喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺DNA的作用研究

田　瑜，劉漢明，陳　靜，金義杰，夏彩芬*

(1.湖北工程學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 孝感 432000;2.湖北省孝昌縣第一中學(xué)，湖北 孝昌 432900)

喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺DNA的作用研究

田瑜1，劉漢明2，陳靜1，金義杰1，夏彩芬1*

(1.湖北工程學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 孝感 432000;2.湖北省孝昌縣第一中學(xué)，湖北 孝昌 432900)

摘要：采用紫外吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法、等溫滴定微量熱法研究了喹啉雙季銨鹽(BZQN)與小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用機理及熱力學(xué)關(guān)系。研究結(jié)果表明：BZQN具有顯著的熒光，在DNA的作用下，BZQN的熒光發(fā)生明顯的猝滅，并且猝滅常數(shù)(Ksv)隨著溫度的升高而增大，符合動態(tài)猝滅的特征；紫外可見光譜實驗、熱變性實驗及圓二色譜結(jié)果均表明，BZQN與DNA主要發(fā)生嵌插結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；等溫滴定量熱實驗表明BZQN與DNA的結(jié)合位點數(shù)約為4，推測BZQN與DNA的結(jié)合是熵驅(qū)動過程。

關(guān)鍵詞：喹啉雙季銨鹽；小牛胸腺DNA；光譜法；等溫滴定微量熱

喹啉類化合物是一類在醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用的芳香雜環(huán)化合物，有關(guān)此類化合物的合成及應(yīng)用近年來受到人們的廣泛關(guān)注[1-3]。喹啉是雜環(huán)芳香性有機化合物，分子式是C9H7N，微溶于水，易發(fā)生取代反應(yīng)，因此可以在喹啉環(huán)的基礎(chǔ)上通過修飾母體結(jié)構(gòu)改善水溶性，連接不同的取代基實現(xiàn)其不同的生物功能?；诖耍疚耐ㄟ^喹啉環(huán)上的芐溴取代反應(yīng)合成喹啉雙季銨鹽(BZQN)，并采用紫外光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法、等溫滴定量熱等方法探討了其與DNA相互作用的機理及熱力學(xué)關(guān)系，喹啉雙季銨鹽其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1　喹啉雙季銨鹽其結(jié)構(gòu)

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

1.1.1實驗儀器

本實驗所用主要實驗儀器如表1所示。

1.1.2實驗試劑

本實驗所用主要實驗試劑如表2所示。

1.2實驗內(nèi)容

1.2.1紫外光譜實驗

小牛胸腺 DNA(Sigma公司)用 PBS稀釋，查文獻[4]可知，0.01 g/L ctDNA的濃度在吸收光譜260 nm 處的摩爾吸收系數(shù) ε260=6 600 L/(mol.cm)，從而確定本實驗中配制的ctDNA的摩爾濃度為2.2×10-5mol/L。

取2 mL 2.2×10-5mol/L ctDNA溶液于比色皿中，相應(yīng)的試劑PBS作為參比，測試BZQN的系列濃度作用下，各溶液的紫外可見吸收光譜，重復(fù)3次。

在35 ℃時，測試2 mL 2.44×10-5mol /L ctDNA溶液紫外吸收強度。將恒溫槽程序升溫至95 ℃ (在35～95 ℃之間，每隔5 ℃記錄測試溶液的紫外吸收強度)，然后在2 mL 2.44×10-5mol/L ctDNA溶液中加入2 μL 5.63×10-4mol/L BZQN溶液混合均勻，重復(fù)上述過程，得BZQN作用前后ctDNA的熱變性曲線。

表1　實驗儀器

表2　實驗試劑

1.2.2熒光光譜實驗

取2 mL 2.25×10-5mol/L BZQN溶液于比色皿中，測試溶液的熒光強度作為空白對照，分別加入不同濃度的ctDNA溶液，測試溶液的穩(wěn)態(tài)熒光強度，得ctDNA滴定BZQN的穩(wěn)態(tài)熒光光譜；然后取2 mL 8.35×10-5mol/L DNA溶液于比色皿中，測試溶液的熒光強度作為空白對照，分別加入不同濃度的BZQN溶液，通過反滴定實驗，得BZQN滴定ctDNA的穩(wěn)態(tài)熒光光譜。

