轉(zhuǎn)化黃體酮菌株的篩選及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物研究*

羅莎莎，李衛(wèi)天，蔣　丹，蘇志偉，黃守瑞，冷　瀟△

1.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都　610083)；2.宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院(宜賓　644000)

轉(zhuǎn)化黃體酮菌株的篩選及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物研究*

羅莎莎1，李衛(wèi)天2，蔣丹1，蘇志偉1，黃守瑞1，冷瀟1△

1.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都610083)；2.宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院(宜賓644000)

【摘要】目的用微生物轉(zhuǎn)化的方法獲得新型的黃體酮類衍生物，對于相關(guān)新藥的研發(fā)至關(guān)重要。方法通過微生物轉(zhuǎn)化，利用薄層層析法(TLC)和硫酸顯色法跟蹤監(jiān)測，篩選能夠有效轉(zhuǎn)化黃體酮的菌株，然后通過硅膠柱層析法對發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振譜表征，確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果本研究篩選到了1株真菌，通過分子生物學(xué)鑒定其為Fusarium屬，該菌能夠完全轉(zhuǎn)化底物黃體酮，同時得到2種重要的藥物中間體：雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內(nèi)酯。結(jié)論本研究篩選得到的這株菌對大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內(nèi)酯具有潛在的應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】黃體酮；睪內(nèi)酯；雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮；薄層層析法

黃體酮(progesterone)，全稱4- 孕甾烯 -3,20- 二酮，又稱孕酮、孕烯二酮、助孕素等，是一種臨床常用孕激素類藥物。用生物轉(zhuǎn)化方法獲得黃體酮類衍生物是生產(chǎn)甾體藥物中間體的重要方法[1]。1952年，Murray和Peterson用黑根霉對黃體酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到了11α-羥基黃體酮，大大縮短了合成皮質(zhì)酮的步驟，解決了生產(chǎn)可的松等皮質(zhì)類藥物的原料來源這一最大難題[2]。目前，對黃體酮類衍生物的研究主要集中在C-11位和C-16位羥基化方向，而該化合物其他反應(yīng)類型在國內(nèi)外很少報道[3]，為此，本研究利用微生物對黃體酮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，以期獲得具有重要活性的新型衍生物。

1材料與方法

1.1菌株

本研究所用菌株為從成都動物園土壤中分離并保存的真菌菌株。

1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL、自然pH；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：葡萄糖25 g、黃豆粉10 g、酵母膏10 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鉀5 g、水1 000 mL、pH5.5。

1.3黃體酮轉(zhuǎn)化菌株篩選

挑選本實(shí)驗(yàn)室保存的50株有甾體轉(zhuǎn)化能力的真菌，于PDA培養(yǎng)基28～30 ℃活化5 d，制備孢子懸液。用10 mL無水乙醇溶解0.5 g 黃體酮，制成底物溶液。孢子懸液按5%的量接種發(fā)酵液，28 ℃，200 r/min，空氣搖床震蕩培養(yǎng)1 d， 加入0.5 g/L黃體酮底物溶液，28 ℃，200 r/min，震蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)化2 d。 投放底物溶液后，每隔12 h取1 mL發(fā)酵液，加入等體積三氯甲烷進(jìn)行萃取，薄層層析法(TLC)分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，展開劑為(乙酸乙酯∶三氯甲烷=8∶1，v/v)，然后噴灑顯色劑(硫酸∶甲醇=1∶10,v/v)，105 ℃干燥箱中，加熱3 min后，進(jìn)行觀察。

1.4菌株分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法，提取菌株的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]，擴(kuò)增采用的是1對真菌通用引物[5]，其中，上游引物的序列為：5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′，下游引物的序列為：5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′。 PCR反應(yīng)體系為50 μL： 基因組DNA 4 μL，上下游引物各1 μL， 2.5 mM dNTP mix 5μL，10×PCR 緩沖液5 μL， Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 33.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：1)94 ℃預(yù)變性5 min；2)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；3)72 ℃延伸7 min。用DL2000 DNA Marker作分子量標(biāo)記， 1.5%瓊脂糖電泳90 v進(jìn)行40 min，同時，將擴(kuò)增產(chǎn)物委托華大基因測序。

