溫度對裂片石莼生長及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2016-06-23 13:49:51黃艷花楊銳孫慶海
生物技術(shù)通報 2016年7期
黃艷花楊銳孫慶海
（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 浙江省海洋生物重點實驗室，寧波 315211；3. 溫州市?；⒑Ｔ屦B(yǎng)殖有限公司，溫州 325400）
溫度對裂片石莼生長及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
黃艷花1，2楊銳1，2孫慶海3
（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 浙江省海洋生物重點實驗室，寧波 315211；3. 溫州市?；⒑Ｔ屦B(yǎng)殖有限公司，溫州 325400）
旨在研究裂片石莼（Ulva fasciata Delile）對溫度適應(yīng)機(jī)制，將藻體于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、35℃培養(yǎng)7 d，再經(jīng)過25℃培養(yǎng)2 d，通過測定不同溫度下裂片石莼的生長變化、葉綠素含量、葉綠素?zé)蓞?shù)及25℃再培養(yǎng)后葉綠素?zé)晒鈪?shù)探討不同溫度對裂片石莼的影響。結(jié)果顯示，25℃培養(yǎng)的藻體的生長、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm、Fv'/Fm'、α、qP）等最大；隨著溫度的升高或者降低，各項生理指標(biāo)逐漸降低，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ隨著溫度增大或者降低逐漸升高，10℃培養(yǎng)最大，5℃、35℃條件下的各項生理指標(biāo)最低。5℃、10℃、15℃、20℃、30℃下的藻體經(jīng)過25℃培養(yǎng)2 d后Fv/ Fm、Fv'/Fm'都有所提高，10℃培養(yǎng)后的藻體提高最大，33℃、35℃再培養(yǎng)后Fv/Fm、Fv'/Fm'幾乎沒有變化。研究表明，裂片石莼生長和光合作的最適溫度范圍為15℃-30℃，5℃和35℃分別為其最高和最低耐受溫度，裂片石莼對低溫的耐受性大于高溫。
裂片石莼；溫度；生長；葉綠素?zé)晒?/p>
裂片石莼（Ulva fasciata Delile）屬于綠藻門（Chlorophyta），石莼屬（Ulva Linnaeus），為亞熱帶性海藻，生長在風(fēng)浪較小的大干潮線附近的巖石或低潮帶的石沼中，主要分布于福建、廣東、廣西、海南等亞熱帶地區(qū)［1］。對浙江藻類的研究中發(fā)現(xiàn)有裂片石莼的存在，并且近幾年其分布位置出現(xiàn)了很明顯的北移現(xiàn)象。2002年調(diào)查發(fā)現(xiàn)裂片石莼以臺州灣為分布北界存在于溫州等浙南海域［2］，2006年裂片石莼存在于浙南海域的南麓海域［3］；2008發(fā)現(xiàn)裂片石莼在浙北海域、浙中海域、浙南海域均有分布［4］。其它海藻例如馬尾藻屬（Sargassum C.Ag）海藻也出現(xiàn)北移的現(xiàn)象，并且這種現(xiàn)象與氣候變暖有較大的關(guān)系［5］。氣候變暖也是綠潮爆發(fā)的主要原因［6，7］，藻類的生長和生理代謝的不同是決定綠潮藻類型的關(guān)鍵因素，而石莼屬海藻是形成綠潮的主要成分［8］，因此研究溫度對裂片石莼的生長及生理代謝的影響對于研究藻類分布以及預(yù)防綠潮爆發(fā)十分必要。
