D-甘露糖修飾聚合物膠束的制備及其在靶向藥物輸送中的應(yīng)用

汪舒婷，張權(quán),3，葉舟，熊永權(quán)，崔晨宇，尹健,3

1 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 2141222 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 2141223 江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122

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D-甘露糖修飾聚合物膠束的制備及其在靶向藥物輸送中的應(yīng)用

汪舒婷1,2，張權(quán)1,2,3，葉舟1,2，熊永權(quán)1,2，崔晨宇1,2，尹健1,2,3

1 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122
2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122
3 江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122

汪舒婷, 張權(quán), 葉舟, 等. D-甘露糖修飾聚合物膠束的制備及其在靶向藥物輸送中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(1): 84–94.

Wang ST, Zhang Q, Ye Z, et al. D-mannose-conjugated polymeric micelles for targeted drug delivery. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 84–94.

摘 要:聚合物膠束作為藥物載體具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，提高疏水性藥物溶解性等優(yōu)勢，是一類很有應(yīng)用潛力的藥物傳輸系統(tǒng)。本研究以合成的共價鍵連D-甘露糖的雙親性聚合物分子 (PGMA-Mannose) 為藥物載體，包載抗癌藥物阿霉素 (DOX) 制備具有甘露糖受體靶向性和pH敏感藥物釋放特性的新型載藥聚合物膠束。利用激光共聚焦顯微鏡和MTT細(xì)胞毒性評價方法對載藥膠束的細(xì)胞內(nèi)吞攝取和毒性進行評價。實驗結(jié)果表明，載藥膠束能特異性識別人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231表面過度表達的甘露糖受體，被癌細(xì)胞大量攝取并在細(xì)胞溶酶體酸性環(huán)境內(nèi)釋放藥物，而載藥膠束在表面甘露糖受體低表達的HEK293細(xì)胞中只有少量攝取。與原藥DOX相比，該載藥膠束對癌細(xì)胞的毒性顯著提高，而對正常細(xì)胞的毒性較低。因此，該PGMA-Mannose聚合物膠束有望成為一種新型的靶向藥物輸送系統(tǒng)應(yīng)用于癌癥的治療。

關(guān)鍵詞:D-甘露糖，聚合物膠束，靶向藥物輸送，受體介導(dǎo)的胞吞，細(xì)胞毒性

Received: February 5, 2015; Accepted: April 3, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 51403081), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20140137).

Jian Yin. Tel: +86-510-85328229; E-mail: jianyin@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 51403081)，江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK20140137) 資助。

化療是目前治療癌癥最有效的方法之一。然而化療的效果往往不夠理想，主要原因在于化療給藥的靶向性差，毒副作用嚴(yán)重，而且長期使用容易產(chǎn)生耐藥性[1-3]。藥物載體是實現(xiàn)抗癌藥物靶向輸送治療癌癥的關(guān)鍵。近年來，許多載體材料如脂質(zhì)體[4]、聚合物膠束[5-6]、樹枝狀大分子[7]和有機無機雜化復(fù)合納米粒子[8-9]等已經(jīng)被廣泛研究用作抗癌藥物的靶向輸送載體。

聚合物膠束由雙親性聚合物在水中自組裝形成[10]，其內(nèi)核可包載疏水性藥物，增加藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長藥物的循環(huán)時間。同時，聚合物膠束具有適宜的粒徑，可通過增強滲透與滯留 (EPR) 效應(yīng)被動靶向到腫瘤部位以減少抗癌藥對正常細(xì)胞的不良反應(yīng)[11]。但EPR效應(yīng)不能實現(xiàn)載藥膠束對癌細(xì)胞生長的選擇性抑制作用，故為了進一步增強納米載體對癌細(xì)胞的靶向性，通常在載體表面修飾靶向分子，如抗體[12]、多肽[13]、葉酸[14]等，這些功能性靶向分子能特異性識別癌細(xì)胞表面過度表達的受體，使載體能夠通過受體識別方式被癌細(xì)胞攝取，從而實現(xiàn)載體對癌細(xì)胞的選擇性藥物輸送的目的，同時降低抗癌藥物的毒副作用。

