茶多酚對(duì)鉻脅迫玉米幼苗的修復(fù)作用

王 赫，黃 輝

(1. 天津市南開(kāi)中學(xué) 天津300090；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津300387)

茶多酚對(duì)鉻脅迫玉米幼苗的修復(fù)作用

王 赫1，黃 輝2

(1. 天津市南開(kāi)中學(xué) 天津300090；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津300387)

環(huán)境污染對(duì)人類的危害已成為全球焦點(diǎn)問(wèn)題之一，而重金屬污染則由于其危害嚴(yán)重、作用時(shí)間長(zhǎng)更引起人們的關(guān)注。以鉻污染為例，探討了茶多酚在抵消受重金屬脅迫的玉米幼苗生長(zhǎng)所產(chǎn)生的影響方面存在的潛在價(jià)值。采用水培方法，使玉米種子從萌發(fā)長(zhǎng)至二葉期時(shí)受鉻離子脅迫(0、10-5、10-4,mM 重鉻酸鉀)，再將 3個(gè)濃度下生長(zhǎng)的二葉期幼苗用水沖去培養(yǎng)液(即去掉重金屬作用)，每個(gè)濃度的幼苗重新分為兩組。對(duì)照組用清水繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用0.05%茶多酚水溶液繼續(xù)培養(yǎng)。25,d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。在一定濃度下，茶多酚會(huì)通過(guò)升高SOD和POD活性來(lái)抵御鉻脅迫，而鉻濃度超過(guò)一定閾值時(shí)茶多酚則失去該功能，因此在10-5,mM鉻脅迫的根部和10-4,mM鉻脅迫的莖葉，其SOD和POD活性出現(xiàn)升高情況。鉻脅迫時(shí)以及茶多酚修復(fù)時(shí)，玉米的POD、SOD同工酶表達(dá)均發(fā)生明顯變化。利用伊文思藍(lán)(evans blue)作為細(xì)胞活性染料, 檢測(cè)了脅迫處理后以及茶多酚修復(fù)后的細(xì)胞活性。結(jié)果顯示,不同濃度鉻的脅迫均造成了根和葉片細(xì)胞一定程度的傷害，而顯微成像也充分證實(shí)茶多酚修復(fù)作用的有效性。

玉米 鉻脅迫 茶多酚 同工酶

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，三廢排放，礦產(chǎn)開(kāi)發(fā)和 利用，污水灌溉以及農(nóng)藥、除草劑和化肥的使用等嚴(yán)重污染了土壤、水質(zhì)和大氣，導(dǎo)致環(huán)境惡化。各種工業(yè)(如冶煉、電鍍、采礦等)廢水和固體廢棄物的滲出液直接排入水體，致使水體中重金屬含量越來(lái)越高。鉻被稱為重金屬“五毒”之一，過(guò)量鉻可以直接或通過(guò)食物鏈危害人類健康，存在著嚴(yán)重的致癌、致畸作用。[1]

鉻通過(guò)運(yùn)輸必需元素(Fe、S、P)的載體以主動(dòng)運(yùn)輸形式被植物根部吸收并儲(chǔ)存于細(xì)胞液泡中，限制了其進(jìn)一步遷移。[2]當(dāng)環(huán)境中的重金屬數(shù)量超過(guò)某一臨界值時(shí)就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生一定的毒害作用。重金屬穿過(guò)植物細(xì)胞膜時(shí)，會(huì)脅迫植物產(chǎn)生過(guò)多自由基而導(dǎo)致氧化脅迫。引起蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子變性以及膜脂過(guò)氧化，從而對(duì)植物產(chǎn)生傷害。植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是植物適應(yīng)多種逆境脅迫的重要酶類，在清除自由基的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。[3]茶多酚可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)這些酶的活性而維持抗氧化系統(tǒng)的較高活性或含量，從而有效減少活性氧對(duì)葉綠素分子的過(guò)氧化損傷，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成或抑制其分解，緩解鉻對(duì)植物的污染脅迫，提高植物對(duì)鉻的耐受性，從而增強(qiáng)適應(yīng)重金屬逆境的能力。玉米屬C4植物，生長(zhǎng)迅速，生物量大，對(duì)多種環(huán)境因子的脅迫均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，是廣泛用于重金屬污染研究的重要農(nóng)作物。[4]本實(shí)驗(yàn)以玉米為實(shí)驗(yàn)材料，以鉻污染為例，探討了茶多酚在抵消受重金屬脅迫的玉米幼苗生長(zhǎng)所產(chǎn)生的影響方面存在的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)及處理