溫度對藻類的生長及生理代謝具有重要影響，生長量的不同是藻類對不同溫度最直觀的反映。通過測定不同溫度下長石莼（Ulva linza）、孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）生長量的差異研究了綠潮形成機(jī)制［8，9］。通過比較不同溫度下巨藻屬（Macrocystis Agardh）海藻生長量的變化確定了其在高溫下不適宜生存［10］，根據(jù)不同溫度下硬毛藻（Chaetomorpha antennina（Bory）Kützing）的生長速率及生長狀態(tài)的好壞確定其生存溫度范圍［11］。溫度對植物生長的影響主要是通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生理生化反應(yīng)來實現(xiàn)的。來自于光系統(tǒng)II的葉綠素?zé)晒鈱Νh(huán)境壓力非常敏感，能夠反應(yīng)光合系統(tǒng)損傷程度，對研究植物生理代謝反應(yīng)特別是光合作用受環(huán)境脅迫具有指示作用［12］。目前研究環(huán)境因素對葉綠素?zé)晒獾挠绊懼饕性谘芯縁v/Fm（最大光化學(xué)量子產(chǎn)量）、Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量）、光能利用效率（α）、qP（光化學(xué)淬滅系數(shù)）、NPQ（非光化學(xué)淬滅系數(shù)）、rETR（電子傳遞速率）等葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。根據(jù)不同溫度下α、rETR葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化確定了麒 麟 菜（Eucheuma denticulatum（Burman）Collins et Hervey）的適溫范圍為23℃-32℃［13］，通過研究不同溫度下Fv/Fm的變化篩選出了耐高溫的海帶（Laminaria japonica Aresch）品種［14］，造礁石珊瑚（Scleractinian coral）的Fv/Fm隨著溫度的升高逐漸降低表明其對溫度較為敏感［15］，杉葉藻（Hippuris vulgaris L.）在高低溫脅迫下NPQ會升高，qP、Fv/Fm等則會降低［16］。
本研究通過研究不同溫度下裂片石莼的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，確定裂片石莼的生存溫度范圍及對溫度的響應(yīng)機(jī)制，以期為藻類的遷徙消亡及綠潮的爆發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗藻樣于2015年7月采集自溫州霞關(guān)。用滅菌海水多次沖洗藻體，并用軟毛刷輕輕刷洗藻體表面，以去掉藻體表面泥沙及雜藻。將部分健康葉狀體培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中備用，溫度為20℃，光強(qiáng)為40 μmol/（m2·s）左右，光暗比為12D∶12L。培養(yǎng)液每2 d更換一次。
1.2 方法
1.2.1 藻體生長及相對生長率的測定 從上述預(yù)培養(yǎng)的材料中挑選生長狀態(tài)相似且健康的藻體，稱量0.2 g藻體記為M0，培養(yǎng)于含有PES培養(yǎng)液的400 mL海水中（海水∶PES=100∶2），處理溫度為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、35℃，光照與預(yù)培養(yǎng)光照一致，光周期為12D∶12L，每個處理5個平行，周期為7 d，每2 d換一次海水，每2 d稱量一次藻體鮮重記為Mt，t為培養(yǎng)的天數(shù)。相對生長率的計算［17］：
1.2.2 葉綠素含量的測定［18］藻體培養(yǎng)同1.2.1，培養(yǎng)7 d后，稱取0.1 g鮮重藻體，用95%的乙醇研磨，取上清，再用95%的乙醇定容至25 mL，用721分光光度計測定OD663、OD645。
按Arnon公式計算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量。
Ca=12.7OD663-2.69OD645（mg/L）Ma=Ca*25/0.1/ 1000（mg·g-1）
Cb=22.9OD645-4.68OD663（mg/L）Mb=Cb*25/0.1/ 1000（mg·g-1）
C=8.02OD665+20.21OD645（mg/L）M=C*25/0.1/ 1000（mg·g-1）
1.2.3 不同溫度下葉綠素?zé)晒鉁y定 藻體培養(yǎng)同
