生長(zhǎng)溫度對(duì)不同生育期煙草淀粉代謝的影響

張建波金云峰王莎莎楊慧芹逄濤李軍營(yíng)崔明昆龔明

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650031）

生長(zhǎng)溫度對(duì)不同生育期煙草淀粉代謝的影響

張建波1金云峰1王莎莎1楊慧芹1逄濤2李軍營(yíng)2崔明昆1龔明1

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650031）

旨在明確不同溫度對(duì)煙草不同生育期淀粉代謝的影響，以云煙87為材料，通過(guò)人工氣候室模擬云南江川、貴州遵義和河南襄縣的氣溫條件，在煙草移栽-團(tuán)棵、團(tuán)棵-現(xiàn)蕾和成熟期進(jìn)行溫度處理，研究了不同溫度下不同時(shí)期煙草葉片中淀粉含量、酶活性的變化，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，隨煙株生長(zhǎng)發(fā)育階段的推進(jìn)，淀粉含量不斷增多，在成熟期含量達(dá)到最高。貴州遵義地區(qū)的溫度條件有利于移栽-團(tuán)棵期淀粉的積累和AGPase活性的升高；云南江川地區(qū)的溫度條件有利于團(tuán)棵-現(xiàn)蕾和成熟期淀粉含量的積累及AGPase、SSs活性的升高；河南襄縣的溫度條件淀粉積累較少。以上結(jié)果表明，溫度通過(guò)影響淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響相關(guān)酶活性的升降和淀粉的代謝和運(yùn)輸，最終影響煙葉風(fēng)格的形成。

煙草；生長(zhǎng)溫度；淀粉代謝；熒光定量PCR

煙草（Nicotiana tabacum L.）是以積累淀粉為主的粉葉類植物［1］。淀粉代謝是煙葉生長(zhǎng)和產(chǎn)質(zhì)形成過(guò)程中較基本的物質(zhì)代謝途徑之一，與煙葉品質(zhì)和風(fēng)格的形成密切相關(guān)。淀粉在煙草葉片細(xì)胞中的合成、積累、分解、轉(zhuǎn)化狀況，決定著烤后葉片內(nèi)部各種化學(xué)成分間的協(xié)調(diào)程度［2］。煙葉中淀粉含量及其轉(zhuǎn)化形成的糖含量的高低，直接影響煙葉燃吸的香吃味特性，是決定煙葉內(nèi)在和外觀品質(zhì)的重要因素［3］。初烤后煙葉殘留的淀粉是對(duì)煙葉色、香、味不利的化合物，一方面淀粉會(huì)影響燃燒速度和燃燒的完全性，另一方面淀粉在燃吸時(shí)會(huì)產(chǎn)生糊焦氣味，對(duì)煙氣產(chǎn)生不良影響［4-6］?？緹熓窍矞刈魑铮瑢?duì)溫度反應(yīng)敏感［3］。煙葉中的淀粉隨著煙葉生長(zhǎng)和成熟而逐步積累，積累程度也與溫度有直接聯(lián)系［7］。

目前，煙草淀粉代謝研究較多的主要集中在不同生態(tài)區(qū)、不同海拔條件下對(duì)淀粉含量及酶活性的影響［8-10］，而且多為整個(gè)生育期或某個(gè)生育期，而不同溫度對(duì)不同生育期煙草淀粉代謝的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取大田條件下正常生長(zhǎng)的煙草云煙87作為研究對(duì)象，通過(guò)精密控溫的人工氣候室分別模擬云南江川、貴州遵義和河南襄縣的氣溫條件，對(duì)烤煙生長(zhǎng)的3個(gè)時(shí)期（移栽-團(tuán)棵期、團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期、成熟期）進(jìn)行控溫試驗(yàn)，對(duì)不同溫度處理下煙葉及根系的淀粉代謝規(guī)律及基因表達(dá)進(jìn)行比較研究，旨在探討不同溫度對(duì)淀粉積累及香氣風(fēng)格形成的影響，以揭示不同生育期溫度與淀粉的動(dòng)態(tài)關(guān)系，為淀粉對(duì)煙葉品質(zhì)的影響提供理論基礎(chǔ)，并為建立煙葉特色的區(qū)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 選用由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的烤煙品種云煙87為試驗(yàn)材料。

