高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮的含量

俞　吉,朱裕林,朱　瑞,?！∪?李　宇,陳衛(wèi)東

(1.安徽省淮南市朝陽(yáng)醫(yī)院藥劑科，安徽 淮南　232001；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠　233004)

·方藥研究·

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮的含量

俞吉1,2,朱裕林3,朱瑞2,桑冉3,李宇2,陳衛(wèi)東2

(1.安徽省淮南市朝陽(yáng)醫(yī)院藥劑科，安徽 淮南232001；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠233004)

[摘要]目的 采用高效液相色譜法建立同時(shí)測(cè)定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮含量的方法。方法 采用Waters BEH130 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。結(jié)果 淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮分別在0.012 5～0.125 mg/mL(r=0.999 8)和0.005～0.15 mg/mL(r=0.999 6)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為99.69%和100.16%(n=6)，RSD分別為1.69%和1.43%(n=6)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為骨疏靈顆粒的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]骨疏靈顆粒；淫羊藿苷；β-蛻皮甾酮；高效液相色譜法；含量測(cè)定

骨疏靈是安徽中醫(yī)藥大學(xué)方朝暉教授繼承新安醫(yī)學(xué)醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)衰老基本病機(jī)理論研究基礎(chǔ)上，采用具有益氣、溫陽(yáng)、活血的淫羊藿、牛膝、黃芪、牡蠣組成的復(fù)方，其中淫羊藿為君藥，牛膝為臣藥[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》將淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮分別作為淫羊藿[2]67-68和牛膝[2]306-307的定性定量的指標(biāo)，且β-蛻皮甾酮的含量測(cè)定為《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版新增內(nèi)容。目前，有關(guān)二者的高效液相色譜法測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜法建立同時(shí)測(cè)定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮含量的方法，所測(cè)色譜峰與相鄰色譜峰均能得到良好的分離，對(duì)骨疏靈顆粒的質(zhì)量控制具有重要意義。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters 1525-2849高效液相色譜系統(tǒng)，Waters BEH130 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；R-100N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州市長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平：格特勒-托利多儀器有限公司；KQ-300B型超聲波清潔器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州市長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2試藥乙腈：天津市大茂化學(xué)試劑廠，色譜純；甲醇：Methanex，色譜純；純凈水：杭州娃哈哈飲料有限公司。骨疏靈顆粒：為安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)分別為160101、160102、160103；淫羊藿、黃芪、牛膝、牡蠣：均購(gòu)自亳州市藥材大市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉鶴齡教授鑒定均符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定；淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào) 110737-200415)、β-蛻皮甾酮對(duì)照品(批號(hào) 111638-201304)：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2方法與結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1對(duì)照品溶液的配制精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒質(zhì)量的淫羊藿苷、β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，各置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲處理20 min(功率200 W，頻率40 kHz)，配成淫羊藿苷濃度為0.25 mg/mL、β-蛻皮甾酮濃度為0.15 mg/mL的溶液，再分別吸取5 mL置10 mL量瓶中，得對(duì)照品混合溶液。

2.1.2供試品溶液的配制按照發(fā)明專利處方配比[3]，取淫羊藿飲片15 g，牛膝飲片12 g,黃芪飲片20 g，牡蠣飲片8 g。淫羊藿與牛膝以8倍(第1次多加3倍)70%乙醇回流提取3次，每次2 h；黃芪與牡蠣以8倍(第1次多加1.5倍)水煎煮2次，每次1 h。將醇提取藥液回收乙醇后與水提取液分別揮干濃縮，在減壓干燥箱以55 ℃，-0.09～-0.1 Mpa條件下干燥至恒質(zhì)量后混勻，取出標(biāo)記批號(hào)。上述操作重復(fù)操作3次，得批號(hào)為160101、160102、160103骨疏靈顆粒3批。

取自制骨疏靈顆粒約1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，精密加入純凈水定容，密塞，超聲處理20 min(功率200 W，頻率40 kHz)，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取過(guò)濾液即得。

