不同窖齡窖泥微生物群落結構與理化指標的相關分析

鐘姝霞 鄧杰 衛(wèi)春會 羅惠波 萬世旅 黃治國

（四川理工學院 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，自貢 643000）

不同窖齡窖泥微生物群落結構與理化指標的相關分析

鐘姝霞 鄧杰 衛(wèi)春會 羅惠波 萬世旅 黃治國

（四川理工學院 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，自貢 643000）

旨在研究不同窖齡窖泥中主要微生物群落結構的多樣性和窖泥理化指標（pH、總氮、腐殖酸、有效磷和總酸）的變化規(guī)律，并進行了相關性分析。采用凱氏定氮等方法對理化指標進行測定，通過DGGE技術研究微生物群落結構的變化，結合SPSS軟件對其相關性進行分析。結果表明，隨著窖齡的增加，窖泥的pH基本沒有變化，總酸呈緩慢下降的趨勢，總氮先上升后下降，腐殖酸和有效磷都緩慢增加；細菌和古菌的多樣性指數(shù)分別在1.62-2.58和1.79-2.33之間，并都隨著窖齡的增加而逐漸增加；細菌的群落結構與腐殖酸、總酸、有效磷的相關系數(shù)分別為0.972（P＜0.01）、-0.987（P＜0.01）、0.878（P＜0.05），古菌的菌落結構與腐殖酸、總酸、有效磷的相關系數(shù)分別為0.986（P＜0.01）、-0.954（P＜0.05）、0.901（P＜0.05），其他指標的相關性不顯著；選取細菌中11個優(yōu)勢條帶割膠測序發(fā)現(xiàn)大多數(shù)都為桿菌，選取了古菌4個優(yōu)勢條帶割膠測序發(fā)現(xiàn)均為產(chǎn)甲烷菌。窖泥的理化指標和微生物群落結構隨窖齡的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，而部分理化指標與微生物群落結構有極強的相關性，這些指標對窖泥微生物馴化有極大的關系。

窖泥；PCR-DGGE；群落結構；相關性分析

濃香型白酒的生產(chǎn)是以窖池作為容器，以黃水為介導，酒醅、大曲、窖泥中的復雜微生物區(qū)系統(tǒng)進行著更迭和復雜的物質能量代謝［1］。窖池中的微生物群落和物理因子相互作用、彼此影響共同構成了窖池特殊的微生物群落結構［2］。在發(fā)酵過程中，隨著窖泥窖齡的增長，窖內理化指標呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化，同時窖泥微生物經(jīng)過長期的馴化，其中優(yōu)勢菌群呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)，形成獨有的微生物群落，進而使窖池中微生物群落結構發(fā)生相應的改變，并且在此過程中形成的豐富的代謝產(chǎn)物構成了濃香型白酒酒體，使其具有獨特的風味特征［3］。

目前除了傳統(tǒng)方法如分離、純化、鏡檢、理化特性研究外，諸多基因工程、生物化學技術、分子生物學等方法被引入微生物群落研究中來。近年來PCR-DGGE［4，5］技術的運用愈加成熟［6-10］，如俠小虎等［11］對利用PCR-DGGE技術研究窖泥微生物的電泳條件進行優(yōu)化和探討，陶勇等［12］采用PCRDGGE技術研究了窖泥細菌群落結構演替及其與環(huán)境因子的相關性。在白酒窖內微生物研究中，該技術準確、直觀、檢測速度快，較好地反映樣品的微生物群落結構，但總體來說，利用PCR-DGGE系統(tǒng)研究窖泥微生物群落結構與其理化指標的相關性研究相對較少。本研究以不同窖齡的窖泥為樣本，借助連續(xù)流動化學分析儀和PCR-DGGE基因指紋分析技術，利用SPSS軟件將不同窖齡窖泥的微生物多樣性與其理化指標進行相關性分析，得到其規(guī)律，并利用這些規(guī)律對菌落中優(yōu)勢菌進行選擇，擇優(yōu)選取條帶進行測序研究，以了解不同窖齡窖泥微生物群落的變化趨勢和特殊菌群的存在狀態(tài)，以期給白酒生產(chǎn)提供理論指導和技術支持，利于中國濃香型白酒的長遠發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 窖泥樣品分別采自瀘州、宜賓和邛崍地區(qū)，包括5年、30年、50年、100年和200年。于窖壁下層（距窖底50 cm）和窖底（窖池底部）分別取樣混合，迅速置于冰盒運回，-20℃保藏。