1.1.2 材料培養(yǎng)與處理

1.1.2.1 育苗 采用漂浮育苗方式培育煙苗，移栽（行×株距，120 cm×50 cm）至黑桶（35 cm×40 cm，土壤類型為水稻土）后，置于云南玉溪研和基地室外生長(zhǎng)，田間管理按常規(guī)。實(shí)驗(yàn)在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，于2014年3月-12月進(jìn)行。

1.1.2.2 不同溫度處理 當(dāng)移栽至黑桶內(nèi)的煙苗分別長(zhǎng)至還苗10 d、團(tuán)棵期、現(xiàn)蕾期時(shí)，搬入精密人工氣候室進(jìn)行不同的溫度處理。分別取移栽-團(tuán)棵期、團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期、成熟期3個(gè)時(shí)期，設(shè)置的3個(gè)溫度分別模擬河南襄縣、云南江川和貴州遵義地區(qū)煙草栽培季節(jié)的氣溫特征（表1）。試驗(yàn)光強(qiáng)為200 μmol/（m2·s），濕度（夜晚40%，白天50%）、CO2濃度（450 ppm）。生長(zhǎng)溫度處理日變化見(jiàn)圖1。

1.1.2.3 樣品收集 將煙苗以自下而上第12片煙葉為研究對(duì)象（移栽-團(tuán)棵期以剛展開(kāi)的最大葉為研究對(duì)象），開(kāi)始不同溫度處理時(shí)計(jì)為0 d，之后采集時(shí)間見(jiàn)表1。取樣時(shí)，每次取3-5株煙草，將葉脈去掉后，取葉片中部的部分，剪碎并混勻，稱取0.3 g，用液氮速凍，每個(gè)處理的每一個(gè)測(cè)定指標(biāo)設(shè)3個(gè)重復(fù)。將葉片兩端的部分剪下，并去主脈，殺青，烘干，用于淀粉含量的測(cè)定。

表1 試驗(yàn)溫度設(shè)置

1.2 方法

1.2.1 淀粉含量的測(cè)定

1.2.1.1 樣品制備 按照我國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定煙葉產(chǎn)品的含水率并制備煙末。將煙葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后置于棕色瓶中密閉保存。

1.2.1.2 淀粉含量測(cè)定 淀粉含量的測(cè)定參照何其芳等［11］的方法。

1.2.2 淀粉代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定 淀粉合成相關(guān)酶（ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶）活性的測(cè)定參照程方民等［12］的方法；淀粉酶活性測(cè)定參照史宏志等［13］的方法。

1.2.3 淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)分析 采用Life Tech-nologies 公司的Trizol Reagent提取樣品組織總RNA。提取的RNA質(zhì)量由超微量分光光度計(jì)（Thermo Nandrop 2000C）檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)合格的RNA用寶生物（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

圖1 不同溫度的設(shè)置

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，按照寶生物（大連）有限公司的熒光定量分析試劑盒SYBR Premix Ex Taq II（Perfect RealTime）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，體系為：SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA模板2 μL，DEPC滅菌水6.8 μL，總體積20 μL。根據(jù)熔解曲線檢驗(yàn)引物特異性。引物序列見(jiàn)表2，基因編號(hào)和序列來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)云煙87的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板按照配比梯度稀釋方法稀釋成5倍、25倍、125倍、625倍和3 125倍5個(gè)梯度濃度。用篩選到的特異性引物和內(nèi)參基因β-actin作為引物，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)模板梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。在安捷倫Mx3005P型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照寶生物（大連）有限公司的熒光定量分析試劑盒SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用其自帶的軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，通過(guò)相對(duì)值分析淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)測(cè)定重復(fù)。試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析和Duncan多重比較，圖中小寫(xiě)字母表示P<0.05水平顯著差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Sigmaplot10.0作圖。