甘露糖受體屬于多凝集素受體，可通過胞外區(qū)識別和結(jié)合以甘露糖、巖藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖為末端的糖類分子。近年來，已經(jīng)證明將甘露糖分子修飾到藥物載體表面能夠識別癌細(xì)胞表面過度表達的甘露糖受體從而實現(xiàn)靶向藥物輸送[15-16]，但以甘露糖修飾聚合物膠束實現(xiàn)癌細(xì)胞的靶向藥物輸送同時降低抗癌藥物對正常細(xì)胞毒副作用的研究尚未見報道。本文以合成的共價鍵連D-甘露糖的雙親性聚合物分子 (PGMA-Mannose) 為藥物載體，包載抗癌藥物阿霉素制備具有甘露糖受體靶向性的載藥聚合物膠束，考察其理化性質(zhì)和體外藥物釋放性能。以甘露糖受體表達豐富的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和甘露糖受體低表達的人腎上皮細(xì)胞HEK293為細(xì)胞模型，研究載藥膠束通過甘露糖受體識別作用被MDA-MB-231癌細(xì)胞攝取的靶向藥物輸送性能。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

甲基丙烯酸縮水甘油酯 (GMA，97%)、磷鎢酸水合物、2,2’-聯(lián)吡啶 (Bpy，99%)、芘(98%)、(+)-L-抗壞血酸鈉 (99%)、五水硫酸銅(98%)、2-溴丙酸甲酯 (MBrP，99%) 購自百靈威科技有限公司；D-甘露糖 (D-Mannose，分析純) 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，溴化亞銅(CuBr，99%) 購自阿拉丁試劑公司；鹽酸阿霉素 (DOX·HCl，99%) 購自北京華奉聯(lián)博科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

核磁共振氫譜 (1HNMR) 由德國Bruker公司AVANCE 400M型核磁共振儀測定；聚合物相對分子量及分子量分布的表征用美國Waters公司生產(chǎn)的Waters1515凝膠滲透色譜 (GPC)系統(tǒng)進行，色譜純四氫呋喃 (THF) 為流動相；傅立葉變換紅外光譜采用美國Nicolet公司Nexus 470紅外光譜儀測定；納米粒徑尺寸分布由英國Malvern公司Nano ZS動態(tài)光散射儀(DLS) 測定，每個樣品平衡時間為1 min，測試3次，實驗數(shù)據(jù)通過軟件Dispersion Technology Software version 6.20處理；臨界膠束濃度(CMC) 采用芘熒光法測定，所用熒光光譜儀為日本日立公司F-7 000。膠束形貌由日本電子株式會社JEM-2 100透射電子顯微鏡 (TEM) 測定，應(yīng)用磷鎢酸負(fù)染法進行觀察，加速電壓200 kV；載藥膠束的細(xì)胞攝取通過尼康激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 拍攝。

1.2炔丙基-α-D-吡喃甘露糖的合成

炔丙基-α-D-吡喃甘露糖的合成方法參照文獻[17]。

1.3PGMA-Mannose的合成

準(zhǔn)確稱取1.5 g的GMA，用2.5 mL 二甲基亞砜 (DMSO) 溶解在50 mL燒瓶中。在氬氣保護條件下，先后加入64.4 mg CuBr和189.7 mg Bpy。最后用微量進樣器加入81 μL MBrP引發(fā)劑，密封氬氣保護，40 ℃反應(yīng)2 h。用10 mL THF終止反應(yīng)。通過中性氧化鋁柱除去銅配體，將濾液濃縮后，在甲醇中沉淀，干燥所得沉淀物為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯 (PGMA)。

將100.0 mg的PGMA，68.5 mg疊氮鈉，56.0 mg氯化銨和7 mL N,N’-二甲基甲酰胺(DMF) 加入50 mL燒瓶中，密封，50 ℃油浴反應(yīng)12 h，過濾除去固體雜質(zhì)，將濾液濃縮后，在水中沉淀，干燥沉淀物得到疊氮基取代的PGMA (PGMA-N3)。

將60.0 mg PGMA-N3溶于15 mL DMF中，加到50 mL燒瓶中，通氬氣15 min去除體系內(nèi)氧氣。另將125.2 mg炔丙基-α-D-吡喃甘露糖和90.5 mg硫酸銅溶于5 mL蒸餾水中，在氬氣保護條件下，加入248.1 mg抗壞血酸鈉。將上面DMF和水溶液混合，密封，在油浴60 ℃反應(yīng)24 h，過濾除去不溶物后透析 (MW2 000)，冷凍干燥透析袋內(nèi)溶液得到PGMA-Mannose。

