNA的含量,依次進(jìn)行10倍比稀釋,PCR擴(kuò)增結(jié)果為5pg模板仍可見清晰目的條帶,說明有較好的敏感性,病毒含量極少的情況且下也可被檢出(圖 3)。

    圖3 ORFV病毒B2L基因序列PCR敏感性檢測

    注:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL600;1.空白對照;2.陰性對照(山羊痘病毒);3.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋 103倍);4-9. 為 ORFV 病毒 DNA50ng、5ng、0.5ng、50pg、5pg、0.5pg

    2.4 臨床樣品的檢測

    對收集的2個規(guī)模養(yǎng)羊場的10頭臨床發(fā)病山羊的血樣進(jìn)行檢測,9份PCR擴(kuò)增為ORFV陽性,1份擴(kuò)增為陰性,陽性檢出率為90%(9/10)(圖4),說明該方法在臨床上陽性檢出率高,適合于臨床診斷。

    圖4 ORFV病毒臨床樣品檢測

    注:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL600;1.空白對照;2.陰性對照(山羊痘病毒);3.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋103倍);4-13 10只發(fā)病羊血樣提取DNA擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物條帶

    3 小結(jié)與討論

    目前,羊接觸傳染性膿皰皮炎病在所有養(yǎng)羊的國家和地區(qū)均有發(fā)生,以澳大利亞、新西蘭等國最為嚴(yán)重。我國甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、西藏、四川和云南等省區(qū)廣泛流行,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。羊接觸傳染性膿皰皮炎臨床上分為唇型、蹄型和外陰型,以唇型感染為主,其特征為口唇等處皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。羊痘、羊口蹄疫的臨床癥狀與羊接觸傳染性膿皰皮炎極為相似,臨床上容易誤診。實(shí)驗(yàn)室檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎的方法較多,如電鏡觀察、病毒分離、接種試驗(yàn)、血清學(xué)、瓊脂免疫擴(kuò)散法等[3-7]。目前,常用瓊脂免疫擴(kuò)散法診斷ORFV,但因ORFV是局部免疫發(fā)揮主要作用,感染羊血清中約需要3-6周的時間才可出現(xiàn)較高效價的抗體,故結(jié)果判定中常出現(xiàn)假陰性結(jié)果;副痘病毒具有典型的外觀特征,可用電子顯微鏡簡單直觀檢查,但電子顯微鏡價位較高,操作復(fù)雜等缺點(diǎn),臨床應(yīng)用上受到限制;病毒分離培養(yǎng)主要用羊、犢牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),需要較高的要求和較長的時間,且在培養(yǎng)過程中也有可能出現(xiàn)因組織毒性作用使細(xì)胞受損而誤判為病毒分離性,因此也不宜進(jìn)行推廣。

    本研究采用PCR方法對羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒、健康羊血樣DNA提取物同時進(jìn)行擴(kuò)增,除羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒能擴(kuò)增出約540bp的條帶外,山羊痘病毒、健康羊血樣均為陰性,結(jié)果表明,該方法對檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒具有快速、準(zhǔn)確、特異和靈敏的特點(diǎn),是ORFV及時確診的可靠手段。

    針對目前國內(nèi)存在ORFV檢測方法不完善和檢測時間較長等缺點(diǎn),本研究針對ORFV的B2L基因是主要保守基因特點(diǎn),設(shè)計ORFV特異性引物,擴(kuò)增目的片段大小為540bp。本研究建立的PCR方法易于擴(kuò)增,試驗(yàn)條件要求不高,適合于一般的實(shí)驗(yàn)室,易于推廣。該方法對羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的檢測敏感性高,最小檢出量為5pg,且對模板的要求很低,只需對組織樣品進(jìn)行簡單處理便可使用,可對疑似病例做出快速診斷。本研究應(yīng)用建立的PCR方法對10份臨床樣品,陽性檢出率為90%。因此,本研究所建立的PCR方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好,可為ORFV確診提供保證。

    [1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

    [2]陳燕軍.羊口瘡的研究血清學(xué)方法的研究[J].獸醫(yī)科技雜志,1982(7):14-19.

    [3]白積榮,沈正達(dá),王錫貞,等.羊口瘡病毒形態(tài)發(fā)生的電鏡觀察[J].中國獸醫(yī)科技,1985(11):34-36.