1.1.2 主要試劑 酒石酸鈉、阿拉伯膠、氯仿、碘化汞、碘化鉀、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲基酚綠、氯化銨、氯化鉀、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉，以上均為分析純；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL2000TMDNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；瓊脂糖、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺（Solarbio）；引物由上海英濰捷基生物技術公司合成。

1.1.3 主要儀器 連續(xù)流動化學分析儀（Micro-CFA，美 國Astoria Pacific International）；PCR儀（ 美 國Bio-Rad公司My cycle）；DGGE電泳儀（美國 Bio-Rad公司Dcode）；高速冷凍離心機（德國 Hettich 公司 UNIVERSAL 32R）；凝膠成像系統(tǒng)（美國 SIM公司 Bio-Best200E）；半自動凱氏定氮儀（丹麥福斯集團公司 FOSS2200）；電熱鼓風干燥箱（北京北方利輝試驗儀器設備有限公司 DHG-9070A）；紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司 UV-2400）；通用型恒壓恒流電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；gel caster及PowerPac Basic Power Supply（美國 Bio-Rad公司）；可調式混勻儀（美國賽洛捷克MX-S）。

1.2 方法

1.2.1 理化指標的測定方法 有效磷采用連續(xù)流動分析儀測定；總氮采用凱氏定氮法檢測；腐殖酸在波長420 nm下采用直接提取比色法測定；用pH計測定pH值；以酚酞為指示劑，采用滴定的方法測定總酸。

1.2.2 微生物群落結構檢測方法

1.2.2.1 樣品總DNA提取和檢測 采用SDS-酚抽提法［13］和DNA純化試劑盒相結合的方法提取、純化窖泥中微生物總宏基因組，再利用核酸儀檢測純化后的窖泥DNA溶液的濃度和純度。

1.2.2.2 PCR擴增 細菌擴增選用通用引物968GCF-1401R，擴增出470 bp左右的片段，采用50 μL體系，其PCR反應程序為：Touch Down PCR：94℃ 4 min；94℃ 10 s，64℃ 20 s，72℃ 40 s，每兩個循環(huán)溫度降1℃20個循環(huán)；54℃ 15個循環(huán)；72℃ 10 min。

古菌擴增先使用上游引物ARCH46F與下游引物ARCH1017R進行擴增，再以其PCR產(chǎn)物為模板，使用上游引物PARCH344F與下游引物UNIV522R進行嵌套式PCR擴增，兩輪均采用50 μL體系。第一輪程序為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃-53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，20個循環(huán)；94℃ 1 min，52℃ 1.5 min，72℃ 1 min，5個循環(huán)；72℃ 10 min。第二輪程序為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃-53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，20個循環(huán)；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，5個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物的檢測 取5 μL PCR擴增產(chǎn)物加入1 μL 6×loading buffer混勻，取3 μL DL2000TMDNA Marker做對照。1%瓊脂糖凝膠140 V電泳25 min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。

1.2.2.4 DGGE技術 對上述PCR擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍為50%-70%。在120 V、60℃條件下電泳12.5 h，用銀染液染色30 min，拍照保存DGGE圖譜。