設(shè)置BZQN激發(fā)波長為340 nm，記錄400～650 nm之間發(fā)射光譜，獲取BZQN和BZQN-ctDNA體系的三維熒光光譜。分別控制溫度為25 ℃、31 ℃和37 ℃，取2 mL 2.25×10-5mol/L的BZQN溶液于比色皿中，加入系列濃度的ctDNA，測試各溶液的熒光強度，重復(fù)3次。

取40 μL 5.42×10-3mol/L的ctDNA溶液和10 μL 5.63×10-4mol/L的BZQN溶液分別用pH=8、9、10、11、12和13的Britton-Robison緩沖溶液配成2 mL的溶液，在最佳激發(fā)波長(340 nm)和最佳發(fā)射波長(490 nm)下測定不同pH值條件下的熒光強度，得ctDNA堿變性曲線圖。

1.2.3圓二色譜實驗

DNA 是光學(xué)活性物質(zhì)，因此可通過測定圓二色譜(CD)了解其構(gòu)象變化。實驗所用儀器為Chirascan圓二色譜儀，光源系統(tǒng)用氮氣保護(流量為5 L/min)，樣品池的光徑為0.5 mm，掃描波段為 200～320 nm，DNA的濃度為 0.3 g/L。實驗時在樣品池中放置90 μL的 DNA溶液，加入9 μL 1.13×10-3mol/L BZQN溶液，測量DNA和DNA-BZQN溶液的CD譜。

1.2.4等溫滴定微量熱實驗

BZQN與DNA作用的熱力學(xué)焓變由Nano ITC3G采用連續(xù)注射的方法完成，用儀器自帶的Nano ITC Analyze 軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理。將250 μL 1.13×10-4mol/L的BZQN溶液裝入250 μL 滴定針，設(shè)定總的滴定次數(shù)為25次，每次滴 10 μL于1.00 mL 2.17×10-5mol/LDNA溶液中；連續(xù)滴定時間間隔為300 s，每次滴定持續(xù)時間為2 s。2次滴定實驗的時間間隔大約45 min，使信號有足夠的時間返回基線。測量池的溫度控制為25 ℃，安瓿瓶中攪拌器的轉(zhuǎn)速固定在350 r/min，等基線穩(wěn)定后再啟動實驗，以便使因攪拌而產(chǎn)生的熱量被自動扣除。為扣除BZQN和DNA的稀釋熱，要進行空白實驗。

2分析與討論

2.1紫外光譜實驗

2.1.1BZQN對ctDNA的紫外吸收光譜的影響

圖2是不同濃度的BZQN在ctDNA溶液中的紫外吸收光譜，其中曲線F是2.75×10-2mmol/L BZQN對應(yīng)的結(jié)果。溶液在210 nm、255 nm和325 nm處發(fā)生吸收，紫外吸收光譜發(fā)生增色效應(yīng)，溶液的紫外吸收強度隨BZQN濃度的增大而增強，說明BZQN與ctDNA之間發(fā)生了較強的相互作用。增色、減色效應(yīng)是DNA所特有的，與其雙螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的光譜性質(zhì)，由顯著的增色效應(yīng)可以推測可能是BZQN嵌入到ctDNA的堿基對中，改變了構(gòu)成堿基堆積力的疏水作用力和范德華力，使DNA的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性產(chǎn)生改變[5]，因此推斷BZQN與ctDNA之間可能發(fā)生了嵌插作用。

2.1.2熱變性實驗

圖3　ctDNA與BZQN-ctDNA的熱變性曲線

圖3是溫度對DNA及BZQN-DNA溶液的吸光度的影響曲線。曲線a是ctDNA，曲線b是BZQN-DNA，由圖3可以看出游離ctDNA的Tm約為87 ℃，而BZQN-DNA復(fù)合物的Tm約為92 ℃，Tm明顯升高。由于嵌插結(jié)合會使Tm增加，而溝槽或靜電結(jié)合對Tm影響很小，因此推測BZQN部分嵌入ctDNA的堿基對中，并在一定程度上增強了ctDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.2熒光光譜實驗

2.2.1穩(wěn)態(tài)熒光

圖4是BZQN滴定ctDNA溶液的熒光光譜，其中曲線A是1.67×10-5mol/L ctDNA，BZQN空白對照的濃度為1.88×10-3mmol/L。ctDNA無熒光，當(dāng)加入BZQN后，溶液的熒光發(fā)射峰從470 nm移動388 nm處，且熒光強度隨BZQN濃度的增大而增強。說明BZQN對DNA具有增敏作用，且發(fā)射波長發(fā)生藍移，表明BZQN與DNA之間發(fā)生了強烈的相互作用。