1.4負(fù)載抗癌藥物阿霉素

采用透析法制備載藥聚合物膠束。將10.0 mg PGMA-Mannose溶于2 mL DMSO中，靜置過夜后經(jīng)0.45 μm有機膜過濾備用。取50.0 mg鹽酸阿霉素溶于10 mL水中，按摩爾比1∶3加入三乙胺，避光室溫攪拌4 h，用20 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得脫鹽后的DOX。取一定量PGMA-Mannose的DMSO溶液及脫鹽后的DOX，兩者混合后，在劇烈攪拌條件下以一定速度滴加10 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH 7.4) 2 mL。隨后將其移至透析袋中，在同樣的PBS體系中透析1 d，濃縮后得到載藥膠束溶液 (DOX@PGMAMannose)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)

將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人腎上皮細(xì)胞HEK293用于載藥膠束的細(xì)胞評價。在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換新鮮培養(yǎng)液，待長至匯合后，用0.25%胰酶消化，含血清的培養(yǎng)液終止消化，并制備細(xì)胞懸液[18]。

1.6載藥膠束的細(xì)胞內(nèi)吞

選取對數(shù)期生長的兩種細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置培養(yǎng)箱孵育24 h使其貼壁。加入含有DOX@PGMA-Mannose (40 μg/mL) 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)一定的時間。棄去培養(yǎng)液，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 清洗2次。將細(xì)胞用4.0%甲醛在室溫下固定15 min。PBS清洗2次后，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI，1 μg/mL) 染[19]細(xì)胞核15 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察載藥膠束在細(xì)胞內(nèi)部的分布狀態(tài)，激發(fā)波長為405/561，發(fā)射波長為417?477/570?1 000。

1.7細(xì)胞毒性評價

采用MTT法考察載藥膠束的細(xì)胞毒性[20]。將MDA-MB-231或HEK293的細(xì)胞懸液種植于96孔板中，每孔10 000個細(xì)胞。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用pH 7.4的PBS清洗2次，加入含載藥膠束DOX@PGMA-Mannose或原藥DOX的培養(yǎng)基，使體系中所含的DOX的質(zhì)量濃度為2 μg/mL。培養(yǎng)一定的時間后，用pH 7.4的PBS清洗2次，每孔加入100 μL MTT溶液 (1 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀在490 nm處測量各孔的吸光值 (OD)，計算細(xì)胞存活率。

2　結(jié)果與分析

2.1PGMA-Mannose的合成

PGMA-Mannose的合成路線如圖1所示。首先以MBrP作為原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)劑，引發(fā)單體GMA聚合制得PGMA[21]。聚合物PGMA的平均分子量可根據(jù)1HNMR (圖2A) 中聚合物的重復(fù)單元和引發(fā)劑上氫原子的積分面積估算得到Mn(1HNMR)=6 030。而通過GPC測定的聚合物相對分子量為9 175，分子量分散系數(shù)為1.37。接下來，PGMA中環(huán)氧基很容易經(jīng)過疊氮鈉開環(huán)反應(yīng)得到PGMA-N3。最后PGMA-N3與炔丙基-α-D-吡喃甘露糖能通過“click”反應(yīng)形成三氮唑環(huán)，從而制得PGMA-Mannose。圖2B為PGMA-Mannose的1HNMR，在δ=8.1 ppm處出現(xiàn)的特征峰為PGMA-N3與炔丙基-α-D-吡喃甘露糖進行“click”反應(yīng)之后所形成三氮唑環(huán)上氫原子的特征化學(xué)位移值，同時在δ為3.5?4.0 ppm之間出現(xiàn)甘露糖骨架上氫原子的化學(xué)位移峰。

圖1　PGMA-Mannose的合成路線圖Fig. 1 Synthesis route of the PGMA-Mannose.

圖2　聚合物的核磁共振氫譜圖Fig. 21HNMR spectra of the polymers. (A) PGMA. (B) PGMA-Mannose.