2.1.3陰性樣品溶液取處方中除淫羊藿和牛膝外的其余藥材，按骨疏靈顆粒的工藝制備不含淫羊藿和牛膝的陰性對(duì)照制劑，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2色譜條件采用Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)溶液，運(yùn)行時(shí)間為45 min，平衡時(shí)間為15 min，柱溫30 ℃。梯度洗脫：0～20 min，17% A，83% B；20～22 min，17%→30% A，83%→70% B；22～38 min，30% A，70%→30% B；38～45 min，30%→17% A，30%→83% B。在上述條件下測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷、β-蛻皮甾酮分離度均大于1.5，且保留時(shí)間適宜，峰形良好。對(duì)照品、樣品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1，樣品色譜圖中色譜與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處有色譜峰，而陰性樣品無(wú)相應(yīng)峰，說(shuō)明樣品中其他成分對(duì)以上2個(gè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1β-蛻皮甾酮對(duì)照品(A)、淫羊藿苷對(duì)照品(B)、β-蛻皮甾酮與淫羊藿苷混合對(duì)照品(C)、供試品(D)、缺淫羊藿藥材

對(duì)照(E)、缺牛膝藥材對(duì)照(F)和缺淫羊藿和牛膝的陰性對(duì)照(G)的高效液相色譜圖(1.β-蛻皮甾酮；2.淫羊藿苷)

2.3線性關(guān)系考察按上述色譜條件，將淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品制成0.012 5、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL，β-蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品制成0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.15 mg/mL一系列濃度，依次進(jìn)樣。結(jié)果表明，淫羊藿苷在0.012 5～0.125 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=5×107x+114 499，r=0.999 8；β-蛻皮甾酮在0.005～0.15 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=3×107x-37 852，r=0.999 6。

2.4精密度測(cè)定精密吸取對(duì)照品混合溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，結(jié)果淫羊藿苷、β-蛻皮甾酮的RSD分別為0.26%和0.35% (n=6)，符合定量分析要求。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批樣品(批號(hào) 160101)，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，移取供試品溶液，依照高效液相色譜條件于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定2種成分的峰面積。結(jié)果淫羊藿苷、β-蛻皮甾酮在24 h內(nèi)的RSD分別為0.88%、0.91%、1.45%、1.69%、0.59%、0.71%、1.18%、0.51%，表明本樣品中各個(gè)組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，依照高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄2個(gè)活性成分的峰面積。結(jié)果淫羊藿苷、β-蛻皮甾酮的RSD分別為1.11%和0.98%，表示該方法重現(xiàn)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)先分別精密稱取淫羊藿苷5.21 mg和β-蛻皮甾酮對(duì)照品2.13 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，搖勻，制備混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。再精密稱取已知含量的樣品粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，加入2 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，按供試品溶液制備方法制備后，按上述色譜條件測(cè)定含量。計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8樣品測(cè)定按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣，測(cè)定3批樣品中淫羊藿甘和β-蛻皮甾酮的含量。結(jié)果批號(hào)為160101、160102、160103的3批樣品，淫羊藿苷含量分別為2.01，2.03，2.02 mg/g，β-蛻皮甾酮含量分別為0.59、0.54、0.58 mg/g。

3討論

3.1測(cè)定方法和儀器選擇高效液相色譜儀普及率高，利用該儀器建立骨疏靈顆粒中淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮含量測(cè)定方法，對(duì)儀器設(shè)備要求相對(duì)較低，較超高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜等儀器成本低，適用性廣。

3.2色譜條件的選擇目前未見(jiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于同時(shí)測(cè)定淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮含量的報(bào)道。在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)淫羊藿苷和β-蛻皮甾酮對(duì)照品進(jìn)行紫外掃描時(shí)，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷最大吸收峰為270 nm，β-蛻皮甾酮最大吸收峰為250 nm。但在具體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論選擇250 nm或者270 nm，均不能滿足對(duì)另一種物質(zhì)的含量測(cè)定，干擾較大，因此最終選取檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。同時(shí)經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，淫羊藿、牛膝單味藥材的含量測(cè)定所選用流動(dòng)相多為乙腈-水[4-5]，少數(shù)選用甲醇-水作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等作為流動(dòng)相的色譜圖，其中乙腈-0.1%磷酸溶液的色譜圖中淫羊藿苷峰形較好，但用于β-蛻皮甾酮測(cè)定時(shí)，其峰形較差。后經(jīng)多次優(yōu)化篩選，最終確定選用甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，按本試驗(yàn)選定的時(shí)間程序洗脫，β-蛻皮甾酮和淫羊藿苷色譜峰出峰時(shí)間適宜，與相鄰峰的分離度較好，且峰形對(duì)稱。

