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    離心去除精漿對(duì)絨山羊細(xì)管凍精品質(zhì)的影響

    2015-01-08 07:28:34楊軍祥謝文章執(zhí)筆
    畜牧獸醫(yī)雜志 2015年5期
    關(guān)鍵詞:頂體精漿活率

    薛 健,于 軒,楊軍祥,謝文章,王 珂,*(執(zhí)筆)

    (1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅 平?jīng)?44000;2.甘肅省畜牧管理局;3.甘肅省環(huán)縣畜禽改良站)

    利用隴東優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)絨山羊種公羊精液,通過人工授精技術(shù)改良當(dāng)?shù)亟q山羊是目前培育隴東絨山羊新類群的最有效的手段之一,推廣優(yōu)質(zhì)細(xì)管凍精可以顯著提高當(dāng)?shù)亟q山羊品種質(zhì)量,而凍精活力是影響受胎率關(guān)鍵因素。目前羊的細(xì)管凍精活力不高,是制約羊細(xì)管冷凍精液推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。在國(guó)內(nèi),1981年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所冷凍山羊凍精試驗(yàn)取得成功,趙曉娥等在制作波爾山羊的細(xì)管冷凍精液時(shí),采用離心去除掉精漿,獲得了良好的冷凍效果。通過參考山羊精液冷凍保存關(guān)鍵技術(shù)和研究成果,本試驗(yàn)對(duì)隴東絨山羊精液采取離心去除精漿,稀釋后細(xì)管封裝,液氮熏蒸冷凍,以期提高隴東絨山羊細(xì)管凍精的活力。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)羊的選擇

    選擇2~3歲,體質(zhì)健康,性欲旺盛的隴東優(yōu)質(zhì)絨山羊種公羊3只,飼養(yǎng)在甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng),受體母羊?yàn)榄h(huán)縣普通隴東絨山羊。

    1.2 試劑藥品及儀器

    葡萄糖、檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為國(guó)產(chǎn)分析純,青霉素,鏈霉素均哈爾濱制藥廠產(chǎn)品。卵黃為市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮雞蛋中抽取,冷凍液氮槽為自制,移液槍(德國(guó)Eppendorf),顯微鏡(日本NIKON)。

    1.3 精液制備

    采用假陰道法采精,每只公羊每日采精液2次,間隔15min,將兩次所采同一試驗(yàn)種公羊的精液混合,平均每只羊采精量為1.5mL左右,密度在22.5億/mL,鮮精活力在0.75以上。通過觀感和鏡檢后進(jìn)行第一次基礎(chǔ)液稀釋。

    1.4 稀釋液配方

    基礎(chǔ)液:蒸餾水100 mL,Tirs 3.32g,檸檬酸1.82g,葡萄糖1.0g,青霉素1 000萬IU,鏈霉素1 000μg;稀釋I液:取基礎(chǔ)液80mL加入20mL卵黃;稀釋II液:取I液46mL,加入甘油4mL。冷凍稀釋液的甘油最終濃度為4%。

    1.5 稀釋冷凍

    將采集的精液進(jìn)行顯微鏡檢測(cè),按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行離心處理。預(yù)先將稀釋I液在36 ℃水域中平衡10min,按體積比1∶4稀釋處理的精液,用16層紗布包裹,在4 ℃冰箱緩慢降溫平衡60min后,使之與等溫平衡的稀釋II液等倍稀釋混合,然后再平衡60min,在4 ℃低溫下用0.25mL麥管封裝。將封裝好的細(xì)管精液至于冷藏架上,在4 ℃冰箱置留30 min,準(zhǔn)備在冷凍槽中采用液氮熏蒸冷凍。

    1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    將采集的新鮮精液分為3份,第1份(對(duì)照組)精液不做離心處理;第2份(試驗(yàn)組1)為離心去除分精漿,精液按體積比1∶5加入基礎(chǔ)液稀釋后離心(1 250r/min、6 min),然后去掉一半上清;第3 份(試驗(yàn)組2)為離心完全去精漿組,精液按體積比1∶5加入基礎(chǔ)液稀釋,直接離心(1 250r/min、6min),反復(fù)離心3次,全部除去精漿。

    1.7 精子品質(zhì)的檢測(cè)及指標(biāo)

    冷凍細(xì)管從液氮罐中取出后,空氣浴5s,迅速投入38 ℃溫水中10s解凍。目測(cè)評(píng)估活力(簡(jiǎn)稱估測(cè)):為便于在顯微鏡下計(jì)數(shù),用移液槍取5μL待測(cè)精液,滴在載玻片,加上蓋玻片,置于顯微鏡下放大400倍檢查,計(jì)數(shù)一個(gè)視野下直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子與非直線運(yùn)動(dòng)精子的比例,求出活率。

    精子頂體完整率的檢測(cè):細(xì)管凍精解凍后,取10μL 精液滴于載玻片的左端,用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自右面接觸液滴,拉向另一側(cè),制成抹片。自然風(fēng)干5~10min后,用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min,水洗干燥后,用姬姆薩染色90min,蒸餾水沖洗,干燥,在400倍顯微鏡下觀察300個(gè)精子,統(tǒng)計(jì)頂體完整的精子數(shù)。每次至少計(jì)算200個(gè)精子。

