水質(zhì)中葉綠素a檢測(cè)方法的改進(jìn)和探討

李　征，胡新躍.北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局，北京　0007 .北京市朝陽(yáng)區(qū)環(huán)境保護(hù)局，北京　005

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水質(zhì)中葉綠素a檢測(cè)方法的改進(jìn)和探討

李征1，胡新躍2
1.北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局，北京100071 2.北京市朝陽(yáng)區(qū)環(huán)境保護(hù)局，北京100125

摘要葉綠素a是地表水監(jiān)測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目，是水體初級(jí)生產(chǎn)力的重要指標(biāo)。目前實(shí)驗(yàn)室主要采用國(guó)家環(huán)?？偛俊董h(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（第四冊(cè)）中規(guī)定的分光光度法測(cè)定葉綠素a，在大量的實(shí)際研究工作中發(fā)現(xiàn)，分光光度法測(cè)量葉綠素a存在一定的缺陷。缺陷主要表現(xiàn)在葉綠素的提取過(guò)程中，為此我們將對(duì)原有方法進(jìn)行改進(jìn)。本文通過(guò)對(duì)規(guī)范方法與改進(jìn)的浸提方法和超聲法等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì)，找出穩(wěn)定性好，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單同時(shí)又能減少丙酮對(duì)操作者毒害作用的方法。

關(guān)鍵詞葉綠素a的提??；監(jiān)測(cè)方法；方法比較與改進(jìn)

目前，通過(guò)生物學(xué)指標(biāo)監(jiān)控河湖污染情況漸成趨勢(shì)，其中浮游植物是一項(xiàng)重要的研究對(duì)象。由于葉綠體是浮游植物的重要功能器官，其功能的強(qiáng)弱及其時(shí)空的動(dòng)態(tài)變化，是通過(guò)葉綠素的光合作用實(shí)現(xiàn)的。因此，目前對(duì)葉綠素a的監(jiān)測(cè)是了解水質(zhì)污染狀況及其動(dòng)態(tài)特征的有效方法。

按照北京市環(huán)境保護(hù)局的要求，自2007年起筆者就開(kāi)始對(duì)朝陽(yáng)區(qū)轄區(qū)內(nèi)的湖泊（主要包括朝陽(yáng)公園的水碓湖、紅領(lǐng)巾公園湖和奧林匹克公園湖）進(jìn)行葉綠素a的測(cè)定，以評(píng)價(jià)這些湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化程度。2012年帶領(lǐng)豐臺(tái)監(jiān)測(cè)站取得了葉綠素a檢測(cè)的資質(zhì)，檢測(cè)過(guò)程中積累了一些經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)在監(jiān)測(cè)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了許多問(wèn)題。為了提高葉綠素a監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性，簡(jiǎn)化檢測(cè)操作程序，保證檢測(cè)人員身體健康，我們對(duì)現(xiàn)有的監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行了嘗試性地改進(jìn)。

1　現(xiàn)階段葉綠素a檢測(cè)情況概述

目前，測(cè)定葉綠素a沒(méi)有國(guó)標(biāo)方法?，F(xiàn)在環(huán)保系統(tǒng)采用的葉綠素a監(jiān)測(cè)方法主要依據(jù)是《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版）》中的水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定的分光光度法。該方法測(cè)定葉綠素a的基本原理是：通過(guò)抽濾的方法將附著在濾膜上的藻類，溶解在90%的丙酮溶劑中，以反復(fù)研磨和離心的方法提取葉綠素a。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能充分將藻類植物的細(xì)胞壁破碎，對(duì)葉綠素的提取速度較快。

在實(shí)際檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，該方法的主要缺點(diǎn)在于研磨過(guò)程中葉綠素a容易發(fā)生光降解，同時(shí)因?yàn)榉磸?fù)轉(zhuǎn)移操作及易產(chǎn)生損失，使結(jié)果偏低、誤差較大，此外研磨過(guò)程中操作人員與丙酮接觸時(shí)間長(zhǎng)，不利于操作人員的健康。

為此我們主要從溶劑、提取方式、溫度和時(shí)間控制等方面對(duì)原有方法進(jìn)行改進(jìn)。本文通過(guò)對(duì)規(guī)范方法與改進(jìn)的浸提方法和超聲法等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì)，找出穩(wěn)定性好，結(jié)果準(zhǔn)確，操作最為簡(jiǎn)單的方法。

2　分光光度法測(cè)葉綠素a步驟及問(wèn)題

2.1實(shí)驗(yàn)材料

地表水水樣（每次量取100ml）。

儀器設(shè)備：722S分光光度計(jì)、真空泵、玻璃抽濾器、TDZ5-W5多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)、孔徑0.45μm乙酸纖維濾膜、電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、無(wú)水碳酸鎂粉末、90%丙酮。

2.2常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作方法

1）水樣抽濾：在抽濾器上裝好0.45μm的乙酸纖維濾膜。倒入100ml的水樣進(jìn)行抽濾，水樣抽完后，繼續(xù)抽1min～2min，以減少濾膜上的水分。