在30 cm白瓷盤鋪上3層紗布，將玉米均勻播撒其上，共3盤，每盤100粒。將含0、10-5、10-4,mM 重鉻酸鉀加入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，每天澆灌1次，使其保持濕潤(rùn)狀態(tài)，同時(shí)也保持重鉻酸鉀濃度恒定。處理 6,d后將出芽的種子移盆水培，15 d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。此時(shí)玉米幼苗已長(zhǎng)至二葉期。用水沖去 3種濃度下生長(zhǎng)的二葉期幼苗的培養(yǎng)液(即去掉重金屬作用)，每個(gè)濃度的幼苗重新分為兩組(每組設(shè)多個(gè)平行)。對(duì)照組用清水繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用0.05%茶多酚水溶液繼續(xù)培養(yǎng)。25 d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定前從盆中取出玉米幼苗，用蒸餾水清洗，表面殘留的水分用濾紙吸干，測(cè)定總鮮重。從根莖結(jié)合部將其分開(kāi)，再分別測(cè)定其鮮重。每個(gè)處理隨機(jī)選取10株幼苗平展，用直尺測(cè)量其根長(zhǎng)以及莖、葉長(zhǎng)。

1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定

將已稱好的樣本剪碎，放入研缽中，根據(jù)鮮重加入一定體積的100 mM 磷酸緩沖液(PBS)，pH=8.0，研磨成漿。實(shí)驗(yàn)中 10-5、10-4,mM 重鉻酸鉀處理的莖葉用10 mL PBS提取，其他樣本用5 mL PBS提取。倒入離心管中，在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下，離心15 min，分離上清液備用。

可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考瑪斯亮藍(lán)染色法。SOD酶活的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法。POD酶活的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。CAT酶活和抗壞血酸過(guò)氧化酶(APX)的測(cè)定采用紫外比色法。[5-6]

同工酶廣泛存在于生物界中，是功能相同但結(jié)構(gòu)不同的一組酶，它們主要由等位基因或不同基因位點(diǎn)編碼。由于其結(jié)構(gòu)中氨基酸序列或組成有差異，所以同工酶的電泳遷移率存在差異。同工酶的電泳圖譜可以從分子水平上反映出細(xì)胞所表現(xiàn)的明顯的種屬組織和發(fā)育階段的特異性，既是生理指標(biāo)，又是可靠的遺傳標(biāo)志。[7]

1.4 細(xì)胞活性的測(cè)定

采用伊文思藍(lán)染色法。其原理在于伊文思藍(lán)能夠與蛋白結(jié)合形成伊文思藍(lán)蛋白復(fù)合物。正常細(xì)胞膜不能透過(guò)伊文思藍(lán)，而當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，伊文思藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞并與蛋白結(jié)合，將其染成藍(lán)色。[8-9]

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法及作圖

采用 SPSS version 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作圖使用Microsoft Excel、PowerPoint。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)狀況

如圖1所示，不同鉻濃度處理時(shí)，鮮重、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)均低于對(duì)照，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后，鮮重、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)均高于對(duì)照。說(shuō)明在一定鉻濃度范圍內(nèi)脅迫的玉米幼苗，經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后其鮮重及生長(zhǎng)指標(biāo)有明顯改善。茶多酚有拮抗重金屬脅迫的作用。根據(jù) SPSS分析表明，與對(duì)照組相比茶多酚對(duì)被鉻脅迫的根的作用(只在0和10-5,mM鉻濃度脅迫下)有顯著差異(p<0.05)，對(duì)有無(wú)鉻脅迫的苗的作用均有顯著差異(p<0.05)。

圖1 不同鉻濃度對(duì)玉米鮮重的影響Fig.1 Effect of various chromium stresses on the average fresh weight of maize

2.2 生理生化指標(biāo)

2.2.1 可溶性蛋白含量

如圖2所示，根中的可溶性蛋白含量在不同鉻濃度脅迫下先升后降，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后均高于對(duì)照組。但葉中的可溶性蛋白含量在不同鉻濃度脅迫下持續(xù)升高，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后均高于對(duì)照組。根據(jù) SPSS分析表明，與對(duì)照組相比茶多酚對(duì)被鉻脅迫的根的作用有顯著差異(p<0.05)，對(duì)有無(wú)鉻脅迫的葉的作用均有顯著差異(p<0.05)。

圖2 不同鉻濃度對(duì)可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of various chromium stresses on concentrations of soluble protein