1.2.2.5 測序 選取目標條帶，利用丙烯酰胺凝膠回收劑盒回收目的條帶DNA，對回收的DNA進行PCR擴增，引物選用無GC夾子引物，擴增條件同1.2.2.2。選用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit對擴增DNA進行純化，隨后將DNA片段連接到T載體上，利用大腸桿菌 E. coli DH5α感受態(tài)轉化。各樣品挑選克隆得到的白色菌落3個送至上海英濰捷基測序，引物為344f-522r。測序結果在GenBank上進行比對，確定對應條帶種屬信息。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 通過Quantity One分析軟件對DGGE圖譜進行分析，對數(shù)據(jù)進一步分析得到Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，可反映出群落種類和均勻度。通過SPSS分析窖泥中理化因子（pH、總氮、腐殖酸、有效磷和總酸）和微生物多樣性之間的相關性，分析物理因子對微生物群落的影響。

2 結果

2.1 理化指標檢測結果

本實驗研究了不同窖齡的窖泥中pH、總氮、腐殖酸、總酸和有效磷的變化規(guī)律，結果發(fā)現(xiàn)：隨著窖齡的增加，總氮呈先上升后下降的趨勢（圖1），這是由于在封閉的環(huán)境中窖泥中的無機類氮在不斷的利用過程中并不能得到對等的補充；窖泥中腐殖質含量是作為窖泥老熟程度的重要指標之一，而腐植酸是腐殖質中最為重要的組成成分，隨著窖齡的增加，腐殖酸含量有著緩慢增加的趨勢（圖1），窖泥年份不同，腐植酸結構與含量也會出現(xiàn)不同的分布；有效磷的含量隨窖齡增加，并無明顯規(guī)律，除50年窖齡較低，百年窖齡的含量明顯高于其他3個窖齡，其中含量最高的為100年窖齡的老窖（圖2）；pH在5-7之間呈中性偏酸，隨著窖齡的增加，pH基本沒有變化，保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)（圖3），弱酸性的pH值是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，有利于己酸和乙酸乙酯的生成；而總酸與pH值呈反相關關系，總酸隨窖齡的增加，呈緩慢下降的趨勢（圖4），窖泥中若乳酸含量過高會導致己酸乙酯含量下降，加快窖泥老化速度。

圖1 總酸、總氮和腐殖酸含量的變化曲線

圖2 有效磷含量的變化曲線

2.2 微生物群落結構檢測結果

核酸蛋白儀測定 DNA濃度的結果表示所提取DNA 的A260/A280值均在為 1.8-2.0 之間。用相應的引物對窖泥中細菌16S rDNA和古菌16S rDNA進行擴增，獲得470 bp和180 bp左右的片段（圖5），符合引物設計的片段。

圖3 pH的變化曲線

圖4 總酸的變化曲線

圖5 窖泥細菌（A）和古菌16S rDNA（B）PCR擴增結果

圖6 窖泥細菌（A）和古菌（B）DGGE電泳條帶位置比較圖

對PCR產(chǎn)物進行DGGE電泳分析，結果（圖6）表明，細菌的豐度值在9-22之間，隨著窖齡的增加其豐度值也有所增加；第5、8、10號條帶在所有樣品中均有檢出，且優(yōu)勢度較高，均在2%以上，表明這些條帶所代表的細菌類群在窖池微生物中占有絕對優(yōu)勢；進一步分析可知細菌多樣性指數(shù)在1.62-2.58之間，并隨著窖齡的增加而逐漸增大，窖池內細菌類微生物體系逐漸達到穩(wěn)定。古菌的豐度值在13-17之間，隨窖齡的增加呈逐漸增大的趨勢；其多樣性指數(shù)在1.79-2.33之間，隨窖齡的增加而緩慢增大，變化趨勢較小，表明窖池內古菌類微生物體系已趨于穩(wěn)定（圖7）。同時，這一系列數(shù)據(jù)也表明隨著窖池窖泥在不斷延續(xù)的發(fā)酵過程中慢慢馴化，其微生物群落結構也逐漸豐富而達到動態(tài)的平衡。