1.2.1 ，經(jīng)過5℃-35℃條件培養(yǎng)7 d后，將藻體組織進(jìn)行20 min黑暗處理，用便攜式調(diào)制脈沖熒光儀（WATER-EDF1.5B；WALZ，Gemany）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)：Fv/Fm（最大光化學(xué)量子產(chǎn)量）、Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量）、qP（光化學(xué)淬滅系數(shù)）、NPQ（非光化學(xué)淬滅系數(shù)）、光能利用效率（α），測定后將每個溫度條件下培養(yǎng)后的藻體放到25℃條件下再培養(yǎng)，其他條件與之前相同，2 d后再次測Fv/Fm、Fv'/Fm'。
1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 采用 Origin8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS13.0中的one-way ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，設(shè)顯著性水平為P＜0.05。
2 結(jié)果
2.1 不同溫度下裂片石莼生長及相對生長率的變化
不同溫度培養(yǎng)裂片石莼的鮮重隨時間的變化（圖1）顯示，10℃-33℃的溫度梯度培養(yǎng)下，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，裂片石莼的鮮重不斷增加，25℃增加最多。5℃、35℃培養(yǎng)的裂片石莼隨著培養(yǎng)時間的延長出現(xiàn)了下降趨勢。經(jīng)過7 d不同溫度培養(yǎng)后裂片石莼的相對生長率（RGR）變化（圖2）表明，溫度低于25℃，隨著溫度的升高相對生長率逐漸升高，25℃最大；超過25℃時隨著溫度的升高，5℃、35℃條件培養(yǎng)的相對生長率顯著小于其它幾組溫度條件（P＜0.05）。
圖1 溫度對裂片石莼鮮重的影響
圖2 溫度對裂片石莼相對日均生長率的影響
2.2 不同溫度培養(yǎng)的裂片石莼葉綠素含量及葉綠熒光特性
2.2.1 不同溫度下裂片石莼葉綠素含量 不同溫度培養(yǎng)后的裂片石莼葉綠素含量（圖3）顯示，25℃葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、總?cè)~綠素（Chl）含量最多，隨著溫度的升高或者降低，葉綠素含量逐漸減少，這與不同溫度下裂片石莼生長情況一致。不同于5℃條件下裂片石莼的生長顯著小于15℃、10℃條件下的值，5℃下的Chla、Chlb、Chl含量與15℃、10℃條件下無顯著性差異（P＞0.05）。 高溫33℃、35℃條件下裂片石莼的Chla、Chlb、Chl含量顯著下降（P＜0.05），33℃下的Chla、Chlb、Chl含量卻顯著小于10℃、5℃條件下的值（P＜0.05），35℃培養(yǎng)的Chla、Chlb、Chl含量顯著小于5℃條件的值（P＜0.05），這與兩種溫度下的裂片石莼的生長情況不同?？梢娏哑粚Φ蜏氐哪褪苄詢?yōu)于高溫。
2.2.2 不同溫度下葉綠素?zé)晒鈪?shù) 不同溫度下的Fv/Fm（最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，圖4-A）表明，25℃最大為（0.791），隨著溫度的增高或者降低，F(xiàn)v/Fm逐漸下降，5℃、10℃、33℃、35℃條件下的Fv/Fm顯著小于25℃的值（P＜0.05），分別為25℃的21.2%、70.8%、85.9%和20.4%。而不同溫度處理過的裂片石莼經(jīng)過25℃馴化2 d后測得的Fv/Fm（圖4-B）表明，10℃培養(yǎng)過的裂片石莼再經(jīng)過25℃培養(yǎng)后Fv/Fm顯著性升高到25℃的97.3%（P＞0.05），5℃條件下的Fv/Fm升高到25℃的32.3%，33℃、35℃培養(yǎng)的Fv/Fm變化不明顯。
圖3 溫度對裂片石莼葉綠素a（A）、葉綠素b（B）、總?cè)~綠素（C）含量的影響