圖4　BZQN滴定ctDNA的熒光光譜圖

圖5　ctDNA滴定BZQN的熒光光譜圖

圖5是不同濃度的ctDNA在BZQN溶液中的熒光光譜，其中ctDNA空白對照溶液的濃度為1.67×10-2mmol/L。BZQN在470 nm處出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，溶液的熒光強度隨著ctDNA濃度的增大而減小，說明ctDNA對BZQN的熒光有猝滅作用。

2.2.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜不僅能夠直觀地表現(xiàn)核酸分子在不同條件下的構(gòu)象變化，還可全面展現(xiàn)待測樣品的熒光信息，由此使核酸特征構(gòu)象變化的研究更具有科學(xué)性和可靠性[7]。BZQN和BZQN-DNA的三維熒光光譜如圖6所示。比較左右兩圖可以看出：加入ctDNA后，散射峰明顯增強，說明BZQN與DNA之間發(fā)生了強烈的相互作用；而熒光發(fā)射峰的強度減弱，與穩(wěn)態(tài)熒光光譜的結(jié)果相同，表明DNA與BZQN發(fā)生相互作用后使BZQN的熒光猝滅。

圖6　BZQN(左)和BZQN-ctDNA(右)的三維熒光光譜圖

2.2.3變溫?zé)晒?/p>

圖7　不同溫度下ctDNA對BZQN的

圖7是不同溫度下的Stem-Volmer曲線。對實驗數(shù)據(jù)進行線性擬合，發(fā)現(xiàn)298 K時,Ksv=5.3×104L/mol，303 K時，Ksv=7.9×104L/mol，310K，Ksv=8.8×104L/mol。動態(tài)猝滅作用的Ksv值一般都小于2.00×1010L/mol，初步判斷DNA對BZQN的猝滅方式可能為動態(tài)猝滅。據(jù)文獻[9]報道，隨著溫度的升高，會使分子擴散系數(shù)增大，分子間發(fā)生碰撞的幾率增大，發(fā)生熒光猝滅的可能性也隨之增大。如果熒光猝滅機理是靜態(tài)猝滅，溫度升高會使Ksv減??；若是動態(tài)猝滅，則溫度的升高會使Ksv增大。同時，升高溫度后將降低配合物的穩(wěn)定性，這就使得形成配合物的可能性也減小[9]。圖7中，隨著溫度升高，Ksv的值明顯增大，表明ctDNA對BZQN的猝滅方式為動態(tài)猝滅。

2.2.4堿變性實驗

ctDNA是具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的大分子，通過兩條鏈之間的堿基對由氫鍵相互作用而緊密連接在一起。BZQN是本身具有熒光的物質(zhì)，與DNA相互作用后形成的BZQN-DNA溶液也具有熒光。DNA的堿變性是指互補堿基間的氫鍵作用力在堿性溶液中會減弱，導(dǎo)致DNA開鏈成兩條單鏈而破壞其雙螺旋結(jié)構(gòu)[10]。

曲線A-F是pH值為8、9、10、11、12和13時對BZQN-DNA溶液的熒光光譜。由圖8可以看出：隨著溶液堿性的增強，溶液的熒光強度減弱，且在堿性較強的溶液中熒光強度特別微弱。這種現(xiàn)象可能是因為溶液堿性增強后使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使BZQN從DNA上脫落，在溶液中游離使能量降低，熒光強度減弱，據(jù)此可以推測BZQN應(yīng)該嵌插于ctDNA的堿基間。

圖8　BZQN-DNA體系堿變性曲線圖

2.3BZQN對DNA的結(jié)構(gòu)影響

DNA的圓二色譜圖(CD)中275 nm波長附近的正峰代表DNA 堿基對的堆積，240 nm 處的負(fù)峰是DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的B型構(gòu)象的特征峰[11]，可以通過正負(fù)峰的強度和位置的變化判斷DNA結(jié)構(gòu)的變化。