2）樣品提?。簩в懈∮沃参锏臑V膜取出放在冰箱內(nèi)低溫干燥6h～8h后放入組織研磨器中，加入少量無(wú)水碳酸鎂粉末及2m1～3m1的90%的丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。用離心機(jī)在3 000r轉(zhuǎn)速下離心lOmin。將上清液倒入lOml容量瓶中。之后將剩余固形物倒入組織研磨器中，用2m1～3ml的90%的丙酮，繼續(xù)研磨提取，離心lOmin，并將上清液再轉(zhuǎn)入容量瓶中。重復(fù)1～2次，用90%的丙酮定容為lOml，搖勻。

3）測(cè)定：用1cm光程的比色皿，分別讀取750nm，663nm，645nm，630nm波長(zhǎng)的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測(cè)定，對(duì)樣品吸光度進(jìn)行校正［1］。

2.3葉綠素a監(jiān)測(cè)方法目前存在的問(wèn)題

1）操作誤差：由于操作過(guò)程中反復(fù)轉(zhuǎn)移樣品，樣品比較粘稠，容易產(chǎn)生較大的人為操作誤差。同時(shí)由于葉綠素a對(duì)光照及溫度敏感，在研磨過(guò)程中摩擦生熱也會(huì)造成一定的葉綠素?fù)p失。

2）安全性。由于丙酮揮發(fā)性大，有神經(jīng)毒性，對(duì)操作人員身體健康有損害。組織研磨器是玻璃制品，在操作過(guò)程中易發(fā)生破碎，有安全隱患。

3　葉綠素a不同改進(jìn)方法的比較

3.1反復(fù)凍融-浸提法

抽濾步驟和比色步驟與規(guī)范法相同，將研磨步驟改為將過(guò)濾水樣后的濾膜裝進(jìn)黑色塑料袋，于-20℃冰箱和室溫下反復(fù)凍融3～5次，再放進(jìn)盛有10ml丙酮（90%）的離心管中振搖1min后，于4℃冰箱浸提20h，浸提過(guò)程需振搖1～2次［2］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 研磨法與反復(fù)凍融-浸提法對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以看出，采用反復(fù)凍融-浸提法所得的葉綠素a平均值明顯高于研磨法，兩者之間存在明顯差異。且研磨法平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，主要是受人為因素影響，浸提法減少了研磨和轉(zhuǎn)移過(guò)程中葉綠素a的損耗，人為誤差小，穩(wěn)定性好。

3.2超聲波提取方法

抽濾步驟和比色步驟與規(guī)范法相同，將研磨步驟改為直接將加了碳酸鎂粉末的濾膜碎片置于離心管中，加入90%丙酮，將離心管用黑色塑料袋包裹后超聲破碎10min，振蕩器振搖（300r/min）萃取1h，離心機(jī)（10 000r/min）離心10min，之后將上清液轉(zhuǎn)入10ml棕色容量瓶中，用90%丙酮定容至10ml，搖勻待測(cè)［3］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　超聲法與研磨法提取結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的研磨法相比較，超聲法測(cè)定葉綠素a的提取效率優(yōu)于研磨法。

3.3乙醇替代提取液法

由于丙酮具有神經(jīng)毒性，對(duì)操作人員的身體健康有毒害作用，因此，在操作過(guò)程中嘗試用安全的乙醇替代丙酮進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)方法是將抽濾后的干燥濾膜在乙醇溶液中浸泡過(guò)夜，在進(jìn)行研磨提取和離心提取部分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　乙醇替代提取液丙酮法對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表3中可以看出，在浸泡提取一天之后，乙醇的提取能力接近丙酮的提取效果，可以考慮乙醇替代丙酮溶劑，增加浸泡提取時(shí)間。

4　結(jié)論

1）通過(guò)上面實(shí)驗(yàn)比較可以看出，規(guī)范操作法由于研磨過(guò)程中樣品容易損失導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行改進(jìn)。

2）超聲法測(cè)定葉綠素a的提取效率優(yōu)于丙酮—研磨法，且操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間，效率高，重復(fù)性好，有可比性，安全性優(yōu)，保障健康，能減少系統(tǒng)操作誤差。

3）反復(fù)凍融-浸提法在操作更為簡(jiǎn)單，提取效率主要通過(guò)反復(fù)凍融對(duì)胞壁的破壞和浸提時(shí)間的延長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該方法大大減少了操作者與丙酮的接觸時(shí)間，降低了丙酮的毒害作用，同時(shí)具有較好的穩(wěn)定性。

4）用乙醇替代丙酮溶液，雖然提取效果比丙酮溶劑略遜，但是可以通過(guò)增加浸提時(shí)間來(lái)減少差距，總體來(lái)講乙醇具備替代丙酮作為提取溶劑的條件，但要在方法上做更多改進(jìn)來(lái)提高乙醇的提取效率。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號(hào)X3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1674-6708（2016）165-0217-02

作者簡(jiǎn)介：李征，北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境保護(hù)局。胡新躍，北京市朝陽(yáng)區(qū)環(huán)境保護(hù)局。