1.5黃體酮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化

投放底物溶液轉(zhuǎn)化2 d后，取出發(fā)酵液，等體積三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，得到晶體。用硅膠柱層析法純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，濕法上柱，將晶體用少量洗脫液溶解后上樣，控制流速為1 mL/min，部分收集器收集洗脫液，TLC法分析洗脫液，把Rf值相同的物質(zhì)合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，溶解后再進(jìn)行點(diǎn)樣，進(jìn)行硫酸顯色檢測，確保產(chǎn)物純度。

1.6生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

將純化產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜(TOF-MS)、紅外光譜(IR)和核磁共振譜(NMR)表征，同時，結(jié)合文獻(xiàn)[6]和實(shí)驗(yàn)室之前純化得到的黃體酮類衍生物光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1黃體酮轉(zhuǎn)化菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)室保存的50株真菌均為霉菌，初篩發(fā)現(xiàn)都能夠在以甾體類物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，所以，可能存在能有效轉(zhuǎn)化黃體酮的菌株。通過以黃體酮為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，TLC法和硫酸顯色法檢測轉(zhuǎn)化情況，篩選到有8株菌對黃體酮有轉(zhuǎn)化能力。

檢測結(jié)果表明，菌株1-2轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，轉(zhuǎn)化2 d后， 黃體酮完全降解，生成2種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，產(chǎn)量較高，便于后期純化，同時，其中1個產(chǎn)物的Rf值不同于實(shí)驗(yàn)室之前獲得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，可能是結(jié)構(gòu)比較新穎的衍生物。因此，本研究選擇1-2這株菌進(jìn)行研究(圖1)。

圖1TLC法分析菌株1-2轉(zhuǎn)化黃體酮

注：1、黃體酮標(biāo)品；2、菌株1-2轉(zhuǎn)化黃體酮情況

2.2菌株分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)1.4的方法，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增序列，同時，委托華大基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)該序列大小為542 bp，與預(yù)期大小相符(圖2)。其核苷酸序列如下：

TTCCTCTCGCCTTATTGATATGCTTAAGTT CAGCGGGTATTCCTACCTGATTCGAGGTCA ACTTCAGAAGAGTTGGGGGTTTTACGGCGT GGCCGCGCCGCTCTCCAGTCGCGAGGTGTTA GCTACTACGCGATGGAAGCTGCGGCGGGAC CGCCACTGTATTTGGGGGACGGCGTGTGCCC ACGGAGGGCCTCCGCCGATCCCCAACGCCAG GCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCT CGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCG GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT TCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG AGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAA TTTATTTGCTTGTTTTACTCAGAAGAAACA TTATAGAAACAGAGTTAGGGGGTCCTCTGG CGGGGGCGGCCCGTTTTCACGGGGCCGTCTG TTCCCGCCGAGGCAACGTTTAGGTATGTCA CAGGGTGATGAGTGTTAGTCCGTCCCA

通過將該序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源序列比對，發(fā)現(xiàn)該菌與Nectriahaematococca(Fusariumsolani的有性型)同源性為100%，因此，初步確定該菌為Fusarium屬，故命名為Fusariumsp.1-2。

2.3轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離及鑒定

通過TLC法和硫酸顯色法進(jìn)行定時跟蹤檢測，初步了解到該菌以黃體酮做底物的生物轉(zhuǎn)化過程(圖3)。轉(zhuǎn)化1 d時，產(chǎn)物 P-1出現(xiàn)，2 d時，P-1達(dá)到最大量，轉(zhuǎn)化率為72%， 同時產(chǎn)物P-2出現(xiàn)，轉(zhuǎn)化率為28%，此時黃體酮徹底降解。

圖2菌株1-2 PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

注：1、菌株1-2 PCR產(chǎn)物；2、DL2000 DNA Marker

圖3黃體酮生物轉(zhuǎn)化過程

將純化產(chǎn)物進(jìn)行TOF-MS、IR和NMR表征，得到表征數(shù)據(jù)如下：

P-1，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androst-1,4-dien-3,17-dione) mp 139～141 ℃;IR vmax (cm-1) 1 740, 1 656, 1 621, 1 601; TOF-MS m/z 285 [M+H]+,307 [M+Na]+,323 [M+K]+,591 [2M+Na]+;1H NMR (CDCl3) δ (ppm) 7.04 (1H,d,J = 10 Hz,H-1),6.24 (1H,dd,J = 10.2,1.9 Hz,H-2),6.09 (1H,s,H-4),0.95 (3H,s,H-18), 1.25 (3H,s,H-19)。