圖7 窖泥細菌和古菌多樣性指數(shù)的變化規(guī)律

2.3 測序結果

從細菌DGGE電泳圖譜選取了11個優(yōu)勢條帶進行切膠回收，測序結果在NCBI上進行比對，其相似率大于97%，比對結果顯示11個條帶所代表的細菌大多數(shù)分為兩類，一類為Clostridiales，另一類為Bacillales，它們同屬為厚壁菌門（Firmicutes），其中包括了常見的芽孢桿菌、梭菌等。7號條帶為Uncultured bacterium，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9），結果表明，13號與10號條帶序列和Lactobacillus acetotolerans strain相似菌株聚為一個種族，同源性為83%。8號條帶序列和Bacillus subtilis聚為一類，同源性為88%。14號條帶序列和Clostridium sartagoforme聚為一類，同源性為100%。10號條帶序列和Lactobacillus acetotolerans聚為一個種族，同源性為97%。

從古菌DGGE電泳圖譜選取了4個優(yōu)勢條帶進行切膠回收，其測序結果比對后，相似率基本上大于97%，比對結果顯示4個條帶所代表的古菌都是產(chǎn)甲烷菌，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），可發(fā)現(xiàn)13號條帶序列和Methanosarcina siciliae strain相似菌株聚為一個族群，同源性為95%。15號條帶序列與Methanoculleus bourgensis strain相似菌株聚為一個種族，同源性為98%，這類產(chǎn)甲烷菌在濃香型白酒窖池窖泥中所占比例為4.2%。14號條帶序列和11號條帶序列與Methanospirillum hungatei聚為一類，同源性分別為97%和99%。

圖8 以16S rDNA序列為基礎的古菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.4 理化指標和微生物群落的相關性

通過SPSS軟件對窖泥理化指標和微生物多樣性進行了方差分析，找出這些因素之間的相互關系，結果（表1）顯示，細菌多樣性與總酸呈極顯著的負相關，而與腐殖酸呈極顯著的正相關。這是由于腐植酸是窖池窖泥中微生物極易利用的一類營養(yǎng)物質，而且腐植酸對于窖池窖泥的老熟有著重要影響，因此腐植酸是窖池內環(huán)境因素中影響窖池內微生物發(fā)展最為重要的一個。同時，細菌多樣性與有效磷也有顯著的相關性，這說明了營養(yǎng)物質對微生物的影響在任何環(huán)境中都是顯著的。對于古菌，僅與腐殖酸呈極顯著的正相關，與有效磷、總酸呈顯著的相關性，其他的指標相關性不顯著。

3 討論

窖池作為濃香型白酒發(fā)酵的容器，對優(yōu)質白酒生產(chǎn)有著重要的作用。本實驗研究了濃香型白酒窖池不同窖齡窖泥中主要微生物群落結構的多樣性和窖泥理化指標（pH、總氮、腐殖酸、有效磷和總酸）的變化規(guī)律，掌握了它們之間相互作用的關系。其中細菌和古菌的多樣性指數(shù)的變化規(guī)律與腐殖酸一致，隨著窖齡的增加而增大，與總酸的變化規(guī)律相反，這是由于腐殖化程度的高低對窖泥老熟程度有一定的影響［14］，腐殖酸中含有的維生素B1、B2、B6等營養(yǎng)物質，有益于微生物的生長、繁衍。老化的窖泥中活菌數(shù)明顯下降［15，16］，如己酸菌的數(shù)量在400萬個/g以下，放線菌在35萬個/g以下，其與旺盛窖泥中活菌數(shù)相差近10倍，功能菌數(shù)量不足，比例不協(xié)調。在總酸中乳酸占有較大的比重，其含量會隨著總酸含量的增大而增大，而乳酸含量過高時會抑制己酸菌的生長，影響己酸乙酯的產(chǎn)量，加快窖泥的老化速度，從而影響微生物的生長。這說明隨著窖池窖泥的不斷延續(xù)的發(fā)酵過程中，窖泥的理化指標不斷的變化，對微生物的生長有重大影響，同時微生物群落結構的演替，也影響窖池窖泥的發(fā)酵過程。