2.2.2 SOD酶的活性

如圖3所示，根中的SOD酶活性在不同鉻濃度脅迫下先升后降，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后，10-5,mM 明顯高于對(duì)照組。但葉中的 SOD酶活性在不同鉻濃度脅迫下持續(xù)升高，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后10-4,mM明顯高于對(duì)照組。根據(jù)SPSS分析表明與對(duì)照組相比茶多酚對(duì)被鉻脅迫的根和葉的作用均有顯著差異(p<0.05)。

圖3 不同鉻濃度對(duì)SOD酶活的影響Fig.3 Effect of various chromium stresses on the activity of SOD

2.2.3 POD酶的活性

如圖4所示，根中的POD酶活性在不同鉻濃度脅迫下先升后降，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后，只有10-5,mM 高于對(duì)照組，但整體均低于處理前。葉中的POD酶活性在不同鉻濃度脅迫下為下降趨勢(shì)，再經(jīng)0.05%的茶多酚處理后，只有 10-4,mM 高于對(duì)照組，但整體均低于處理前。根據(jù) SPSS分析表明與對(duì)照組相比茶多酚對(duì)被鉻脅迫的根和苗的作用均有顯著差異(p<0.05)。

圖4 不同鉻濃度處理的樣品POD酶活的比較Fig.4 Effect of various chromium stresses on the activity of POD

2.2.4 CAT酶的活性

如圖5所示，根中的CAT酶活性在不同鉻濃度脅迫下先升后降，再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后，先降后升，只有10-5,mM明顯低于對(duì)照組。葉中的CAT酶活性在不同鉻濃度脅迫下為先降后升趨勢(shì)，再經(jīng)0.05%的茶多酚處理后，先升后降。只有 10-5,mM 明顯高于對(duì)照組。根據(jù) SPSS分析表明，與對(duì)照組相比茶多酚對(duì)被鉻脅迫的根和葉的作用(只在10-5,mM鉻濃度脅迫下)有顯著差異(p<0.05)。

圖5 不同鉻濃度對(duì)CAT酶活的影響Fig.5 Effect of various chromium stresses on the activity of CAT

2.2.5 APX酶的活性

如圖6所示，根中的APX酶活性在不同鉻濃度脅迫后再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理，先升后降，加茶多酚的實(shí)驗(yàn)組均明顯低于對(duì)照組。葉中的 APX酶活性在不同鉻濃度脅迫再經(jīng) 0.05%的茶多酚處理后為先降后升趨勢(shì)，加茶多酚的實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對(duì)照組。根據(jù) SPSS分析表明，與對(duì)照組相比茶多酚對(duì)被鉻脅迫的作用均有顯著差異(p<0.05)，但對(duì)根的作用(只在10-4,mM鉻濃度脅迫下)有顯著差異(p<0.05)。

圖6 不同鉻濃度對(duì)APX酶活的影響Fig.6 Effect of various chromium stresses on the activity of APX

2.2.6 SOD同工酶的電泳圖譜(見(jiàn)圖7)

比較玉米根和葉中的 SOD同工酶的譜帶，條帶數(shù)量不同，說(shuō)明 SOD同工酶在不同器官中表達(dá)不同。在根中，前期鉻處理后，箭頭標(biāo)注的條帶10-5,mM處最亮；后期經(jīng)茶多酚對(duì)比處理后，箭頭標(biāo)注的條帶10-4,mM 處最亮。在葉中，前期鉻處理后以及后期經(jīng)茶多酚對(duì)比處理后，箭頭標(biāo)注的條帶亮度隨濃度升高而逐漸變亮。圓圈所示部位有新的條帶出現(xiàn)。圖譜顯示結(jié)果與SOD酶活性測(cè)定結(jié)果一致。

圖7 SOD同工酶譜及示意圖Fig.7 The zymogram and schematic diagram of SOD

2.2.7 POD同工酶的電泳圖譜(見(jiàn)圖8)

比較玉米根和葉中的 POD同工酶的譜帶，條帶數(shù)量不同，說(shuō)明 POD同工酶在不同的器官中表達(dá)不同。在根中，前期鉻處理后，箭頭標(biāo)注的條帶顏色隨濃度的升高而逐漸變淺；而后期經(jīng)茶多酚對(duì)比處理后，情況正好相反，箭頭標(biāo)注的條帶顏色隨濃度的升高而逐漸加深。圓圈所示部位有新的條帶出現(xiàn)。