    [4]王良娟,馬維卿,張?jiān)偾?應(yīng)用對流免疫電泳檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中羊口瘡病毒抗原[J].甘肅畜牧獸醫(yī),1992(3):7-8.

    [5]何水林,陳杰,蔡玉書,等.羊口瘡病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)科技,2002,3(9):21-23.

    [6]龐理化,程慶華,侯秀芬,等.羊口瘡病毒組織培養(yǎng)初報[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1982(3):66-69.

    [7]張素珍,張惠安,鄺明慧,等.羊口瘡病原的分離與鑒定的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1987(4):3-4.

    S858.26

    A

    1003-8655(2016)05-0024-03

    甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號:GNSW-2013-25)。

    常亮(1982-),甘肅靜寧人,本科,助理研究員,主要從事動物病毒性傳染病防治技術(shù)的研究工作。

    猜你喜歡
    痘病毒血樣膿皰
    中國生物武漢生物制品研究所成功分離猴痘病毒
    羊傳染性膿皰病的病原、流行特點(diǎn)、病理變化及防治
    楓葉
    鼠痘
    用水痘病毒開發(fā)新型HIV疫苗
    愛你(2019年21期)2019-06-21 02:31:38
    羊痘病毒分子特征及檢測方法研究進(jìn)展
    魚腥草外敷除膿皰
    特別健康(2017年9期)2017-03-14 03:25:43
    ·知識角·
    北方地區(qū)羔羊傳染性膿皰病的防治措施
    鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧站工作中血樣采集問題探究
    在线十欧美十亚洲十日本专区| 免费黄频网站在线观看国产| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美日韩乱码在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲五月色婷婷综合| 热99国产精品久久久久久7| 窝窝影院91人妻| 夫妻午夜视频| 99久久精品国产亚洲精品| 69av精品久久久久久| 久久久久精品人妻al黑| 无遮挡黄片免费观看| 婷婷成人精品国产| 激情在线观看视频在线高清 | 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 无限看片的www在线观看| 9色porny在线观看| 老司机福利观看| 国产麻豆69| 中亚洲国语对白在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品视频人人做人人爽| 99久久人妻综合| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 不卡av一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 怎么达到女性高潮| 久久人妻av系列| 亚洲国产中文字幕在线视频| 99久久国产精品久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 三级毛片av免费| bbb黄色大片| 青草久久国产| 视频在线观看一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产av一区二区精品久久| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲第一青青草原| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 91麻豆精品激情在线观看国产 | 一边摸一边做爽爽视频免费| av不卡在线播放| 超碰成人久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| av不卡在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久 成人 亚洲| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 精品国产乱码久久久久久男人| 久久中文看片网| 国产xxxxx性猛交| 在线观看免费视频网站a站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产视频一区二区在线看| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av成人一区二区三| 国产成人av激情在线播放| 国产人伦9x9x在线观看| 国产高清videossex| 久久影院123| www.熟女人妻精品国产| 欧美大码av| www.精华液| svipshipincom国产片| 欧美国产精品一级二级三级| 夫妻午夜视频| 国产男女内射视频| 精品久久蜜臀av无| 欧美成人免费av一区二区三区 | 正在播放国产对白刺激| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 无人区码免费观看不卡| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲人成电影免费在线| 视频区图区小说| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩福利视频一区二区| 人人妻人人澡人人看| av片东京热男人的天堂| 777米奇影视久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产片内射在线| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美大码av| 国产99久久九九免费精品| 精品高清国产在线一区| 国产1区2区3区精品| 丝袜美足系列| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品国产高清国产av | 99国产精品免费福利视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美一级毛片孕妇| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产成人av教育| 精品国产一区二区久久| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲欧美精品永久| 国产激情久久老熟女| 淫妇啪啪啪对白视频| 看片在线看免费视频| 国产在视频线精品| 国产精品99久久99久久久不卡| 成年版毛片免费区| 久热爱精品视频在线9| 老司机靠b影院| 精品久久久久久,| 1024香蕉在线观看| 大香蕉久久网| 黄色视频不卡| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人精品无人区| 一区二区三区精品91| 亚洲熟女精品中文字幕| 男人操女人黄网站| 99久久精品国产亚洲精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品国产乱子伦一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 一边摸一边抽搐一进一出视频| av免费在线观看网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| a级片在线免费高清观看视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品视频人人做人人爽| 亚洲久久久国产精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 色播在线永久视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 男人舔女人的私密视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 人妻 亚洲 视频| videosex国产| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲人成电影免费在线| 高清av免费在线| 看片在线看免费视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费少妇av软件| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产一卡二卡三卡精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 麻豆国产av国片精品| 色尼玛亚洲综合影院| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 