圖9 以16S rDNA序列為基礎的細菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖

表1 窖泥理化指標與微生物多樣性的相關性

經(jīng)對優(yōu)勢條帶進行割膠測序，本研究所得到的6株菌株，通過鑒定發(fā)現(xiàn)它們聚為5個類群，分別為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。其中，Methanosarcina siciliae strain菌株是發(fā)酵過程中最重要的產(chǎn)甲烷菌群，這類菌株可以通過乙酸營養(yǎng)途徑等多種途徑，利用乙酸、CO2、甲醇等產(chǎn)生甲烷［17，18］。同時，耐酸乳桿菌能在低pH環(huán)境中生長和存活［19］，可發(fā)酵果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖等，不能利用阿拉伯糖、蜜二糖、木糖等［20］，而弱酸性的pH值也是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，Clostridiales多為厭氧或兼性厭氧菌，在發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸有較大作用［21-23］。在發(fā)酵過程中，窖泥中這些菌群的生長還離不開營養(yǎng)物質的作用，如適當加入一些營養(yǎng)物質，有利于Bacillus subtili菌株的生長繁殖。由此可見，窖泥的各項理化指標的變化規(guī)律對這些菌群的生長、繁衍都有著重要的影響。

4 結論

經(jīng)鑒定，窖泥中的優(yōu)勢菌群為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），其相互作用影響著窖池窖泥的發(fā)酵過程和濃香型白酒酒體的風味特征。

窖泥的理化指標和微生物群落結構隨窖齡的變化呈一定規(guī)律，其中有效磷、總酸、腐殖酸都與微生物群落結構有極大相關性，對微生物群落的演替有重要影響。

［1］黃治國, 劉燕梅, 衛(wèi)春會, 等. 濃香型酒醅微生物群落與理化指標的相關性分析［J］. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30（11）：38-42.

［2］岳元媛, 張文學, 劉霞, 等. 濃香型白酒窖泥中兼性厭氧細菌的分離鑒定［J］. 微生物學通報, 2007, 34（2）：251-225.

［3］王濤, 杜江, 陳澤軍, 等. 窖泥放線菌的分離方法研究［J］. 釀酒科技, 2009（3）：26-28.

［4］Ercolini D. PCR-DGGE fingerp rinting：novel strate2gies for detection ofmicrobes in food［J］. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56：297-314.

［5］Bekaert K, Devriese L, Maes S, et al. Characterization of the dominant bacterial communities during storage of Norway lobster and Norway lobster tails（Nephrops norvegicus）based on 16S rDNA analysis by PCR-DGGE［J］. Food Microbiology, 2015, 46：132-138.

［6］Ling J, Zhang YY, Gong JD, et al. Spatial variability of cyanobacterial community composition in Sanya Bay as determined by DGGE fingerprinting and multivariate analysis［J］. Chinese Science Bulletin, 2013, 58（9）：1019-1027.

［7］王洋清, 楊紅軍, 李勇. DGGE技術在森林土壤微生物多樣性研究中的應用［J］. 生物技術通報, 2011, 5：75-79.

［8］Hesham Ael-L, Qi R, Yang M. Comparison of bacterial community structures in two systems of a sewage treatment plant using PCRDGGE analysis［J］. Science Direct, 2011, 23（12）：2049-2054.

［9］劉慧杰, 楊彩云, 田蘊, 等. 基于PCR-DGGE技術的紅樹林區(qū)微生物群落結構［J］. 微生物學報, 2010, 50（7）：923-930.

［10］Chen HJ, Lin YZ, Fanjiang JM, Fan C. Microbial community and treatment ability investigation in AOAO process for the optoelectronic wastewater treatment using PCR-DGGE biotechnology［J］. Biodegradation, 2013, 24（2）：227-243.

［11］陜小虎, 敖宗華, 周健, 等. 濃香型白酒窖泥原核微生物DGGE電泳條件的優(yōu)化［J］. 釀酒科技, 2011（1）：37-40.

［12］陶勇, 徐占成, 李東迅, 等. 窖泥細菌群落結構演替及其與環(huán)境因子的相關性［J］. 釀酒科技, 2011（9）：42-46.

［13］Zoet endal EG, Akkermans ADL, De Vos WM. Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64（10）：3854-3859.