圖9 是DNA和BZQN-DNA的CD光譜圖。在200～300 nm的紫外區(qū)內(nèi)，ctDNA在275 nm 左右出現(xiàn)一個正的最大值，主要是由于DNA的堿基對堆積而產(chǎn)生的；在240 nm左右出現(xiàn)一個負(fù)的最大值，是由DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的B型DNA特征峰[11]。加入BZQN溶液后，導(dǎo)致DNA的CD譜發(fā)生變化，在275 nm處的CD正峰強度減弱，240 nm處的負(fù)峰的強度增強。說明BZQN與DNA之間發(fā)生了相互作用，且作用后影響了ctDNA的二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，而二級結(jié)構(gòu)的變化會導(dǎo)致DNA三、四級結(jié)構(gòu)的改變，從而引起DNA生物學(xué)功能的改變。BZQN加入后，ctDNA的CD譜的譜峰的位置并未發(fā)生改變，說明BZQN的加入只影響了DNA的二級構(gòu)象，并沒有使ctDNA分子雙螺旋鏈發(fā)生解鏈[12]。

圖9　DNA和DNA-BZQN 溶液的CD譜

2.4BZQN與DNA相互作用的熱力學(xué)

圖10為BZQN與DNA結(jié)合的等溫滴定微量熱(ITC)曲線，以及儀器自帶的Nano ITC Analyze 處理軟件線性擬合得到BZQN與DNA反應(yīng)的焓變與熵變，分別為27.72 kJ/mol和200.9 J/(mol·K)，結(jié)合常數(shù)Ka為4.32×105L/mol，結(jié)合位點數(shù)n = 4。根據(jù)吉布斯-赫姆霍茲公式 (等溫狀態(tài)下)計算可得，常溫下BZQN與ctDNA結(jié)合的吉布斯自由能變?yōu)?32.16 kJ/mol，表明在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下ctDNA與BZQN的結(jié)合是自發(fā)過程。

圖10　BZQN與DNA結(jié)合的ITC曲線

藥物與生物大分子之間相互作用的作用力主要有靜電、氫鍵和疏水作用。對于DNA - 藥物體系，焓值和熵值都為正值，表明BZQN與DNA的作用過程是吸熱和熵增的過程，主要作用力是氫鍵和靜電作用。DNA分子周圍的水分子在藥物與之相互作用的過程中會被擠出，并且結(jié)合位點附近的水化層也會因為藥物的靠近而失去一部分水分子，DNA和藥物的脫水作用都是吸熱的過程，并且對于熵增是正貢獻[13-14]。因為T△S>△H，則△G<0，所以推測BZQN與DNA的結(jié)合是熵驅(qū)動過程。

3結(jié)論

本文采用光譜法和等溫滴定微量熱法研究了BZQN與ctDNA相互作用機理及熱力學(xué)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ctDNA能使BZQN的熒光發(fā)生動態(tài)猝滅，推測BZQN主要以嵌插的方式與ctDNA結(jié)合，增強了ctDNA的穩(wěn)定性，微量熱實驗表明BZQN與ctDNA的結(jié)合是熵驅(qū)動過程。

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(責(zé)任編輯：張凱兵)

Study on Interaction of Quinolinebiquaternary Ammonium Salt with Calf Thymus DNA

Tian Yu1，Liu Hanming2,Chen Jing1，Jin Yijie1，Xia Caifen1*

(1.SchoolofChemistryandMaterialsScience,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China; 2.TheFirstMiddleSchoolofXiaochangCounty,Xiaochang,Hubei432000,China)

Abstract：The interaction between quinolinebiquaternary ammonium salt (BZQN) and calf thymus deoxyribonucleic (ctDNA) was investigated by spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC). The results indicated that BZQN had significant fluorescence. In the presence of ctDNA, the fluorescence of BZQN was quenched and the quenching constant(Ksv) increased as the temperature rose, which fitted the characteristics of dynamic fluorescence quenching. All of the UV spectra, melting experiment and CD spectra showed that the conformation of ctDNA secondary structure had changed because of the intercalation effect between BZQN and DNA. The ITC calculated that the binding point between BZQN and DNA was 4, and the combination process of BZQN and DNA was driven by entropy.

Key Words：quinolinebiquaternary ammonium salt (BZQN); calf thymus DNA (ctDNA); spectroscopy; isothermal titration calorimetry (ITC)

收稿日期：2016-03-21

作者簡介：田瑜 (1995-)，女，山西晉中人，湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院學(xué)生。

中圖分類號：S481.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-4824(2016)03-0016-06

夏彩芬 (1979-)，女，湖北武漢人，湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院副教授，本文通信作者。