2.2合成聚合物的FT-IR分析

圖3A為PGMA的紅外光譜，其在1 720 cm–1處有較強的C=O伸縮振動峰。PGMA中環(huán)氧基在經(jīng)過疊氮鈉開環(huán)反應(yīng)后，在2 106 cm–1處出現(xiàn)了明顯的疊氮基團伸縮振動峰，證明了PGMA-N3的形成 (圖3B)。然后PGMA-N3在經(jīng)過“click”反應(yīng)后，2 106 cm–1處峰消失，同時在1 637 cm–1處出現(xiàn)了三氮唑環(huán)的特征吸收峰[22]，另外3 500 cm–1處羥基的伸縮振動峰增強，所有上面實驗結(jié)果證明了“click”反應(yīng)的發(fā)生和PGMA-Mannose的成功合成 (圖3C)。

圖3　聚合物的紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of the polymers. (A) PGMA. (B) PGMA-N3. (C) PGMA-Mannose.

2.3PGMA-Mannose的臨界膠束濃度 (CMC)測定

采用芘熒光探針法測定所合成聚合物PGMA-Mannose在水溶液中的臨界膠束濃度，設(shè)定激發(fā)波長334 nm，以373 nm和384 nm處熒光強度之比對PGMA-Mannose的濃度作圖[23]，結(jié)果見圖4。在PGMA-Mannose濃度很低時，溶液中不存在膠束，芘處于極性環(huán)境中，而隨著PGMA-Mannose濃度的增加，一直至超過臨界膠束濃度，芘通過增溶作用開始進入非極性環(huán)境中，其I373/I384的比值發(fā)生變化，通過測定I373/I384值與PGMA-Mannose濃度的對應(yīng)變化可以得出CMC的值，其值為3.2×10–3mmol/L。

圖4　PGMA-Mannose濃度對I373/I384比值的影響Fig. 4 The relationship of fluorescence intensity of I373/I384and the concentration of PGMA-Mannose.

2.4聚合物膠束在載藥前后的TEM與DLS表征

通過TEM磷鎢酸負(fù)染法觀察膠束的形貌以及DLS測定膠束的流體力學(xué)直徑，結(jié)果見圖5。圖5A顯示膠束分布均勻且呈球形?？瞻啄z束在負(fù)載DOX后平均粒徑增大 (圖5B)。取膠束適量，加蒸餾水稀釋后用激光粒徑分析儀測定膠束在載藥前后的流體力學(xué)直徑變化。結(jié)果顯示膠束在負(fù)載藥物后平均流體力學(xué)直徑從67.2 nm增大到213.4 nm。此外，載藥膠束在水溶液中的粒度分布較窄 (PDI=0.281) (圖5C和5D)。

2.5藥物釋放

精確稱取1 mg原藥置10 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，配成1 mg/mL的儲備液。再用蒸餾水稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列濃度溶液。采用熒光分光光度法測定，激發(fā)波長478 nm，掃描范圍550?610 nm。以熒光強度 (I) 與濃度 (c) 作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程I = 75 249c + 74.95，R2= 0.991。表明藥物濃度在0.02?0.10 mg/mL范圍內(nèi)與熒光強度線性關(guān)系良好。凍干后的載藥膠束，加入1 mL DMF破壞膠束后，根據(jù)上面方法測定，即可得到載入膠束疏水核心內(nèi)的藥物濃度，再根據(jù)聚合物質(zhì)量和投藥量計算得膠束的載藥量為4.8%，包封率為20.6%。載藥量和包封率的計算公式分別為：載藥量=W1/W0×100%；包封率= W1/W2×100%。其中W0是載藥膠束的總質(zhì)量；W1是實際包載進入膠束的藥物質(zhì)量；W2是投入藥物的總質(zhì)量。

圖5　空白膠束和載藥膠束的透射電鏡照片及在水溶液中的流體力學(xué)直徑分布圖Fig. 5 TEM images and hydrodynamic size distributions of the micelles. (A) PGMA-Mannose (TEM). (B) DOX@PGMA-Mannose (TEM). (C) PGMA-Mannose (DLS). (D) DOX@PGMA-Mannose (DLS).

