黃連上清丸、護(hù)肝片及牛黃解毒丸對(duì)藥物代謝酶CYP3A4活性的影響

周國(guó)堅(jiān)　葉董婷　鄧旭杏

【摘要】目的：觀察黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸對(duì)CYP3A4活性的影響。方法：利用體外肝微粒體培育體系，以咪達(dá)唑侖作為探針底物，研究黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素 P450 3A4（CYP3A4）活性的影響。結(jié)果：與空白組對(duì)比，黃連上清丸、牛黃解毒丸對(duì)CYP3A4活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，護(hù)肝片對(duì)CYP3A4活性表現(xiàn)為抑制作用。結(jié)論：在與臨床上經(jīng) CYP3A4代謝的藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，應(yīng)警惕黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸潛在藥物之間的相互作用。

【關(guān)鍵詞】黃連上清丸；護(hù)肝片；牛黃解毒丸；細(xì)胞色素 P450 3A4

【中圖分類號(hào)】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）10-0018-03

細(xì)胞色素P450酶是人體內(nèi)的肝藥酶，廣泛分布于肝臟等器官。研究發(fā)現(xiàn)，有20多種同工酶與藥物代謝相關(guān)性高，共同參與人體內(nèi)300余種藥物的代謝[1]。多種藥物同時(shí)使用時(shí)，若其中藥物是CYP3A4的誘導(dǎo)劑或抑制劑，則會(huì)顯著影響合用中其他藥物的代謝，也會(huì)對(duì)其他藥物的療效產(chǎn)生影響。研究表明，多種中藥提取物對(duì)P450活性有一定影響，如銀杏、五味子、白芷、羌活等甲醇提取物對(duì)CYP3A4有抑制作用[2-3]。利用體外實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)是否發(fā)生藥物代謝性相互作用，是藥物代謝研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。研究黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸對(duì)重組人肝微粒體細(xì)胞色素酶rCYP3A4的影響，結(jié)果如下。

1儀器與材料

11儀器MINI-10K微型離心機(jī)（常州朗越儀器制造有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；XH-C旋渦混合器（常州朗越儀器制造有限公司）；DW-86L386立式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；LC3000高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）。

12材料人重組肝細(xì)胞微粒體CYP3A4（批號(hào)：M41013，SPIBIO產(chǎn)）；咪達(dá)唑侖注射液（批號(hào)：20140607，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；1羥基咪達(dá)唑侖（批號(hào)：FN08081402，Cerilliant）；卡馬西平（批號(hào)：100142-201105，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；酮康唑（批號(hào)：SM0325YF13，上海源葉生物科技有限公司）；NADPH（批號(hào)：WO1028EA14，上海源葉生物科技有限公司）。黃連上清丸（批號(hào)：14060026，太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司）；牛黃解毒丸（批號(hào)：13012307，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠）；護(hù)肝片（批號(hào)：201405102，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司）。乙腈（批號(hào)：20141021，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇（批號(hào)：20140723，廣東光華科技股份有限公司）；磷酸氫二鉀（批號(hào)：20140701-2，廣州化學(xué)試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷（批號(hào)：TA0429CA14，上海源葉生物科技有限公司）；無(wú)水氯化鎂（批號(hào)：20140412，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；碳酸氫鈉（批號(hào)：20140701-1，廣州化學(xué)試劑廠）。

2實(shí)驗(yàn)方法

21溶液的配制

211咪達(dá)唑侖的配制精密吸取咪達(dá)唑侖注射液360μl（相當(dāng)于咪達(dá)唑侖18mg），置于5ml容量瓶中，用純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度均為10mmol/l的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱備用。精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度為100μmol/l的咪達(dá)唑侖溶液。

2121-羥基咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密吸取100μl 1-羥基咪達(dá)唑侖于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1μg/ml的儲(chǔ)備液，精密吸取1ml 100μl 1-羥基咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液于10ml容量瓶中，甲醇定容制刻度，得到100ng/ml的儲(chǔ)備液，置于冰箱4℃下保存待用。

213卡馬西平內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取100mg卡馬西平于10ml容量瓶中，用乙腈定容得到1mg/ml的卡馬西平儲(chǔ)備液，從儲(chǔ)備液中精密吸取200μl到10ml容量瓶中，用乙腈定容得到濃度為200μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

