HPLC同時測定護(hù)肝片中5種成分的不確定度分析

伍國怡

【摘要】目的：建立HPLC法測定護(hù)肝片中腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的不確定度評定方法。方法：根據(jù)《測量不確定度評定與表示》的有關(guān)規(guī)定，分析影響含量結(jié)果不確定度的因素來源，并對各不確定度因素進(jìn)行評定，計算合成不確定度，最終給出擴(kuò)展不確定度和報告不確定度。結(jié)果：不確定度評估為腺苷±081%，五味子醇甲±086%，五味子酯甲±067%，五味子甲素±074%，五味子乙素±078%。結(jié)論：對照品的配制、樣品溶液、進(jìn)樣重復(fù)性的不確定度是肝片5種成分不確定度的主要來源。

【關(guān)鍵詞】HPLC；護(hù)肝片；腺苷；五味子醇甲；五味子酯甲；五味子甲素；五味子乙素；不確定度

【中圖分類號】R2841【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）10-0033-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for uncertainty analysis of Adenosine、Schisandrin、Schisantherin、Deoxyschizandrin and Schisandrin B in Hugan Tabelts. Methods According to the technical requirements of Evaluation and expression of uncertainty in measurement， each active component of uncertainty was calculated the variable parameters among the procedures. The combined uncertainty and extended uncertainty reported Uncertainty were finally obtained by synthesized the uncertainties of various component variables. Results The uncertainty for Adenosine was±081%， Schisandrin was±086%， Schisantherin was±067%， Deoxyschizandrin was±074%and Schisandrin B was±078%. Conclusion The uncertainty of reference standard qualrity was the main source of five components measurement uncertainty in Hugan Tabelts.

Keywords：HPLC；Hugan Tabelts；Adenosine；Schisandrin；Schisantherin；Deoxyschizandrin；Schisandrin B； measurement uncertainty

護(hù)肝片由柴胡、茵陳、板藍(lán)根、五味子、豬膽粉、綠豆等六味中藥經(jīng)提取、加工制成的中成藥，收載于2010年版《中國藥典》一部[1]，具有疏肝理氣，健脾消食，降低轉(zhuǎn)氨酶的功效，臨床用于慢性肝炎及早期肝硬化等。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)系的參數(shù)[2]，它是被測量客觀值在某一量值范圍內(nèi)的一個評定，其大小決定了測量結(jié)果的實用價值。測量不確定度是評價定量方法的可靠性與測量結(jié)果的可信程度的主要內(nèi)容之一，其重要性已得到廣泛認(rèn)可。目前，測量不確定度的評定在環(huán)境分析、食品檢驗、藥物分析等領(lǐng)域得到深入的研究和廣泛的應(yīng)用[3-8]。研究根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF1059-1999）中有關(guān)規(guī)定，對護(hù)肝片中5種成分含量的測量不確定度進(jìn)行分析，以找出影響不確定度的因素，對不確定度進(jìn)行評估，為評價檢測報告提供理論依據(jù)，以控制測量結(jié)果的有效性和適宜性。

1儀器與材料

11儀器Agilent 1200系列高效液相色譜儀（Agilent 1200 LC色譜工作站、G1322A DEGASSER溶劑脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、 G1314B VWD 紫外檢測器）；CP225D電子天平（德國賽多利斯 ）；COBOS AW-120自動電子天平（西班牙）；SB3200WS 超聲波清洗器（上海必能信）；Type HT-203A column HEATER（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

12材料 腺苷（批號：110879-200202）、五味子醇甲（批號：110857-201412）、五味子酯甲（批號：111529-200302）、五味子甲素（批號：0764-200107）和五味子乙素（批號：110765-200407）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。護(hù)肝片（批號：20130512、20141122，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司；批號：20140702，廣東省惠州市中藥廠有限公司）。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×46 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）07%磷酸溶液（B）梯度洗脫（見表1）；流速：08 ml/min；檢測波長： 0～14min，260nm；1401～58min，250nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。理論板數(shù)按腺苷計應(yīng)不低于2500。

22溶液的制備

221混合對照品溶液的制備分別精密稱取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品1469、1980、989、1112、1138 mg置25ml量瓶，加50%甲醇溶解并定容至刻度，分別配制成對照品貯備溶液；各精密取2ml置25ml量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容至刻度（含腺苷00470mg/ml、五味子醇甲00634mg/ml、五味子酯甲00316mg/ml、五味子甲素00356mg/ml、五味子乙素00364mg/ml的溶液）即得。