在葉中，前期鉻處理后，箭頭標(biāo)注的條帶顏色隨濃度升高A條帶逐漸變淺，B條帶逐漸加深；后期經(jīng)茶多酚對(duì)比處理后，箭頭標(biāo)注的條帶的顏色均隨濃度的升高而逐漸加深。圓圈所示部位有新的條帶出現(xiàn)。圖譜顯示結(jié)果與POD酶活性測(cè)定結(jié)果一致。

圖8 POD同工酶譜及示意圖Fig.8 The zymogram and schematic diagram of POD

2.3 細(xì)胞活性指標(biāo)

2.3.1 玉米根的顯微圖像(見(jiàn)圖9)

前期鉻處理的玉米根部結(jié)構(gòu)在 10-4,mM 濃度下已明顯出現(xiàn)破損。而后期經(jīng)茶多酚處理后，損壞程度明顯減小，可見(jiàn)茶多酚的修復(fù)效果。

圖9 不同脅迫處理下玉米根的照片及細(xì)胞活性Fig.9 Pictures and cell viability in root of maize under different stresses

2.3.2 玉米葉片在不同脅迫條件下的伊文思藍(lán)染色情況

圖10 不同脅迫處理下玉米葉片的伊文思藍(lán)染色照片及細(xì)胞活性Fig.10 Evans blue dyeing pictures and cell viability in leaves of maize under different stresses

從圖 10中可以看到，前期葉片經(jīng)不同鉻濃度脅迫處理后，藍(lán)色染色區(qū)域隨著處理梯度增加而增大，染色深度也有一定程度的增加，尤其是輸導(dǎo)組織部位染色程度最深。然而后期經(jīng)茶多酚處理后，藍(lán)色染色區(qū)域明顯縮小，染色深度也變淺，可見(jiàn)茶多酚的修復(fù)效果。

3 結(jié) 論

茶多酚是茶葉中的多酚類物質(zhì)，來(lái)源廣泛且價(jià)格便宜。它沒(méi)有任何毒性，對(duì)人體有很多益處。例如，它是一種強(qiáng)抗氧化劑，可清除人體內(nèi)的自由基；還可以防止輻射損傷，已被應(yīng)用于減輕放療的不良反應(yīng)。同時(shí)，由于茶多酚具有多個(gè)酚羥基，與金屬有很強(qiáng)的配位絡(luò)合作用，使其形成沉淀從而消除重金屬污染。在一定濃度下，它還可以促進(jìn)植物抵抗重金屬污染的能力。由于這些特點(diǎn)，使茶多酚具備了可快速恢復(fù)土壤的農(nóng)業(yè)價(jià)值的特點(diǎn)，且該法價(jià)格便宜，具有一定的可行性。

植物體內(nèi)抗氧化酶可以清除活性氧，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)作為植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，在清除自由基方面發(fā)揮了重要作用。SOD、POD、CAT三者協(xié)調(diào)一致，共同完成活性氧類的清除。除了抗氧化酶系統(tǒng)之外，植物體內(nèi)還存在膜保護(hù)物質(zhì)，其中抗壞血酸是一種重要的膜保護(hù)物質(zhì)，抗壞血酸能清除多種活性氧，抑制不飽和脂肪酸氧化，防止降解，對(duì)穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)十分重要。因此，在重金屬脅迫條件下，植物體通過(guò)SOD、POD、CAT及其他抗氧化物質(zhì)清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

在沒(méi)有鉻脅迫的情況下，加入茶多酚會(huì)降低蛋白濃度以及抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性；而在10-5,mM 鉻脅迫下，茶多酚會(huì)使根和葉的蛋白濃度升高，同時(shí)對(duì)根部 SOD活性有明顯提升作用，未導(dǎo)致POD活性明顯變化，而 SOD是抗氧化第一道防線，其活性升高可明顯抵御鉻脅迫造成的氧化損傷，莖葉部分除 CAT活性升高外，其余與未加鉻時(shí)茶多酚對(duì)酶活性的影響一樣，其原因可能是大量鉻積累于根部，莖葉部分受的影響較小導(dǎo)致；在 10-4mM 鉻脅迫下，根部SOD與POD活性加茶多酚也呈下降趨勢(shì)，CAT活性不變，而莖葉部分SOD與POD活性呈上升趨勢(shì)，CAT活性也保持不變，其原因可能為：在一定濃度下，茶多酚會(huì)通過(guò)升高SOD和POD活性來(lái)抵御鉻脅迫，而鉻濃度超過(guò)一定閾值茶多酚失去該功能，因此在10-5mM鉻脅迫的根部和10-4mM鉻脅迫的莖葉部分，SOD和POD活性出現(xiàn)升高情況。