214磷酸鹽緩沖液（pH74）的配制 取磷酸二氫鉀136g，加 01mol/l氫氧化鈉溶液79ml，用水稀釋至200ml，即得PBS溶液。

215陽(yáng)性抑制劑酮康唑的配制精密稱取酮康唑265mg于5ml容量瓶中，用PBS溶液（pH 74）溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為100mmol/l的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱備用。

216氯化鎂溶液的配制精密稱量475mg氯化鎂于10ml容量瓶中，用PBS溶液（pH 74）充分溶解，定容搖勻，得到5000mmol/l的氯化鎂溶液。

217NADPH溶液的配制精密稱量83mg的NADPH用PBS溶液（pH 74）稀釋得到濃度為100mmol/l的NADPH，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃冰箱避光保存。

218人重組肝細(xì)胞微粒體CYP3A4的配制精密吸取100μl人重組肝細(xì)胞微粒體 CYP3A4，置于1ml容量瓶，用PBS溶液（pH 74）配制成濃度為100pmol/l的溶液，置于-20℃冰箱中保存。

22孵育體系與樣品處理[4-5]

221孵育體系肝微粒體體外孵育體系的總體積為200μl：20μlCYP3A4（終濃度為10pmol·l-1），20μl氯化鎂（終濃度為500mmol·l-1），10μl咪達(dá)唑侖（終濃度為5μmol·l-1），剩余體積用PBS緩沖溶液（pH74）補(bǔ)充，37℃水浴中孵育5min后，加入20μl NADPH（終濃度為10mmol/l）啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)5min。

222樣品處理孵育結(jié)束后，馬上向孵育體系中加入100μl冰乙腈（含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)-卡馬西平2μg/ml）終止反應(yīng)，渦旋混合1min，-20℃下放置10min，10000r/min高速離心10min，取上清液過(guò)濾，吸取20μl注入到HPLC儀中測(cè)定。

23色譜條件[6]色譜柱：Kromasil C18（250mm×46mm，5μm）；流速：100ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；流動(dòng)相：100mmol/L醋酸銨緩沖液-甲醇（42∶58）；進(jìn)樣量：20μl。

24分組與給藥[7]體外孵化反應(yīng)分為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和試藥組。陰性對(duì)照組中加入磷酸鹽緩沖液（pH74），陽(yáng)性對(duì)照組中加入酮康唑溶液（00125、0025、005、01、05、1、10、50μmol/l）；試藥組給予以磷酸鹽緩沖液（pH74）稀釋的不同濃度的中成藥溶液。孵育體系總體積均為200μl，根據(jù)“22孵育體系與樣品處理”項(xiàng)下進(jìn)行反應(yīng)并處理。將所有樣品按“23色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的生成率可確定 CYP3A4 酶的相對(duì)活性（即試藥組占陰性對(duì)照組生成率的百分比），計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）。

25標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取6只EP管，加入1-羥基咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液，使1-羥基咪達(dá)唑侖的終濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000ng/ml，按照體外孵育和樣品處理方法“22孵育體系與樣品處理”項(xiàng)操作，取上清液20μl進(jìn)樣，以1-羥基咪達(dá)唑侖和卡馬西平的峰面積比值（Y）和含量（X）進(jìn)行加權(quán)回歸。

26酮康唑IC50的測(cè)定及抑制活性的評(píng)價(jià)在肝微粒體孵育體系中陽(yáng)性抑制劑酮康唑?qū)YP3A4介導(dǎo)的咪達(dá)唑侖1-羥基化反應(yīng)有強(qiáng)抑制作用。陽(yáng)性對(duì)照組中加入酮康唑溶液，使其終濃度為：0025、01、05、1、10、50μmol/l，根據(jù)“22孵育體系與樣品處理”項(xiàng)下進(jìn)行反應(yīng)并處理，根據(jù)1-羥基咪達(dá)唑侖的生成率來(lái)確定 CYP3A4 酶的相對(duì)活性（即實(shí)驗(yàn)組占陰性對(duì)照組生成率的百分比），計(jì)算半數(shù)抑制率IC50。

27對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選

271樣品配制[7]根據(jù)說(shuō)明書，分別取治療量的黃連上清丸、護(hù)肝片、牛黃解毒丸，經(jīng)處理后，分別置于100ml容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，超聲30min，濾過(guò)，濾液作為儲(chǔ)備液。將中成藥分為低、中、高劑量組，低、高劑量組則分別為中劑量組的1/2 和2 倍。并同時(shí)設(shè)置空白組。每個(gè)樣品平行做3份。