221供試品溶液的制備取本品10片，除去包衣后，精密稱定，研細(xì)，取約1片的量，精密稱定，精密加入50%甲醇20mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40KHz）50min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，濾液用045μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

222陰性對照溶液的制備按處方中藥味的比例，分別自配不含板藍(lán)根和不含五味子的群藥，按其工藝制成陰性對照樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

23方法學(xué)考察

231線性關(guān)系的考察精密稱取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品適量，以50%甲醇為溶劑，配制成混合對照品溶液。倍比稀釋法配置成系列質(zhì)量濃度的溶液。進(jìn)樣10μl，測定各組分峰面積。以各組分濃度（C）橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。腺苷：A=38133 C+13918，r=09998；五味子醇甲：A=20180 C+11309，r=10000；五味子酯甲：A=14253 C+59979，r=09999；五味子甲素：A=17825 C+38007，r=10000；五味子乙素：A=26780 C-15709，r=09999。

232精密度試驗精密吸取同一供試品（批號：20130512）溶液10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，其RSD分別為085%、059%、105%、076%、081%。

233重復(fù)性試驗取同一批樣品（批號：20130512）約1片的量共6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，各進(jìn)樣10μl，測定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，結(jié)果RSD分別為：183%、139%、221%、179%、150%。

234穩(wěn)定性試驗取同一供試品（批號：20130512）溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、12h時進(jìn)樣10μl，記錄色譜峰面積，計算腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積的RSD分別為152%、088%、191%、125%、095%。

235加樣回收率試驗精密量取已測定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素含量的護(hù)肝片（批號：20130512）樣品9份（每份約05片的量），精密稱定，每份分別精密加入一定量的腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果平均回收率分別為9945%、10010%、9919%、9969%、9988%。RSD分別為：159%、150%、178%、171%、150%。

3不確定度來源的識別及分析

31不確定度的來源從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析，樣品中5種成分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度罸rel來源，主要包括：①對照品溶液濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（Cs）；②供試品溶液配制過程引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（V）；③HPLC測定峰面積相應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（A）、Urel（As）。即：

Urel=U2 rel （Cs） + U2 rel （V） + U2 rel （As） + U2 rel （A）

32對照品溶液濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（Cs）：Urel（Cs）的來源：①對照片的純度的不確定度；②對照品的稱量所產(chǎn)生的相對不確定度Urel（ms）；③配制對照品溶液產(chǎn)生的相對不確定度Urel（Vs）。

321對照品的純度的不確定度對照品腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均購自中國藥品生物制品檢定所，由于尚無法得到不確定度參考值，故此項忽略。

322對照品的稱量所產(chǎn)生的相對不確定度Urel（ms） 檢定證書中1/10萬天平稱量允差為001mg，按矩形分布計算不確定度為u（ms1）=001/3=00058mg；該天平稱量時重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為001mg，即u（ms2）=001mg；腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素5種對照品的取樣量分別為1469，1980，989，1112，1138mg，則對照品稱量所引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

腺苷：Urel（ms腺）=u（ms1）2+u（ms2）2m=000582+00121469=008%

同理五味子醇甲：Urel（ms醇）=006%；五味子酯甲：Urel（ms酯）=012%；五味子甲素：Urel（ms甲）=010%；五味子乙素：Urel（ms乙）=010%。

323對照品溶液配制的相對不確定度對照品溶液配制過程中分別使用了25ml量瓶與2ml移液管，其不確定度分別如下：①校準(zhǔn)，A級25ml量瓶、2ml移液管的允許偏差分別為±003ml，±001ml，按矩形分布計算不確定度為003/3=00173ml，001/3=00058ml；②重復(fù)性，用A級25ml量瓶與2ml移液管重復(fù)吸量蒸餾水10次，測得重復(fù)性不確定度u（Vs25）=00034ml，u（Vs2）=00010ml；③溫度，環(huán)境溫度為室溫（20±5）℃，溶劑水的體積膨脹系數(shù)為21×10-4，按矩形分布，環(huán)境溫度引入的不確定度為u（Ts25）=（5×21×10-4×25）/3=00152℃，u（Ts2）=（5×21×10-4×2）/3=00012℃。