取載藥膠束1 mL，轉(zhuǎn)移至透析袋中。分別將透析袋置于pH 7.4、pH 5.0及pH 3.5的緩沖液25 mL中，37 ℃、72 r/min下振蕩。分別于一定的時間取釋放介質(zhì)1 mL (同時補加同溫等量相應(yīng)的新鮮介質(zhì))，計算累積藥物釋放率。釋放實驗的整個操作過程嚴(yán)格避光，平行實驗3次，結(jié)果見圖6，可見在pH 7.4介質(zhì)中藥物釋放平緩，48 h累積釋放率接近19.2%；在pH 5.0介質(zhì)中藥物釋放較快，48 h累積釋放率可達52.0%；當(dāng)介質(zhì)的pH值降至3.5時，藥物快速釋放，8 h時累積釋放率接近50%，48 h累積釋放率達到89.6%。

圖6　在37 ℃不同pH條件下載藥膠束的藥物釋放曲線Fig. 6 Drug release curves of the DOX-loading micelles at 37 ℃ under different pH conditions (n=3).

為了考察載藥聚合物膠束具有pH敏感藥物釋放特性的原因，我們測試了空白膠束在不同pH值溶液中的流體力學(xué)直徑和表面電荷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在溶液pH 7.4時，膠束的平均流體力學(xué)直徑為66.2 nm，而在pH 3.5時膠束的平均直徑增大到78.4 nm。此外，隨著溶液pH值的降低，膠束zeta電位從–21.8 mV升高至–5.1 mV。這可能是因為在酸性pH值條件下，聚合物膠束結(jié)構(gòu)中的三氮唑環(huán)被質(zhì)子化，膠束內(nèi)部靜電排斥力增大，從而導(dǎo)致膠束流體力學(xué)直徑的增大。膠束膨脹會促進包載藥物擴散速率的增加，導(dǎo)致藥物的快速釋放。

2.6甘露糖受體調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)吞

利用激光共聚焦顯微鏡對載藥膠束的甘露糖受體介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用進行研究，其結(jié)果見圖7和圖8。載藥膠束DOX@PGMA-Mannose分別與兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，一種細(xì)胞選擇細(xì)胞表面甘露糖受體過度表達的MDA-MB-231癌細(xì)胞，另一種選擇細(xì)胞表面甘露糖受體低表達的HEK293正常細(xì)胞。細(xì)胞核經(jīng)過DAPI染色呈藍色，而由于DOX具有紅色熒光，所以載藥膠束呈紅色。由圖7可知，載藥膠束與細(xì)胞培養(yǎng)1 h后，與HEK293細(xì)胞相比，在MDA-MB-231癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的DOX紅色熒光。而載藥膠束與細(xì)胞培養(yǎng)10 h之后，從藍色與紅色熒光的疊加圖中可以看出在MDA-MB-231癌細(xì)胞內(nèi)，大量DOX已經(jīng)釋放并進入細(xì)胞核中。對于甘露糖受體低表達的HEK293細(xì)胞，由于載藥膠束被細(xì)胞攝取的量少，導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放量較低，結(jié)果見圖8。這些實驗結(jié)果證明了載藥膠束能特異性識別MDA-MB-231癌細(xì)胞表面的甘露糖受體，被癌細(xì)胞大量攝取內(nèi)吞進入細(xì)胞并釋放藥物，載藥膠束在HEK293正常細(xì)胞中則只有少量攝取。

圖7　載藥膠束 (40 μg/mL) 分別與MDA-MB-231細(xì)胞和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)1 h的激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 7 CLSM images of the cells incubated for 1 h with DOX@PGMA-Mannose (40 μg/mL) as indicated. (A) MDA-MB-231 cancer cells. (B) HEK293 normal cells.

2.7空白膠束和載藥膠束的細(xì)胞毒性評價

實驗采用MTT法考察空白膠束對細(xì)胞的毒性。從圖9可見，隨空白膠束濃度的增加，HEK293和MDA-MB-231的細(xì)胞存活率略有降低。但當(dāng)膠束的濃度達到500 μg/mL時，兩種細(xì)胞的存活率仍大于92%，表明空白膠束對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞都無毒性，具有較好的生物相容性。

圖8　載藥膠束 (40 μg/mL) 分別與MDA-MB-231細(xì)胞和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)10 h的激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 8 CLSM images of the cells incubated for 10 h with DOX@PGMA-Mannose (40 μg/mL) as indicated. (A) MDA-MB-231 cancer cells. (B) HEK293 normal cells.

圖10　載藥膠束 (40 μg/mL) 和原藥分別與兩種細(xì)胞培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞存活率Fig. 10 Viability of the cells incubated with DOX@PGMA-Mannose or free DOX at same DOX doses. Data represent±s (n=6). (A) MDA-MB-231 cancer cells. (B) HEK293 normal cells.

