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    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用

    2016-07-05 15:40:22郭海龍
    中獸醫(yī)學(xué)雜志 2016年5期
    關(guān)鍵詞:痘病毒血樣膿皰

    常 亮,黨 巖,郭海龍

    (甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?44000)

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用

    常 亮,黨 巖,郭海龍

    (甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?44000)

    以GenBank上羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒(ORFV)B2L基因序列,用Primer premier 5.0軟件設(shè)計1對引物并合成,經(jīng)PCR條件優(yōu)化,確定了最佳的PCR反應(yīng)條件,建立了羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR檢測方法。結(jié)果顯示,設(shè)計的引物能擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為540bp左右,與預(yù)期大小一致;同時檢測山羊痘病毒,結(jié)果均為陰性;該方法能檢出羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒最低量為5pg。經(jīng)證實(shí),建立起羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法具有良好的特異性和敏感性,可用于臨床病料檢測。

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒;PCR;特異性;靈敏度

    羊接觸傳染性膿皰皮炎,又稱羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿瘡、羊口瘡,是由羊傳染性膿皰病毒又稱羊口瘡病毒感染引起綿羊、山羊的接觸性、嗜上皮性傳染病[1],以口唇等處的皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂為特征,羊群的發(fā)病率高達(dá)90%,病死率1%-25%[2],給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。人、犢牛、駱駝等也可感染本病。目前本病診斷有電子顯微鏡檢查、病毒分離、接種試驗(yàn)和AGP等方法[3-7]。由于本病與羊感染口蹄疫病毒、羊痘病毒臨床癥狀相似,特別在繼發(fā)感染或混合感染難以區(qū)分,這就為本病的確診增加了難度。為了準(zhǔn)確、快速檢測本病,本研究建立了羊傳染性膿皰皮炎病毒PCR方法,經(jīng)初步應(yīng)用取得良好的檢測效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒株及臨床樣品

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒毒株,由本實(shí)驗(yàn)室保存;臨床血樣采集甘肅省平?jīng)鍪小c陽市和張掖市肅南裕固族自治縣等地羊只,低溫保存。

    1.1.2 試劑盒及試劑

    Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計與合成

    根據(jù)GenBank中ORFV的全基因序列中較保守的B2L基因序列,設(shè)計引物1對,預(yù)計擴(kuò)增目的片段大小為 540bp。上游引物為 P1:5’-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3’, 下游引物 P2:5’-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3’,預(yù)計產(chǎn)物大小為540bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供。

    1.2.2 病毒DNA的提取

    羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒細(xì)胞毒DNA提取:取500μL細(xì)胞毒液于離心管中,煮沸10min,冰水水浴3min,10000r/min離心10min,取上清做模板。

    臨床樣品血樣DNA提?。喝⊙獦?00μL至2.0mL離心管中,依次加入00μL滅菌雙蒸水、400μL6mol/L的碘化鈉、800μL氯仿-異戊醇(24:1),顛倒混勻,14000r/min 離心 10min;吸上層水相500μL于另一離心管中,加入300μL異丙醇,80μL3mol/L醋酸鈉,混勻后 -20℃靜置10min,14000r/min離心 10min;棄上清,加 70%乙醇 1mL,混勻,14000r/min離心 5min,棄去乙醇,晾干,加20μL滅菌雙蒸水4℃保存。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增

    25μL 反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 混 合 物 (各 2.5mmol/L)3μL、Taq DNA 聚合酶 (2.5U/μL)0.2μL、上引物 P1、P2(10pmol/μL)各 1.0μL、DNA 模板 2.5μL、滅菌雙蒸水(ddH2O)加至 25μL。

    經(jīng)優(yōu)化后PCR條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性 30s,56℃退火 30s,72℃延伸 30s,32個循環(huán),最后72℃延伸10min。

    取擴(kuò)增產(chǎn)物8μL與溴酚藍(lán)緩沖液2μL混勻,加樣于2%瓊脂糖凝膠中,電泳后,觀察結(jié)果。

    1.2.4 PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)

    用建立的PCR方法分別檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒和健康羊血樣。

    1.2.5 PCR擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)

    以羊接觸傳染性膿皰皮炎DNA為樣本,經(jīng)722型紫外可見分光度計測定OD260nm值,計算出樣本DNA的含量。按10倍比稀釋樣本,分別以不同含量的羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測所建立方法的敏感性。

    1.2.6 臨床樣品的檢測

    用建立的PCR方法對收集的10份發(fā)病羊的血樣進(jìn)行檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR擴(kuò)增

    從圖1看出,用ORFV提取的病毒DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增出約540bp的特異性條帶,與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小相吻合;健康羊血樣DNA未擴(kuò)增出條帶。結(jié)果與預(yù)期一致,說明建立的該方法可用于羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的擴(kuò)增。

    圖1 ORFVB2L基因序列PCR擴(kuò)增

    注:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL600;1.空白對照;2.陰性對照(山羊痘病毒);3.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋 103倍);4-5.ORFV 病毒 DNA;6-7.健康羊血樣提取DNA后擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.2 PCR的特異性

    從圖2可知,采用PCR方法擴(kuò)增山羊痘病毒和健康羊血樣DNA提取物,除羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒擴(kuò)增出約540bp的條帶外,山羊痘病毒、健康羊血樣均為陰性。結(jié)果顯示,該方法具有良好的特異性,如病料中含山羊痘病毒不受影響。