研究還發(fā)現(xiàn)，SOD同工酶以及POD同工酶的電泳圖譜顯示結(jié)果與SOD酶以及POD酶活性測(cè)定結(jié)果相一致。另外從玉米根的顯微成像以及玉米葉片在不同脅迫條件下的伊文思藍(lán)染色情況來(lái)看，也很好地佐證了這一點(diǎn)。重度鉻脅迫可造成根變軟以至于部分潰爛，推測(cè)細(xì)胞壁骨架和膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的傷害。[10]正常葉片具有很低的伊文思藍(lán)染色水平，受到不同濃度鉻脅迫后，玉米幼苗的全葉片染色水平均逐步上升，顯示了較好的重復(fù)性。重金屬脅迫后再經(jīng)茶多酚處理，染色水平均明顯降低，證明茶多酚的修復(fù)效果明顯?！?/p>

［1］ 徐衍忠，秦緒娜，劉祥紅.鉻污染及其生態(tài)效應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2002(25)：8-10.

［2］ Cervantes C，Garcia J C，Devars S，et al. Interactions of chromium with micro-organisms and plants[J]. FEMS Microbiol Rev，2001(25)： 335-347.

［3］ 姚慧，蔡慶生.緩解植物重金屬脅迫傷害的途徑及其機(jī)理[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(1)：144-147．

［4］ Liu D H，Wang M，Zou J H，et al. Uptake and accumulation of cadmium and some nutrient ions by roots and shoots of maize(Zea mays L.)[J]. Pak J Bot，2006，38(3)：701-709.

［5］ Anderson J V，Chevone J V，Hess J L. Seasonal variation in the antioxidant system of eastern white pine needles：Evidence for thermal dependence[J]. Plant Physio，1992(98)：501-508.

［6］ Lu Q T，Wen X G，Liu C M，et al. Photoinhibition and photoprotection in senescent leaves of field-grown wheat plants[J]. Plant Physiol Biochem，2003(41)：749-754.

［7］ 孫海燕，王利沙.八種大白菜過(guò)氧化物酶同工酶分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(5)：8-9.

［8］ Castro-Concha L A，Escobedo R M，Miranda-Ham M L. Measurement of cell viability in vitro cultures[J]. Methods Mol Biol.，2006(318)：71-76.

［9］ Ibla J C，Khoury J. Methods to assess tissue permeability[J]. Methods Mol. Biol，2006(341)：111-117.

［10］ 劉楠，林植芳. 用伊文思藍(lán)染色法檢測(cè)植物整體葉片的細(xì)胞活性[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2011，47(6)：570-574.

Effectiveness of Tea Polyphenols Repair on Chromium Stress on Maize Seedlings

WANG He1，HUANG Hui2
(1．Tianjin Nankai High School，Tianjin 300090，China；2．College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China)

The harm of the environmental pollution to human beings has become one of the world’s most concerned problems. Heavy metal pollution, for instance, has aroused extensive concerns due to their severity and long term harmness. In this paper, the potential value of tea polyphenols in offsetting the heavy metal stress on the growth of maize seedlings was studied by taking chromium pollution as an example. In order to get rid of the interference of other factors in the soil, maize seeds were cultivated in a liquid medium, which contains different concentrations of K2Cr2O7(0、10-5、10-4,mM). When the seeds grew into their three-leaf period, the seedlings were rinsed with clean water to get rid of the heavy metal. Seedlings of each concentration were divided into two groups. The control groups still cultivated seedlings in clean water while the experimental groups kept them in a 0.05% tea polyphenols aqueous solution. After 25 days, physiological parameters of seedlings were measured. At a certain concentration, tea polyphenols could resist chromium stress by increasing SOD activities and POD activities. However, when the chromium concentration exceeded a certain threshold, tea polyphenols lost its function. So the activities of SOD and POD in root and leave increased under the stress of 10-5,mM chromium. Under the chromium stress and tea polyphenols repair, the expression of POD’s isozymes and SOD’s isozymes significantly changed. The current study tested stress induced cell viability of intact leaves of stress treatment and tea polyphenols repair by evans blue method. The results showed that different types of stresses caused leaf and root cell damages to different degrees and microscopic images fully demonstrated the effectiveness of tea polyphenols repair.

maize；chromium stress；tea polyphenols；isozymes

Q945.78

A

1006-8945(2016)02-0043-06

2016-01-11