評價載藥聚合物膠束DOX@PGMAMannose對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性，實驗結(jié)果見圖10。由圖10A可知，將甘露糖受體過度表達的癌細(xì)胞MDA-MB-231分別與相同藥物劑量的原藥DOX或DOX@PGMA-Mannose共同孵育后，DOX@PGMA-Mannose對癌細(xì)胞的毒性大于DOX。這是由于DOX@PGMA-Mannose能通過甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用更易將藥物輸送進癌細(xì)胞內(nèi)，因此導(dǎo)致載藥膠束對癌細(xì)胞的毒性比DOX顯著提高。而由圖10B可知，由于正常細(xì)胞HEK293的表面甘露糖受體低表達，DOX@PGMA-Mannose不能通過受體識別的內(nèi)吞攝取進入HEK293細(xì)胞，這樣導(dǎo)致DOX@PGMA-Mannose被HEK293細(xì)胞攝取的量降低。因此，對于正常細(xì)胞HEK293，DOX@ PGMA-Mannose比原藥DOX的毒性低。這種載藥膠束對癌細(xì)胞的選擇性抑制作用將有助于提高負(fù)載藥物的治療效率，降低其毒副作用。

3　討論

藥物輸送載體材料在經(jīng)過合理的設(shè)計和構(gòu)建后能夠有效地攜帶抗癌藥物到達腫瘤部位，減少藥物在正常組織的分布，降低抗癌藥的毒副作用，同時大幅提高藥物的生物利用度。因此，抗癌藥物靶向輸送載體的研究和應(yīng)用一直是癌癥治療研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的熱點。本研究合成了甘露糖修飾的PGMA，由于PGMA不溶于水，而甘露糖具有親水性，因此聚合物主鏈形成疏水核心，而支鏈甘露糖自由伸展進入水相形成膠束。以阿霉素DOX作為疏水藥物，用水包油法制備了載藥聚合物膠束DOX@PGMA-Mannose，研究了藥物的包埋和釋放，考察了DOX@PGMA-Mannose用于抑制癌細(xì)胞的藥效。結(jié)果顯示，DOX@PGMA-Mannose能通過甘露糖受體識別的方式被癌細(xì)胞MDA-MB-231內(nèi)吞，并在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物。與原藥DOX相比，DOX@PGMA-Mannose對癌細(xì)胞的毒性顯著提高，而對正常細(xì)胞的毒性較低。因此，PGMA-Mannose有望成為一種新型的靶向藥物輸送載體材料應(yīng)用于癌癥治療。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

D-mannose-conjugated polymeric micelles for targeted drug delivery

Shuting Wang1,2, Quan Zhang1,2,3, Zhou Ye1,2, Yongquan Xiong1,2, Chenyu Cui1,2, and Jian Yin1,2,3
1 The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
2 Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Abstract:Polymeric micelles have exhibited attractive properties as drug carriers, such as high stability in vivo and good biocompatibility, and been successfully used to dissolve various drugs of poor aqueous solubilities. In this study, we developed a new type of polymeric micelles with mannose-mediated targeting and pH-responsive drug release properties for anticancer drug delivery. The polymeric micelles were prepared from an amphiphilic polymer, poly (glycidyl methacrylate)-g-mannose (PGMA-Mannose). An anticancer drug, doxorubicin (DOX), was encapsulated into the micelles during the micellization, and could be released rapidly under acidic condition. The specificity of cellular uptake of the micelles by two different cell lines was studied using confocal laser scanning microscopy and the MTT assay. DOX-loaded micelles were efficiently trapped by mannose-receptor-overexpressing cancer cells MDA-MB-231, whereas mannosereceptor-poor cells HEK293 showed much lower endocytosis towards the micelles under the same conditions. Thus, DOX-loaded micelles displayed higher cytotoxicity to MDA-MB-231 cancer cells as compared with free DOX. The present study demonstrates that PGMA-Mannose micelles are a promising targeted drug delivery system for cancer therapy.

Keywords:D-mannose, polymeric micelles, targeted drug delivery, receptor-mediated endocytosis, cytotoxicity

DOI:10.13345/j.cjb.150075

Corresponding authors: Quan Zhang. Tel: +86-510-85197039; E-mail: quanzhang@jiangnan.edu.cn