［14］余有貴, 李偵, 熊翔, 等. 窖泥微生態(tài)的主要特征研究［J］.食品科學, 2009（1）：258-261.

［15］Hargreaves PR, Brookes PC, Ross GJS, Poulton PR. Evaluating soil mcrobial biomasscar bonasanin dicato roflong - termenviron mental change［J］. Soil Biology and Biochemistry, 2003, 35：401- 407.

［16］劉蘭蘭, 史春余, 梁太波, 等. 腐植酸肥料對生姜土壤微生物量和酶活性的影響［J］. 生態(tài)學報, 2009, 29：6136-6140.

［17］Staley BF, de los Reyes FL, Barlaz MA. Effect of spatial differences in microbial activity, pH, and substrate levels on methanogenesis initiation in refuse［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77（7）：2381-2391.

［18］Hao LP, Lu F, He PJ, et al. Predominant contribution of syntrophic acetate oxidation to themophilic methane formation at high acetate concentrations［J］. Environmental Science and Technology, 2011, 45（2）：508-513.

［19］Marteau P, Minekus M, Havenaar R, et al. Survival of Lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine：validation and the effects of bile［J］. Dairy Science, 1997, 80（6）：1031-1037.

［20］栗永樂, 李秀麗, 李傳娟, 等. 內蒙古東部地區(qū)農家酸菜中乳酸菌的分離與初步鑒定［J］. 食品工業(yè), 2012, 33：132-134.

［21］Ryan P, Forbes C, McHugh S, et al. Enrichment of acetogenic bacteria in high rate. anaerobic reactors under mesophilic and thermophilic conditions［J］. Science Direct, 2010（44）：4261-4269.

［22］Pinder RS, Patterson JA. Growth of acetogenic bacteria in response to varying pH, acetate or carbohydrate concentration. Agriculture［J］. Food and Analytical Bacteriology, 2013（3）：6-16.

［23］Parameswaran P, Torres CI, Lee HS, et al. Hydrogen consumption in microbial electrochemical systems（MXCs）：The role of homoacetogenic bacteria［J］. Bioresource Technology, 2012（102）：263-271.

（責任編輯 馬鑫）

Correlations Between Microbial Community and Physicochemical Indexes in Pit Mud of Different Ages

ZHONG Shu-xia DENG Jie WEI Chun-hui LUO Hui-bo WAN Shi-lü HUANG Zhi-guo
（Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong 643000）

This experiment aims to study the diversity of major microbial community structure in pit mud of different ages and the variation pattern of pit mud’s physical and chemical index（pH，total nitrogen，humic acid，available phosphorus and total acid），and to analyze the correlations among them. The results of Kjeldahl determination showed that：with the increase of pit age，pH of pit mud did not change basically，total acid tended to decrease slowly，total nitrogen rose firstly and then dropped，humic acid and available phosphorus increased slowly. The diversity index of bacteria and archaea by DGGE ranged as 1.62-2.58 and 1.79-2.33，respectively，and gradually increased with the increasing of pit age. The correlation coefficient between bacteria’s community structure and humic acid was 0.972（P＜0.01），-0.987（P＜0.01）with total acid，and 0.878（P＜0.05）with available phosphorus. The correlation coefficient of archaea’s community structure and humic acid was 0.986（P＜0.01），-0.954（P＜0.05）with total acid，0.901（P＜0.05）with available phosphorus，and no significant correlation with other indexes. Regarding bacteria，selected 11 dominant bands for sequencing，and most of them were found to be bacillus generally. Regarding archaea，selected 4 dominant bands for sequencing，and most of them were found to be methanogen. The physiochemical indexes and microbial community structure in pit mud showed a certain regular pattern with the change of the pit age，and some physiochemical indexes were strongly correlated with microbial community structure，these physiochemical indexes greatly concerned with the microbe’s domestication.

pit mud；PCR-DGGE；microbial community；correlation analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.018

2015-07-29

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金課題（NJ2013-08），四川理工學院人才引進項目（2014RC28）

鐘姝霞，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：31754209@qq.com

黃治國，男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：hzguo@suse.edu.cn