看黄色毛片网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 18禁观看日本| 丁香欧美五月| 精品乱码久久久久久99久播| 黄频高清免费视频| 黄片小视频在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美精品亚洲一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 精品国产乱子伦一区二区三区| av电影中文网址| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品一区二区三卡| 亚洲人成77777在线视频| 国产色视频综合| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 岛国在线观看网站| 午夜影院日韩av| 在线天堂中文资源库| a在线观看视频网站| 成人影院久久| 欧美性长视频在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产精品sss在线观看 | 午夜激情av网站| 免费在线观看影片大全网站| 国产一区在线观看成人免费| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 多毛熟女@视频| 欧美性长视频在线观看| 中文字幕制服av| 午夜福利欧美成人| 久久香蕉国产精品| 久久性视频一级片| 亚洲欧美激情综合另类| 真人做人爱边吃奶动态| 美女视频免费永久观看网站| 国产欧美日韩一区二区三| 51午夜福利影视在线观看| 麻豆国产av国片精品| www.熟女人妻精品国产| 欧美国产精品va在线观看不卡| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲国产看品久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 制服人妻中文乱码| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜视频精品福利| 久久中文看片网| 亚洲五月天丁香| 777米奇影视久久| 国产99久久九九免费精品| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久国产欧美日韩av| 色94色欧美一区二区| 国产精品成人在线| 午夜成年电影在线免费观看| 久久热在线av| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜福利免费观看在线| 男人操女人黄网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| av线在线观看网站| 亚洲精品美女久久av网站| 男女免费视频国产| 一区在线观看完整版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久精品区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜91福利影院| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲视频免费观看视频| 国产成人精品无人区| 婷婷丁香在线五月| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产不卡一卡二| 日韩欧美三级三区| 最新的欧美精品一区二区| 黄色丝袜av网址大全| 热99国产精品久久久久久7| 丝袜在线中文字幕| 在线免费观看的www视频| 亚洲人成电影免费在线| 一级毛片女人18水好多| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品免费一区二区三区在线 | 极品人妻少妇av视频| 中文字幕av电影在线播放| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品国产一区二区久久| xxxhd国产人妻xxx| 999精品在线视频| 亚洲视频免费观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品永久免费网站| 久久香蕉精品热| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产国语露脸激情在线看| 9色porny在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | www.999成人在线观看| 亚洲人成电影观看| 国产男女内射视频| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 大香蕉久久网| 操出白浆在线播放| 成人影院久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 一a级毛片在线观看| а√天堂www在线а√下载 | 18禁观看日本| 99国产精品免费福利视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产成人av激情在线播放| 超碰97精品在线观看| 捣出白浆h1v1| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美大码av| 一级a爱视频在线免费观看| 久热这里只有精品99| 久久久久久久久久久久大奶| 精品无人区乱码1区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 精品少妇久久久久久888优播| 热re99久久精品国产66热6| 另类亚洲欧美激情| 中文字幕人妻丝袜制服| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲av成人一区二区三| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品美女久久av网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 韩国av一区二区三区四区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 91精品国产国语对白视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产精品 国内视频| 国产精品 欧美亚洲| 一二三四在线观看免费中文在| 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一二三四在线观看免费中文在| 国产主播在线观看一区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产片内射在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲精品自拍成人| 欧美中文综合在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 大型av网站在线播放| 国产av又大| 久久 成人 亚洲| 成年动漫av网址| 欧美日韩成人在线一区二区| 9191精品国产免费久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久久久久久精品吃奶| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产av又大| 精品高清国产在线一区| 91字幕亚洲| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 日本欧美视频一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黑人欧美特级aaaaaa片| 热re99久久精品国产66热6| 日韩三级视频一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 老司机亚洲免费影院| 午夜福利一区二区在线看| 超色免费av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 777米奇影视久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产成人精品在线电影| 老司机福利观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 大陆偷拍与自拍| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 怎么达到女性高潮| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲中文av在线| 大码成人一级视频| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲熟妇熟女久久| 国产麻豆69| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲av成人av| 女人精品久久久久毛片| av免费在线观看网站| 日韩三级视频一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男女之事视频高清在线观看| www.