對照品溶液配制過程中分別使用了25ml量瓶2次，2ml移液管1次，因此對照品配制過程的引入的相對不確定度為：

Urel（Vs25）=001732+000342+00152225=009%

Urel（Vs2）=000582+000102+0001222=030%

Urel（Vs）=2×000092+000302=033%

因此，對照品溶液濃度引入的相對不確定度分別為：腺苷：Urel（Cs腺）=000082+000332=034%；同理五味子醇甲：Urel（Cs醇）=034%；五味子酯甲：Urel（Cs酯）=035%；五味子甲素：Urel（Cs甲）=035%；五味子乙素：Urel（Cs乙）=035%。

33供試品溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定Urel（V）供試品溶液在配制過程中使用了20ml移液管，其不確定度如下：①校準(zhǔn)，A級20ml移液管的允許偏差為±003ml，按矩形分布計算不確定度為003/3=00173ml；②重復(fù)性，用A級20ml移液管重復(fù)吸量蒸餾水10次，測得重復(fù)性不確定度u（Vs20）=00030ml；③溫度，環(huán)境溫度為室溫（20±5）℃，溶劑水的體積膨脹系數(shù)為21×10-4，按矩形分布，環(huán)境溫度引入的不確定度為u（Ts20）=（5×21×10-4×20）/3=00122℃。則樣品溶液配制過程中引入的相對不確定度為：

Urel（V）=001732+000302+00122220=011%

34HPLC測定峰面積相應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（A），Urel（As）Urel（A），Urel（As）主要由重復(fù)進(jìn)樣引起，由儀器給出的進(jìn)樣峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差為隨機(jī)測量，屬A類不確定度?；旌蠈φ掌啡芤褐貜?fù)進(jìn)樣6次，其峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按貝賽爾公式計算S=∑（Ai-A）2n-1，混合對照品中腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為Urel（AS腺）=S腺A腺=059%，Urel（AS醇）=S醇A醇=066%，Urel（AS酯）=S酯A酯=035%，Urel（AS甲）=S甲A甲=042%，Urel（AS乙）=S乙A乙=057%。

同理，供試品中5種成份的相對不確定度分別為Urel（A腺）=043%，Urel（A醇）=041%，Urel（A酯）=044%，Urel（A甲）=048%，Urel（A乙）=039%。

35計算合成不確定度將所有的不確定度分量進(jìn)行匯總（表2），有利于更直觀分析各分量的大小。對5種成分進(jìn)行合成不確定度計算，結(jié)果分別為：

Urel腺=U2rel（CS腺）+U2rel（V）+U2rel（AS腺）+U2rel（A腺）

=000342+000112+000592+000432

=081%

同理：Urel醇=086%，Urel酯=067%，Urel甲=074%，Urel乙=078%。

根據(jù)樣品測量方法得護(hù)肝片（批號：20130512）中5種成分的含量為X腺=029mg/片，X醇=056mg/片，X酯=013mg/片，X甲=014mg/片，X乙=029mg/片。則5種成分含量的相對合成不確定度分別為mg/片，Ux醇=056×086%=00048mg/片，Ux酯=013×067%=00009mg/片，Ux甲=014×074%=00010mg/片，Ux乙=029×078%=00023mg/片。

36計算擴(kuò)展不確定度及測量結(jié)果取95%的置信概率，包含因子k=2，則U=2×Ux，本次實驗所測量樣品的含量及不確定度見表3。

4討論

分析評估不確定度，應(yīng)盡量注意產(chǎn)生不確定度的所有來源，因為合成不確定度的數(shù)值取決于重要的不確定度分量。從表2各標(biāo)準(zhǔn)分量的不確定度可知，本研究測定護(hù)肝片中5種成分結(jié)果的各分量不確定度均較小，測量結(jié)果的不確定度主要來源于對照品的配制和樣品溶液進(jìn)樣重復(fù)性的不確定度。在分析了上述影響測量不確定度原因后，在以后的試驗中加以注意和改進(jìn)。選擇精密度高的單標(biāo)線移液管，盡可能減少量取的次數(shù)并盡量選用容量相對大的量具，樣品測量應(yīng)在基線平穩(wěn)后進(jìn)樣，同時盡量保持標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液測定條件相同，使測量結(jié)果更加可靠，測量結(jié)果的不確定度進(jìn)一步減小。本研究所建立的方法考慮了HPLC測定過程中產(chǎn)生不確定度的大部分因素，為同類方法測量結(jié)果的不確定度評定提供有益的參考。

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（收稿日期：20160323）