表2 煙草淀粉代謝相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR所用引物

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)不同生育期淀粉含量及相關(guān)酶活性的影響

淀粉是煙草葉片光合作用的直接產(chǎn)物，隨著煙葉的生長(zhǎng)而呈現(xiàn)逐步積累的過(guò)程。移栽-團(tuán)棵期葉片中的淀粉含量變化（圖2-A）顯示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉含量均不斷積累，在30 d達(dá)到最大積累量，且在整個(gè)處理期都表現(xiàn)為20℃<18℃<16℃。AGPase、SSs和SBE是合成淀粉的關(guān)鍵酶，AGPase能催化G-1-P 轉(zhuǎn)化為 ADPG，作為淀粉合成的直接底物，SSs能將 ADPG 的葡萄糖基轉(zhuǎn)移到以 α-1，4 糖苷鍵連接的葡聚糖的非還原性末端［14，15］。淀粉酶是能將淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖等一類小分子物質(zhì)，在淀粉的分解中起重要作用。移栽-團(tuán)棵期葉片中AGPase活性在均溫20℃和16℃下不斷升高，18℃下呈波動(dòng)上升，3個(gè)溫度均在30 d時(shí)活性達(dá)到最大（圖2-B）。SSs活性變化（圖2-C）表明，活性均為先升高后降低，且均在10 d達(dá)到最大。淀粉酶活性如圖2-D所示，都表現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)。

團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期葉片中淀粉含量變化（圖3-A）顯示，3個(gè)溫度下淀粉含量均不斷積累，均溫23 ℃的淀粉積累量大于均溫25℃和21℃。葉片中AGPase活性變化（圖3-B）表明，在3個(gè)溫度下活性均不斷升高，均在20 d時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)均溫23℃活性最高。SSs活性（圖3-C）在均溫25℃條件下不斷升高，在均溫23℃和21℃下先升高后降低，在10 d時(shí)達(dá)到最大。淀粉酶（圖3-D）在3個(gè)溫度下均不斷下降，20 d時(shí)活性最低。

成熟期葉片中淀粉含量變化（圖4-A）顯示，在整個(gè)處理期，3個(gè)溫度下淀粉含量均不斷升高，都表現(xiàn)為25℃<23℃<21℃。合成淀粉的相關(guān)酶AGPase活性（圖4-B）和SSs活性（圖4-C）在整個(gè)處理期均表現(xiàn)為均溫25℃<23℃<21℃，而分解淀粉的淀粉酶活性在整個(gè)處理期活性表現(xiàn)為均溫21℃<23℃<25℃（圖4-D）。

圖3 團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期溫度對(duì)煙葉淀粉含量（A）、AGPase（B）、SSs（C）和淀粉酶（D）活性的影響

2.2 溫度處理對(duì)不同生育期淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 ADPG焦磷酸化酶相關(guān)基因 移栽-團(tuán)棵期葉片中AGPase相關(guān)基因表達(dá)情況如圖5所示。AGPase-1在均溫20℃和18℃下表達(dá)量先升高后降低，20 d時(shí)達(dá)到最大；16℃下不斷上升，在30 d達(dá)到最大。AGPase-2在均溫20℃和16℃下的表達(dá)量為先升高后降低趨勢(shì)，在20 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，均溫18℃下波動(dòng)上升，在30 d達(dá)到最大。AGPase-3在均溫20℃和18℃下的表達(dá)量為先升高后降低趨勢(shì)，在20 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，均溫16℃下表達(dá)量不斷上升，30 d時(shí)達(dá)到最大。

團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期葉片中AGPase相關(guān)基因表達(dá)情況（圖6）顯示，AGPase-1在均溫25℃和23℃下表達(dá)量不斷降低，均溫21℃下先升高后降低，在處理10 d時(shí)達(dá)到最大。AGPase-2在3個(gè)溫度下的表達(dá)量均不斷升高，20 d達(dá)到最大。AGPase-3在均溫25℃下表達(dá)量不斷降低，23℃下先降低后升高，20 d達(dá)到最大；21℃下不斷升高，在20 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。

成熟期葉片中AGPase相關(guān)基因表達(dá)情況如圖7所示。AGPase-1在3個(gè)溫度下表達(dá)量急劇降低。AGPase-2在3個(gè)溫度下的表達(dá)量均先升高后降低，且25℃<23℃<21℃。AGPase-3也表現(xiàn)為25℃<23℃<21℃。

2.2.2 淀粉合成酶相關(guān)基因 移栽-團(tuán)棵期葉片中SSs相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果（圖8）顯示，SSs-1在3個(gè)溫度下表達(dá)量均為先升高后降低，20 d時(shí)達(dá)到最大；SSs-2在3個(gè)溫度下的表達(dá)量也為先升高后降低趨勢(shì)，均在10 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大；SSs-3在均溫18℃下的表達(dá)量較高。