P-2，17同質(zhì)-氧雜-雄甾-1，4二烯-3，17二酮(17-oxa-homo-androst-1,4-diene-3,17-dione)；TOF-MS m/z 301.176 1 [M+H]+,323.162 3 [M+Na]+,339.136 4 [M+K]+;1H NMR (CDCl3) δ(ppm) 7.04 (1H,d,H-1),6.25 (1H,dd,H-2),6.09 (1H,s,H-4),1.22 (3H,s,H-19),1.39 (3H,s,H-18)。

代謝產(chǎn)物P-1的質(zhì)譜表明其分子量為284，結(jié)合碳譜(表1)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C19H24O2，且其1HNMR、13CNMR和IR數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)[6]報道完全一致。因此，確定產(chǎn)物P-1為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。

代謝產(chǎn)物P-2的質(zhì)譜表明其分子量為300，結(jié)合碳譜(表1)，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C19H24O3，且其1HNMR、13CNMR和IR數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)[6]報道完全一致，因此，確定化合物P-2為睪內(nèi)酯。

表1　黃體酮及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物NMR譜值

3討論

黃體酮生物轉(zhuǎn)化的研究過去主要集中在C-11位和C-16位等羥基化方向[7]，F(xiàn)usarium菌屬轉(zhuǎn)化黃體酮生成睪內(nèi)酯的相關(guān)報道很少。TLC法和硫酸顯色法跟蹤檢測結(jié)果表明，用菌株Fusariumsp.1-2轉(zhuǎn)化黃體酮，轉(zhuǎn)化1 d，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮生成，轉(zhuǎn)化2 d，黃體酮完全降解，同時發(fā)酵液中生成睪內(nèi)酯，根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生成順序，推測通過Fusariumsp.1-2的生物轉(zhuǎn)化酶系，黃體酮側(cè)鏈被降解，生成雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，并在C-17位生成酮基，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮再在C-17位的酮基旁引入氧，形成內(nèi)酯，該反應(yīng)為典型的Baeyer-Villiger反應(yīng)[8]。目前，霉菌中僅見到青霉屬菌對去氫表雄酮、孕烯醇酮和雄烯二酮進(jìn)行類似的反應(yīng)[9]。

用Fusariumsp.1-2轉(zhuǎn)化黃體酮，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內(nèi)酯2種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率分別約為72%和28%，產(chǎn)物產(chǎn)量較高，沒有檢測到副產(chǎn)物，便于后期純化。雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內(nèi)酯是重要的甾體藥物中間體，利用雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮能合成一些非常重要的激素類藥物，如口服避孕藥、蛋白同化激素和一些性激素[10]；睪內(nèi)酯作為芳香酶抑制劑，對于治療女性乳腺癌具有一定療效。因此，該菌對于甾體激素類藥物的生產(chǎn)具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力，有關(guān)利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內(nèi)酯的發(fā)酵條件的優(yōu)化還在進(jìn)一步研究中。

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Screening of Progesterone-transforming Strains and the Reaserch on Its Transformation Products

LuoShasha1,LiWeitian2,JiangDan1,SuZhiwei1,HuangShourui1,LengXiao1△.

1.CenterforScientificReseach,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,YibinCollege,Yibin644000,China

【Abstract】ObjectiveThe new progesterone derivatives obtained with the microbial transformation method are vital for the research and development of new drugs. MethodsTLC and Sulfuric acid methods were adopted to screen the strains which are capable of transforming progesterone with the help of microbial transformation. The silica gel column chromatography was used to purify the products in the fermented liquid, and mass spectrum, infrared spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum were employed to identify the structure of the purified products. ResultsA strain which could transform progesterone completely was screened and identified as Fusarium of Molecular biology identification. Two important intermediates of hormone drugs in the purified transformation products were aquired and identified as Androst-1,4-dien-3,17-dione and testolactone. ConclusionThe screened strain is of potential value in producing the two important intermediates of hormone drugs including Androst-1,4-dien-3,17-dione and testolactone in a lager scale.

【Key words】Progesterone; Testolactone; Androst-1,4-dien-3,17-dione; Thin layer chromatography

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.006

基金項(xiàng)目：＊國家大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(No:201513705041 )

通信作者：△冷瀟，E-mail:417470951@qq.com

【中圖分類號】Q939.9

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1555.028.html

·論著·