    精子活率(%)=直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/總精子數(shù)×100%

    精子頂體完整率(%)=頂體完整的精子總數(shù)/所數(shù)總精子總數(shù)×100%

    1.8 數(shù)據(jù)處理

    各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 離心對(duì)隴東絨山羊精子活力的影響

    隨機(jī)抽取不同批次中每個(gè)組別的9支細(xì)管檢驗(yàn)活率,各階段精子活率由表1可見。應(yīng)用基礎(chǔ)液洗滌法除去精漿后及在降溫平衡后,對(duì)照組、試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2 之間精子活率差異均不顯著(P >0.05)。但冷凍后試驗(yàn)組1與對(duì)照組、試驗(yàn)組2之間活率差異極顯著(P<0.01),活率為33.41%,基本接近人工授精精子活率要求。

    表1 不同處理后精子活率的比較

    2.2 離心對(duì)隴東絨山羊精子頂體完整率的影響

    抽取方法同上,由表2知,在離心后精子的頂體完整率相比差異不顯著(P>0.05),降溫平衡后不同處理間頂體完整率差異顯著(P<0.05),解凍后試驗(yàn)組2與對(duì)照組和試驗(yàn)組1相比差異顯著(P<0.05)。

    表2 不同處理后精子頂體完整率比較

    2.3 離心對(duì)受體母羊受胎率的影響

    細(xì)管凍精人工授精在環(huán)縣進(jìn)行,挑選散戶飼養(yǎng)的隴東絨山羊作為受體母羊,在自然發(fā)情條件,隨即抽取細(xì)管凍精,進(jìn)行人工授精(人工授精次數(shù)為一次)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析,細(xì)管凍精母羊受胎率對(duì)照組為46.15%,試驗(yàn)組1為49.33%,試驗(yàn)組2為46%,組間差異不顯著(P>0.05)。

    表3 不同處理后細(xì)管凍精受胎率比較

    3 討論

    精液是由精子和精漿兩部分組成,兩者的成份分各不相同。精漿的成份分應(yīng)適合精子的生存,兩者之間要求取得一定平衡狀態(tài),否則精子便受到損害。因此,充分了解精液的生理、生化特性和它們之間的相互關(guān)系,有助于研究精子在冷凍過程中的變化,以進(jìn)一步提高冷凍精液活力和受胎率。哺乳動(dòng)物的精漿充當(dāng)著精子載體,稀釋精子和為精子提供代謝物質(zhì)的功能,同時(shí)精漿某些蛋白質(zhì)成分,如去能因子、山羊卵黃凝結(jié)酶等,抑制精子的獲能、頂體反應(yīng)的發(fā)生、誘導(dǎo)頂體酶的提前釋放,從而影響精子活力和受胎率。因此,在精子的冷凍保存等體外處理過程中有必要對(duì)精漿的性質(zhì)加以考慮,對(duì)精漿的副作用了解,利于進(jìn)一步了解冷凍保存對(duì)精子造成的傷害及其原因,從而改進(jìn)冷凍保存方法,提高細(xì)管冷凍精液品質(zhì)。

    在本研究中,除去部分精漿組后冷凍的精子活率、頂體完整率檢測(cè)指標(biāo)均優(yōu)于未離心組和完全除去精漿組,同時(shí)除去部分精漿組后受體母羊的受胎率高于其它組,這一結(jié)果同kisopatron和Ashworth的研究結(jié)果一致,這表明去除精漿后對(duì)冷凍后精子品質(zhì)有明顯提高作用;另外,Jasko等以500r/min離心18min除去稀釋過的精漿后可顯著提高馬的精子活力和運(yùn)動(dòng)速度。精漿中一些類似Zn2+的自由離子、游離氨基酸及過氧化物之類也能削弱精子的一些生理功能,而通過離心處理也能降低此類成分的含量,從而提高精液的冷凍效果。保留部分精漿進(jìn)行降溫平衡處理,精漿中的一些有益蛋白質(zhì)成分也可能與精子膜結(jié)合,從而降低精子細(xì)胞膜在整個(gè)冷凍過程中遭受損傷機(jī)率,并有助于維持冷凍精子的膜完整性。一些研究認(rèn)為,除去精漿對(duì)提高精子品質(zhì)有利,但對(duì)不同除去精漿方法的效果卻存在不同觀點(diǎn)。在本研究中,利用離心法洗滌精液除去部分精漿,解凍后精液品質(zhì)試驗(yàn)組明顯優(yōu)于對(duì)照組。但Maxwell等認(rèn)為,離心會(huì)嚴(yán)重傷害精子,導(dǎo)致精子活力下降。Harrison提出在Ficoll液中離心可除去精漿并對(duì)精子的機(jī)械性損傷最小,這種損失隨離心力、離心液及離心后剩余精漿濃度而不同。本試驗(yàn)從凍后活率來看,明顯高于未離心的細(xì)管凍精;從受胎率來看,去除部分精漿的細(xì)管凍精高于為未離心的細(xì)管凍精。由此可見,1 250r/min離心法是一種有效的去除精漿途徑,提高隴東絨山羊細(xì)管凍精活率及受體母羊受胎率的有效方法。

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