圖4 成熟期溫度對(duì)煙葉淀粉含量（A）、AGPase（B）、SSs（C）和淀粉酶（D）活性的影響

團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期葉片中SSs相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果（圖9）顯示，SSs-1在均溫25℃和23℃下表達(dá)量不斷升高，在處理20 d時(shí)達(dá)到最大；均溫21℃下先升高后降低，在10 d時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量。SSs-2在均溫25℃和23℃下的表達(dá)量先降低后升高，25℃下的表達(dá)量均低于處理前的表達(dá)量，23℃的表達(dá)量在20 d達(dá)到最大；均溫21℃下表達(dá)量先升高后降低。SSs-3在均溫25℃下表達(dá)量先降低后升高，20 d時(shí)達(dá)到最大；21℃下表達(dá)量不斷降低。

成熟期葉片中SSs相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果（圖10）顯示，SSs-1在3個(gè)溫度下表達(dá)量均降低。SSs-2在3個(gè)溫度下均不斷升高，且都表現(xiàn)為21℃>23℃>25℃。SSs-3在均溫25℃和23℃下的表達(dá)量不斷升高，21℃下先升高后降低，同樣是21℃>23℃>25℃。

2.2.3 淀粉酶相關(guān)基因 移栽-團(tuán)棵期葉片中淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果（圖11）顯示，BMY-1在均溫20℃和16℃下表達(dá)量均低于0 d對(duì)照，均溫18℃在20 d表達(dá)量急劇升高，其他點(diǎn)表達(dá)量均低于0 d的表達(dá)量。BMY-2在3個(gè)溫度下的表達(dá)量均為先升高后降低趨勢(shì)，都在20 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。BMY-3在3個(gè)溫度下表達(dá)量的變化趨勢(shì)均為10 d時(shí)降低，20 d時(shí)升高，30 d時(shí)又降低。AMY在3個(gè)溫度下表達(dá)量均不斷升高。

團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期葉片中淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)情況（圖12）顯示，BMY-1在3個(gè)溫度下的表達(dá)量都急劇下調(diào)。BMY-2在均溫25℃和21℃下的表達(dá)量先升高后降低，在10 d時(shí)達(dá)到最大；均溫23℃下的表達(dá)量不斷升高，20 d時(shí)達(dá)到最大。BMY-3的變化趨勢(shì)與BMY-1相似，3個(gè)溫度下基因表達(dá)都受到抑制。AMY在3個(gè)溫度下的表達(dá)量也不斷降低。

成熟期葉片中淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果（圖13）顯示，BMY-1和BMY-3在3個(gè)溫度下的表達(dá)量都表現(xiàn)為先降低后升高。BMY-2的表達(dá)量在3個(gè)溫度下表現(xiàn)為先升高后降低，且均溫25℃>23℃>21℃。AMY在整個(gè)處理期也表現(xiàn)為均溫25℃>23℃>21℃，在均溫25℃下表達(dá)量先升高后降低；在均溫23℃和21℃下表達(dá)量先降低后升高。從3個(gè)溫度來(lái)看，均溫23℃下的表達(dá)量相對(duì)較高。

圖5 移栽-團(tuán)棵期溫度對(duì)葉片AGPase相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖6 團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期溫度對(duì)葉片AGPase相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

生態(tài)環(huán)境對(duì)煙葉品質(zhì)具有較大影響，豐富的生態(tài)環(huán)境形成了各具風(fēng)味的煙葉特色，植物淀粉的生物合成受到多因素的影響［16-18］。不同的溫度條件對(duì)煙草淀粉代謝有顯著影響。通過(guò)模擬河南襄縣、貴州遵義和云南江川氣溫條件的研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育期在3個(gè)溫度下煙草葉片和根系中的淀粉含量、相關(guān)酶活性及基因表達(dá)差異較大。