272酶孵化的條件反應(yīng)體系中先分別加入PBS（pH74）、咪達(dá)唑侖、氯化鎂、rCYP3A4和待測(cè)藥物的儲(chǔ)備液，置于37℃水浴中預(yù)孵化振蕩5 min后，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動(dòng)孵化反應(yīng)。37℃水浴振蕩反應(yīng)5min后，加入冰乙腈（含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)-卡馬西平2μg/ml）終止反應(yīng)。渦旋混合1 min，-20℃下放置10min ，10000rpm離心5 min，取上清液過(guò)濾，吸取濾液20μl注入HPLC儀中，按“23色譜條件”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定咪達(dá)唑侖代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的濃度。

273代謝產(chǎn)物的測(cè)定使用HPLC儀按“23色譜條件”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定1-羥基咪達(dá)唑侖與卡馬西平的含量，考察對(duì)CYP3A4活性影響較大的中成藥。代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的生成率越低，表示抑制作用越強(qiáng)。

28對(duì)rCYP3A4活性抑制作用的強(qiáng)弱（IC50值）的計(jì)算

281酶孵化的條件參見(jiàn)“27對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選”項(xiàng)下“272酶孵化的條件”項(xiàng)操作。

282代謝產(chǎn)物的測(cè)定參見(jiàn)“27對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選”項(xiàng)下“273酶孵化的條件”項(xiàng)操作。

283IC50的測(cè)定 通過(guò)體外初步篩選后，在固定CYP3A4濃度、探針底物咪達(dá)唑侖濃度和NADPH濃度的同時(shí)，改變待測(cè)中成藥的濃度，測(cè)定不同濃度下中成藥對(duì)1-羥基咪達(dá)唑侖生成率的影響，判斷對(duì)CYP3A4的抑制程度，估計(jì)中成藥對(duì)rCYP3A4活性的影響強(qiáng)弱。以中成藥濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），CYP3A4酶的相對(duì)活性（%）表示為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算IC50值和95%的可信范圍[8]，計(jì)算公式為：Y=min×（max-min）/ [1+10^（X-LogIC50）]。

3結(jié)果

31專屬性考察按“23色譜條件”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，1-羥基咪達(dá)唑侖，卡馬西平的分離度好（>15），1-羥基咪達(dá)唑侖與卡馬西平出峰時(shí)間分別在154min，86min。見(jiàn)圖1-3。

32標(biāo)準(zhǔn)曲線以1-羥基咪達(dá)唑侖和卡馬西平的峰面積比（Y）和含量（X）進(jìn)行加權(quán)回歸，得到Y(jié)=00013X+00024 （R2=09937，n=6），表明1-羥基咪達(dá)唑侖在10-1000ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖4。

33陽(yáng)性對(duì)照組酮康唑?qū)CYP3A4酶相對(duì)活性計(jì)算 IC50為006538μmol/l，95%區(qū)間為004542～00941，符合文獻(xiàn)[8]范圍（006～016μmol/l），表明所用的孵育體系可以滿足CYP3A4酶抑制活性的評(píng)價(jià)及測(cè)定其他抑制劑IC50的要求。

34對(duì)rCYP3A4活性影響的初步篩選由表3可看出：黃連上清丸、牛黃解毒丸對(duì)CYP3A4 酶表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，護(hù)肝片對(duì)CYP3A4 酶表現(xiàn)出抑制作用。

4討論

CYP3A4肝臟和腸道重要代謝酶，含量可達(dá)到肝臟CYP450總量的60%，腸道CYP450總量的70%[9]，是藥物代謝的主角。中成藥說(shuō)明書中【藥物相互作用】欄均未見(jiàn)報(bào)道，只是簡(jiǎn)單書寫“如與其他藥物同時(shí)使用可能會(huì)發(fā)生藥物相互作用，詳情請(qǐng)咨詢醫(yī)師或藥師”。基于此，本研究對(duì)完善中成藥的說(shuō)明書有一定幫助作用，對(duì)臨床合理用藥提供參考性依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連上清丸、牛黃上清丸對(duì)CYP3A4有誘導(dǎo)作用，護(hù)肝片對(duì)CYP3A4有抑制作用，護(hù)肝片的IC50為4055g，因此在使用時(shí)，要考慮其潛在的藥物相互作用。

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（收稿日期：20160328）