精华液| 自线自在国产av| 交换朋友夫妻互换小说| 精品少妇久久久久久888优播| 91成人精品电影| 老鸭窝网址在线观看| 国产激情欧美一区二区| 精品久久久久久,| 超色免费av| 又黄又粗又硬又大视频| 十八禁网站免费在线| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品电影一区二区三区 | 国产成人影院久久av| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 高清av免费在线| av线在线观看网站| a级毛片在线看网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产欧美亚洲国产| 国产亚洲欧美精品永久| ponron亚洲| 麻豆av在线久日| 看片在线看免费视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 男人的好看免费观看在线视频 | 日韩大码丰满熟妇| 亚洲av片天天在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 性少妇av在线| 在线观看66精品国产| 视频区欧美日本亚洲| 成人影院久久| 99久久人妻综合| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成年动漫av网址| 日韩有码中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| www.熟女人妻精品国产| 亚洲成人免费av在线播放| 99香蕉大伊视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 丝袜美腿诱惑在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品一品国产午夜福利视频| 日本一区二区免费在线视频| 色老头精品视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产高清videossex| 村上凉子中文字幕在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 免费日韩欧美在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜两性在线视频| 久久久久久久精品吃奶| 欧美乱码精品一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费在线观看日本一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久久久久免费视频了| 国产一区在线观看成人免费| 日韩有码中文字幕| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 9色porny在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品免费大片| 村上凉子中文字幕在线| 一区在线观看完整版| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产成人精品无人区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | svipshipincom国产片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品福利观看| 国产有黄有色有爽视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品人妻在线不人妻| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产97色在线日韩免费| 少妇粗大呻吟视频| 又大又爽又粗| 水蜜桃什么品种好| 欧美激情高清一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一进一出好大好爽视频| 亚洲综合色网址| 中文字幕制服av| 高清毛片免费观看视频网站 | 两个人看的免费小视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| e午夜精品久久久久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 宅男免费午夜| 亚洲综合色网址| 极品少妇高潮喷水抽搐| 99热国产这里只有精品6| 亚洲中文字幕日韩| 免费人成视频x8x8入口观看| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 99在线人妻在线中文字幕 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 高清在线国产一区| 久久狼人影院| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 大型黄色视频在线免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久精品91无色码中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜日韩欧美国产| av有码第一页| 国产精品电影一区二区三区 | 久久影院123| 国产淫语在线视频| 高清av免费在线| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一级a爱片免费观看的视频| 很黄的视频免费| 老熟女久久久| x7x7x7水蜜桃| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品国产一区二区久久| 精品人妻1区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲熟妇熟女久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 丰满的人妻完整版| 欧美中文综合在线视频| 久久亚洲精品不卡| 夫妻午夜视频| 午夜福利乱码中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| av视频免费观看在线观看| 在线播放国产精品三级| 国产免费av片在线观看野外av| 午夜成年电影在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品久久电影中文字幕 | 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | av欧美777| 少妇的丰满在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 首页视频小说图片口味搜索| 国产一区在线观看成人免费| 夫妻午夜视频| av视频免费观看在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 99热只有精品国产| 制服人妻中文乱码| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 午夜免费鲁丝| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 免费高清在线观看日韩| 国产精品电影一区二区三区 | 午夜日韩欧美国产| а√天堂www在线а√下载 | 欧美在线一区亚洲| 又紧又爽又黄一区二区| 波多野结衣一区麻豆| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| avwww免费| 久久人妻av系列| 捣出白浆h1v1| 亚洲av成人一区二区三| 精品国产乱码久久久久久男人| 9热在线视频观看99| 超色免费av| 免费在线观看影片大全网站| 黄色片一级片一级黄色片| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲成国产人片在线观看| 精品一区二区三卡| 黄色丝袜av网址大全| 日韩三级视频一区二区三区| netflix在线观看网站| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久成人av| 老鸭窝网址在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 麻豆国产av国片精品| 午夜免费成人在线视频| 视频区图区小说| 在线视频色国产色| 欧美国产精品一级二级三级| 十八禁网站免费在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91av网站免费观看| 九色亚洲精品在线播放| 成年人黄色毛片网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人欧美在线观看 | 国产精品免费大片| 亚洲男人天堂网一区| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲人成电影观看| 亚洲 国产 在线| 狂野欧美激情性xxxx| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产成人欧美|