3.3提取方法的選擇骨疏靈顆粒提取工藝目前分為醇提和水提兩部分：淫羊藿、牛膝采用醇提工藝，該工藝中，以君藥淫羊藿的主要有效成分淫羊藿苷為含量測(cè)定及提取工藝優(yōu)化的指標(biāo)[6-7]，對(duì)牛膝的主要有效成分β-蛻皮甾酮并未作考察。2010版《中華人民共和國(guó)藥典》中提出使用正丁醇作為溶劑在超聲條件下提取牛膝藥材中β-蛻皮甾酮，也有學(xué)者以β-蛻皮甾酮為指標(biāo)通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化牛膝提取工藝[8]，其相應(yīng)β-蛻皮甾酮轉(zhuǎn)移率與本實(shí)驗(yàn)一致，證明骨疏靈顆粒提取工藝較為成熟。

牛膝中含有皂苷類、植物甾酮類、糖類、黃酮類等多種成分[9-12]，牛膝中甾酮類物質(zhì)可促進(jìn)骨樣細(xì)胞增殖[13]，這與《中華人民共和國(guó)藥典》以β-蛻皮甾酮作為懷牛膝的質(zhì)量控制指標(biāo)相一致。

牛膝在我國(guó)產(chǎn)地較多，四川、安徽、湖北、陜西等省均有生產(chǎn)，課題組早期曾選用安徽亳州產(chǎn)牛膝作為配伍藥材，但進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)其中β-蛻皮甾酮含量較低，且液相色譜分析后發(fā)現(xiàn)其他物質(zhì)含量較多。后經(jīng)鑒別，發(fā)現(xiàn)該牛膝藥材等級(jí)為四等，后又選用河南溫縣所產(chǎn)特級(jí)懷牛膝作為配伍藥材，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意，由此可見(jiàn)道地藥材的重要性。

4結(jié)語(yǔ)

骨疏靈是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，本研究采用高效液相色譜法對(duì)骨疏靈顆粒中淫羊藿苷、β-蛻皮甾酮采用梯度洗脫，進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。該方法樣品處理簡(jiǎn)便，方法準(zhǔn)確，可為骨疏靈制定檢測(cè)方法與治療標(biāo)準(zhǔn)提供參考價(jià)值。

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Simultaneous Determination of Icariin and β-Ecdysterone in Gushuling Granule by High-performance Liquid Chromatography

YUJi1,2,ZHUYu-lin3,ZHURui2,SANGRan3,LIYU2,CHENWei-dong2

(1.DepartmentofPharmacy,HuainanChaoyangHospital,AnhuiHuainan232001,China; 2.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 3.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,AnhuiBengbu233004,China)

[Abstract]Objective To establish the method of high-performance liquid chromatography (HPLC) for the simultaneous determination of icariin and β-ecdysterone in Gushuling Granule. MethodsHPLC was performed on a Waters BEH130 C18column (250 mm×4.6 mm, 3.5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid solution as the mobile phase for gradient elution at a detection wavelength of 260 nm. ResultsThe concentrations of icariin and β-ecdysterone showed a good linear relationship with the peak area within 0.0125-0.125 mg/mL (r=0.999 8) and 0.005-0.15 mg/mL (r=0.999 6), respectively. The average recovery rates were 99.69% and 100.16%, respectively (n=6), and the relative standard deviations were 1.69% and 1.43%, respectively (n=6). ConclusionThis method is simple, convenient, and accurate and has good repeatability, and it can provide an experimental basis for the quality control of Gushuling Granule.

[Key words]Gushuling Granule; Icariin; β-Ecdysterone; High-performance liquid chromatography; Determination

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1608085QH213)

作者簡(jiǎn)介：俞吉(1984-)，男，碩士研究生

通信作者：陳衛(wèi)東，anzhongdong@126.com

[中圖分類號(hào)]R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.024

(收稿日期：2015-12-01；編輯：張倩)