    圖2 ORFV病毒B2L基因序列PCR特異性檢測

    注:M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL600;1-4.山羊痘病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;5.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋103倍);6-9.ORFV病毒 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物;10-13.健康羊血樣提取DNA后擴(kuò)增產(chǎn)物

    2.3 PCR擴(kuò)增的敏感性

    按DNA的含量,依次進(jìn)行10倍比稀釋,PCR擴(kuò)增結(jié)果為5pg模板仍可見清晰目的條帶,說明有較好的敏感性,病毒含量極少的情況且下也可被檢出(圖 3)。

    圖3 ORFV病毒B2L基因序列PCR敏感性檢測

    注:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL600;1.空白對照;2.陰性對照(山羊痘病毒);3.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋 103倍);4-9. 為 ORFV 病毒 DNA50ng、5ng、0.5ng、50pg、5pg、0.5pg

    2.4 臨床樣品的檢測

    對收集的2個規(guī)模養(yǎng)羊場的10頭臨床發(fā)病山羊的血樣進(jìn)行檢測,9份PCR擴(kuò)增為ORFV陽性,1份擴(kuò)增為陰性,陽性檢出率為90%(9/10)(圖4),說明該方法在臨床上陽性檢出率高,適合于臨床診斷。

    圖4 ORFV病毒臨床樣品檢測

    注:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL600;1.空白對照;2.陰性對照(山羊痘病毒);3.陽性對照(ORFV病毒煮沸稀釋103倍);4-13 10只發(fā)病羊血樣提取DNA擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物條帶

    3 小結(jié)與討論

    目前,羊接觸傳染性膿皰皮炎病在所有養(yǎng)羊的國家和地區(qū)均有發(fā)生,以澳大利亞、新西蘭等國最為嚴(yán)重。我國甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、西藏、四川和云南等省區(qū)廣泛流行,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。羊接觸傳染性膿皰皮炎臨床上分為唇型、蹄型和外陰型,以唇型感染為主,其特征為口唇等處皮膚和粘膜形成丘疹、膿皰、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂。羊痘、羊口蹄疫的臨床癥狀與羊接觸傳染性膿皰皮炎極為相似,臨床上容易誤診。實(shí)驗(yàn)室檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎的方法較多,如電鏡觀察、病毒分離、接種試驗(yàn)、血清學(xué)、瓊脂免疫擴(kuò)散法等[3-7]。目前,常用瓊脂免疫擴(kuò)散法診斷ORFV,但因ORFV是局部免疫發(fā)揮主要作用,感染羊血清中約需要3-6周的時間才可出現(xiàn)較高效價的抗體,故結(jié)果判定中常出現(xiàn)假陰性結(jié)果;副痘病毒具有典型的外觀特征,可用電子顯微鏡簡單直觀檢查,但電子顯微鏡價位較高,操作復(fù)雜等缺點(diǎn),臨床應(yīng)用上受到限制;病毒分離培養(yǎng)主要用羊、犢牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),需要較高的要求和較長的時間,且在培養(yǎng)過程中也有可能出現(xiàn)因組織毒性作用使細(xì)胞受損而誤判為病毒分離性,因此也不宜進(jìn)行推廣。

    本研究采用PCR方法對羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒、山羊痘病毒、健康羊血樣DNA提取物同時進(jìn)行擴(kuò)增,除羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒能擴(kuò)增出約540bp的條帶外,山羊痘病毒、健康羊血樣均為陰性,結(jié)果表明,該方法對檢測羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒具有快速、準(zhǔn)確、特異和靈敏的特點(diǎn),是ORFV及時確診的可靠手段。

    針對目前國內(nèi)存在ORFV檢測方法不完善和檢測時間較長等缺點(diǎn),本研究針對ORFV的B2L基因是主要保守基因特點(diǎn),設(shè)計ORFV特異性引物,擴(kuò)增目的片段大小為540bp。本研究建立的PCR方法易于擴(kuò)增,試驗(yàn)條件要求不高,適合于一般的實(shí)驗(yàn)室,易于推廣。該方法對羊接觸傳染性膿皰皮炎病毒的檢測敏感性高,最小檢出量為5pg,且對模板的要求很低,只需對組織樣品進(jìn)行簡單處理便可使用,可對疑似病例做出快速診斷。本研究應(yīng)用建立的PCR方法對10份臨床樣品,陽性檢出率為90%。因此,本研究所建立的PCR方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好,可為ORFV確診提供保證。

    [1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

    [2]陳燕軍.羊口瘡的研究血清學(xué)方法的研究[J].獸醫(yī)科技雜志,1982(7):14-19.

    [3]白積榮,沈正達(dá),王錫貞,等.羊口瘡病毒形態(tài)發(fā)生的電鏡觀察[J].中國獸醫(yī)科技,1985(11):34-36.

    [4]王良娟,馬維卿,張?jiān)偾?應(yīng)用對流免疫電泳檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中羊口瘡病毒抗原[J].甘肅畜牧獸醫(yī),1992(3):7-8.

    [5]何水林,陳杰,蔡玉書,等.羊口瘡病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)科技,2002,3(9):21-23.

    [6]龐理化,程慶華,侯秀芬,等.羊口瘡病毒組織培養(yǎng)初報[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1982(3):66-69.

    [7]張素珍,張惠安,鄺明慧,等.羊口瘡病原的分離與鑒定的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1987(4):3-4.

    S858.26

    A

    1003-8655(2016)05-0024-03

    甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號:GNSW-2013-25)。

    常亮(1982-),甘肅靜寧人,本科,助理研究員,主要從事動物病毒性傳染病防治技術(shù)的研究工作。

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