圖7 成熟期溫度對(duì)葉片AGPase相關(guān)基因表達(dá)的變化

圖8 移栽-團(tuán)棵期溫度對(duì)葉片SSs相關(guān)基因表達(dá)的影響

通過(guò)對(duì)不同時(shí)期不同溫度下淀粉含量研究比較發(fā)現(xiàn)，淀粉含量與溫度變化、不同發(fā)育期及不同器官有緊密聯(lián)系。在移栽-團(tuán)棵期，3個(gè)溫度下淀粉變化趨勢(shì)較一致，隨著煙草的發(fā)育過(guò)程而逐漸增加，在整個(gè)處理過(guò)程中均溫16℃下含量均較高；團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期淀粉含量趨于穩(wěn)定，升高幅度較小甚至個(gè)別溫度（均溫25℃）出現(xiàn)下降趨勢(shì)，在均溫23℃下含量較高；成熟期葉片中的淀粉含量在均溫21℃下高于另外兩個(gè)溫度。因此，在移栽-團(tuán)棵和團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期，貴州遵義地區(qū)的淀粉含量豐富，成熟期云南江川地區(qū)淀粉含量豐富，而河南襄縣地區(qū)在各個(gè)時(shí)期淀粉含量均較低。趙宸楠［19］對(duì)云南和河南烤煙比較研究發(fā)現(xiàn)，河南的淀粉含量在生長(zhǎng)前期高于云南，后期低于云南；王晶［20］的研究結(jié)果表明，河南煙葉的淀粉積累量更為豐富。本研究中成熟期的變化規(guī)律與趙宸楠的結(jié)果相似，但前期變化不同，可能是處理因素及取樣時(shí)間不一致所導(dǎo)致。

圖9 團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期溫度對(duì)葉片SSs相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖10 成熟期溫度對(duì)葉片SSs相關(guān)基因表達(dá)的影響

淀粉的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的生化調(diào)控過(guò)程，該過(guò)程由多個(gè)同工酶協(xié)同催化完成［14］。本研究結(jié)果顯示，各個(gè)時(shí)期淀粉的合成與降解在AGPase、SSs和Amylase的作用下維持動(dòng)態(tài)平衡。在移栽-團(tuán)棵、團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期，3個(gè)溫度下AGPase、SSs活性均低于成熟期的活性，而Amylase活性在成熟期較低，表明淀粉在生長(zhǎng)前期不斷被分解來(lái)提供生長(zhǎng)所需能量，到成熟期分解降低合成加快，最終使成熟期淀粉含量達(dá)到最高。這與張松濤等［21］的研究結(jié)果一致。

圖11 移栽-團(tuán)棵期不同溫度下葉片淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)的變化

圖12 團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期溫度對(duì)葉片淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖13 成熟期溫度對(duì)葉片淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

酶活性在不同溫度下差異很大，相關(guān)酶對(duì)溫度的響應(yīng)必將影響到淀粉的積累，而即使在同一溫度下，不同時(shí)期酶活性也不盡相同。Ridout等［22］的研究結(jié)果表明，煙草在較低溫度條件下AGPase活性較高，淀粉積累增多，呂艷梅等［23］研究發(fā)現(xiàn)，較高溫度影響AGPase活性，進(jìn)而抑制淀粉的積累。本研究也表明，在移栽-團(tuán)棵期、團(tuán)棵-現(xiàn)蕾期和成熟期均是較低溫度下AGPase活性較高。Keeling［24］等研究認(rèn)為，溫度升高SSs活性會(huì)顯著降低，不利于淀粉的生物合成，本研究中，在團(tuán)棵-現(xiàn)蕾和成熟期出現(xiàn)了相似的規(guī)律，即較低溫度下SSs活性較高，較高溫度下SSs活性較低。Amylase主要起分解淀粉的作用，蔡憲杰等［25］研究發(fā)現(xiàn)，Amylase活性隨溫度的升高而增加，在本研究中，團(tuán)棵-現(xiàn)蕾和成熟期的Amylase活性也是在較高的溫度下活性較高。

基因表達(dá)是物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)，淀粉代謝相關(guān)酶基因通過(guò)編碼淀粉代謝相關(guān)酶，從而控制淀粉的合成和分解，三者之間存在著密切的對(duì)應(yīng)關(guān)系?；虮磉_(dá)的升高或降低，其編碼合成的相關(guān)酶活性則會(huì)相應(yīng)地升高或降低，控制合成的淀粉含量也會(huì)相應(yīng)地增加或減少［26，27］。在不同的生態(tài)環(huán)境或采取不同的栽培措施，淀粉積累及淀粉合成關(guān)鍵酶活性會(huì)發(fā)生變化，淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化［28］。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，每個(gè)時(shí)期3個(gè)溫度下AGPase、SSs和Amylase相關(guān)基因表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)趨勢(shì)差異較大，基因表達(dá)情況可大致與酶活及淀粉含量對(duì)應(yīng)，同一個(gè)酶對(duì)應(yīng)的幾個(gè)基因在同一時(shí)期并不是同時(shí)高表達(dá)或低表達(dá)，各個(gè)同工酶基因在特定時(shí)期協(xié)調(diào)表達(dá)來(lái)控制酶活的升降，以維持淀粉代謝的動(dòng)態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬這3個(gè)地區(qū)的溫度來(lái)研究淀粉代謝的變化，希望從其中一個(gè)側(cè)面來(lái)解釋3個(gè)地區(qū)煙草香型風(fēng)格差異較大的原因，為探索煙葉風(fēng)格之間淀粉代謝的差異提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過(guò)模擬3個(gè)地區(qū)溫度條件發(fā)現(xiàn)，貴州遵義地區(qū)的溫度條件有利于移栽-團(tuán)棵期淀粉的積累；云南江川地區(qū)的溫度條件有利于團(tuán)棵-現(xiàn)蕾和成熟期淀粉含量的積累，總體而言，云南江川前高后低的溫度條件更有利于淀粉的積累。

［1］李統(tǒng)帥. 烘烤過(guò)程中煙葉淀粉顆粒結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的變化［D］.鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

［2］崔國(guó)民, 典瑞麗, 楊子娟, 等. 煙葉部位成熟度烘烤工藝對(duì)淀粉代謝的影響［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28（13）：259-263.

［3］張麗, 文俊, 陳金湘, 等. 乙烯利對(duì)烘烤過(guò)程中煙葉淀粉代謝關(guān)鍵酶的影響［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 41（10）：66-69.

［4］Weeks WW. Chemistry of tobacco constituents influences flavor and aroma［J］. Rec Adv Tob Sc, 1985, 11：175-200.

［5］段麗斌, 崔國(guó)民, 趙昶靈, 等. 烤煙烘烤中煙葉淀粉降解的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29（18）：180-186.

［6］何其芳, 李榮華, 郭培國(guó), 等. 煙葉中淀粉含量測(cè)定方法的比較［J］. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28（2）：229-232.

［7］韓錦峰. 煙草栽培生理［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003.

［8］張松濤, 楊永霞, 滑夏華, 等. 不同生態(tài)區(qū)煙葉淀粉生物合成動(dòng)態(tài)比較研究［J］. 農(nóng)藝與調(diào)制, 2012, 18（4）：31-34.

［9］楊永霞, 石冰瑾, 王霄龍, 等. 不同海拔高度的烤煙淀粉合成動(dòng)態(tài)研究［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 38（1）：22-26.

［10］李自強(qiáng), 劉新民, 董建新, 等. 羅平縣海拔高度和土壤類型與煙葉化學(xué)成分的關(guān)系［J］. 中國(guó)煙草科學(xué), 2010, 31：44-48.

［11］何其芳, 李榮華, 郭培國(guó), 等. 煙葉中淀粉含量測(cè)定方法的比較［J］. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28（2）：229-232.

［12］程方民, 蔣德安, 吳平, 等. 早秈稻籽粒灌漿過(guò)程中淀粉合成酶的變化及溫度效應(yīng)特征［J］. 作物學(xué)報(bào), 2001, 27（2）：201-206.

［13］史宏志, 韓錦峰, 趙鵬. 不同氮量與氮源下烤煙淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶活性動(dòng)態(tài)變化［J］. 中國(guó)煙草科學(xué), 1999, 3：5-8.

［14］Tetlow IJ, Morell MK, Emes MJ. Recent developments in understanding the regulation of starch metabolism in higher plants［J］. J Exp Bot, 2004, 55（406）：2131-2145.

［15］陳國(guó)清, 陸大雷, 陸衛(wèi)平. 玉米胚乳淀粉合成研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30（33）：8-15.

［16］史宏志, 韓錦峰, 遠(yuǎn)彤, 等. 紅光和藍(lán)光對(duì)煙葉生長(zhǎng)、碳氮代謝和品質(zhì)的影響［J］. 作物學(xué)報(bào), 1999（2）：215-220.

［17］韓錦峰. 煙草栽培生理［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003：151-156.

［18］黃國(guó)文, 陳良碧. 干旱對(duì)上部煙葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的影響［J］. 生命科學(xué)研究, 2004（2）：183-187.

［19］趙宸楠. 河南和云南烤煙碳氮代謝比較研究［D］. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011：30-34.

［20］王晶. 不同生態(tài)區(qū)煙葉碳水化合物合成及積累規(guī)律的比較研究［D］. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013：33-34.

［21］張松濤, 楊永霞, 滑夏華, 等. 不同生態(tài)區(qū)煙葉淀粉生物合成動(dòng)態(tài)比較研究［J］. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào), 2012, 8（18）：31-39.

［22］Ridout JW, Raper CD, Jr GS, et al. Changes in ratio of soluble sugars and free amino nitrogen in the apical meristem during floral transition of tobacco［J］. Int Plant Sci, 1992, 153：78-88.

［23］呂艷梅, 譚偉平, 肖層林, 等. 高溫對(duì)優(yōu)質(zhì)水稻籽粒淀粉形成及淀粉合成相關(guān)酶活性的影響［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2014, 29（1）：135-139.

［24］Keeling PL, Bacon PJ, Holt DC. Elevation temperature reduce starch deposition in wheat endosperm by reducing the activity of soluble starch synthase［J］. Planta, 1993, 191：341-348.

［25］蔡憲杰, 尹啟生, 王信民, 等. 烘烤過(guò)程中溫濕度對(duì)烤煙淀粉酶活性的影響［J］. 煙草科技, 2006, 12：43-45.

［26］Shannon JC, Pien FM, Cao HP, et al. Brittle-1, an adenylate translocator, facilitates transfer of extraplastidial synthsized ADP-glucose into amylopasta of maizes endosperms［J］. Plant Physiology, 1998, 117：1235-1252.

［27］Hurkman WJ, McCue KF, Altenbach SB, et al. Effect of temperature on expression of genes encoding enzymes for starch biosynthesis in developing wheat endosperm［J］. Plant Science, 2003, 164：873-881.

［28］姜慧娟, 趙銘欽, 劉鵬飛, 等. 烤煙香型劃分及質(zhì)量特征研究進(jìn)展［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012（12）：1628-1632.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Different Temperature on Starch Metabolism in Different Growth Stages of Tobacco（Nicotiana tabacum）

ZHANG Jian-bo1JIN Yun-feng1WANG Sha-sha1YANG Hui-qin1PANG Tao2LI Jun-ying2CUI Ming-kun1GONG Ming1
（1. School of Life Sciences，Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy of Ministry of Education，Yunnan Normal University，Kunming 650500；2. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences，Kunming 650031）

In order to clarify the effects of different temperatures on starch metabolism in different growth stages of tobacco，using Yunyan 87 as material growing in artificial climate chamber to simulate the different climates（Jiangchuan in Yunnan，Zunyi in Guizhou，and Xiang in Henan）in the stages of transplanting to resettling，resettling to squaring，and mature，we studied the effects of growth temperature on tobacco starch content and enzyme activity，and detected the expression changes of genes related to starch metabolism by RT-PCR. The results showed that，the starch content increased with the continuous growth of tobacco，and achieved the highest in the stage of mature. The temperature of Zunyi in Guizhou was beneficial to the accumulation of starch and the AGPase activity increased in the stage of transplanting to resettling. The temperature of Jiangchuan in Yunnan was conducive to the accumulation of starch content and the activities of AGPase and SSs raised in the stages of resettling to squaring and mature. The starch accumulation under the temperature of Xiang in Henan in any stage was little. The above results indicated that the temperature ultimately determined the formation of tobacco leave style by impacting the genes expressions of genes related to starch metabolism，thereby affecting the activities of related enzymes，as well as the metabolism and transport of starch.

tobacco；growth temperature；starch metabolism；Real-time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.027

2015-05-15

國(guó)家煙草專賣局科技專項(xiàng)［110201101003（TS-03）］

張建波，女，碩士研究生，研究方向：植物生理生化；E-mail：326088720@qq.com

龔明，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物逆境生物學(xué)；E-mail：gongming63@163.com