不同溫度下的Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量，圖5-A）表明，趨勢同F(xiàn)v/Fm一樣，溫度低于25℃時隨著溫度的升高，F(xiàn)v'/Fm'逐漸升高，溫度高于25℃隨著溫度的升高逐漸降低，25℃條件下的Fv'/Fm'（0.469）最大；5℃、35℃條件下的Fv'/Fm'顯著低于其他溫度的值（P＜0.05）。經(jīng)過25℃馴化2 d后測得的Fv'/Fm'（圖5-B）表明，10℃、15℃、20℃、30℃的馴化值與25℃的值無顯著性差異（P＞0.05）。5℃提高為25℃的56.8%、33℃、35℃條件下的值沒有顯著性提高，可見裂片石莼對于低溫的耐受性顯著高于高溫。
圖4 溫度（A）及25℃處理對不同溫度培養(yǎng)下（B）裂片石莼最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm的影響
圖6顯示，不同溫度下的α（光能利用效率），25℃最大，隨著溫度的升高或者降低α逐漸減小，其變化趨勢同不同溫度下的Fv/Fm基本一致。不同溫度下裂片石莼的光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ（表1）表明，10℃-25℃隨著溫度的降低qP逐漸下降，NPQ則逐漸升高，25℃-30℃隨著溫度的升高qP降低，NPQ顯著增大，25℃具有最大的qP，10℃具有最大的NPQ，5℃、33℃、35℃的qP、NPQ都顯著降低，5℃、35℃最低。從葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化規(guī)律可以看出，25℃時裂片石莼的光合系統(tǒng)最健康，光能利用效率最高，10℃、33℃條件下受到低溫和高溫的脅迫，并且光合系統(tǒng)對低溫的耐受性高于高溫。5℃、35℃顯著抑制了藻類的光合系統(tǒng)。
圖5 溫度（A）及25℃處理對不同溫度培養(yǎng)下（B）裂片石莼有效光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv'/Fm'的影響
圖6 溫度對裂片石莼光能利用效率α的影響
3 討論
3.1 不同溫度培養(yǎng)下裂片石莼生長的差異
生物對非生物環(huán)境都有一個耐受范圍，在耐受范圍內(nèi)能夠生長，超過耐受范圍不生長甚至死亡［19］。藻體在適宜的溫度范圍能夠快速增長，超過適宜范圍藻類生長則會下降［20］。研究表明，裂片石莼在適宜的溫度15℃-30℃條件下生長迅速，10℃-15℃及30℃-33℃條件下生長顯著下降，5℃、35℃條件下生長明顯受抑制。這也解釋了裂片石莼一般在夏季溫度較高時消失，早秋生長旺盛的季節(jié)性規(guī)律［21］。有研究表明綠潮藻的生長量在10℃時就可以達(dá)到很高的生長速率［7］。綠潮一般在夏季爆發(fā)，夏季溫度一般在30℃以上，本研究中當(dāng)溫度超過33℃時，裂片石莼的生長便會受到限制，夏季爆發(fā)的綠潮藻中裂片石莼成分很少。
表1 不同溫度對裂片石莼光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）的影響
3.2 溫度對裂片石莼葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
葉綠素含量影響藻類對光能的吸收和轉(zhuǎn)換，高溫和低溫脅迫都能降低藻類的葉綠素含量，影響捕獲光能并轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的效率，裂片石莼在高溫和低溫脅迫下葉綠素含量顯著降低，這與相應(yīng)的溫度脅迫下的生長率變化一致［22］。低溫脅迫下裂片石莼的葉綠素含量顯著高于高溫脅迫的含量，這與低溫和高溫之間的生長量的變化不同，因為低溫脅迫對于植物的傷害主要是物理性的凍傷，而高溫脅迫破壞了葉綠素結(jié)構(gòu)造成不可逆的傷害。
藻類吸收的光能，一部分用于驅(qū)動光合作用，還有一部分以葉綠素?zé)晒獾男问皆诠庀到y(tǒng)II轉(zhuǎn)動過程中釋放，檢測葉綠素?zé)晒獾淖兓梢苑从砅SII系統(tǒng)的光合情況。溫度脅迫阻礙光合作用中電子傳遞，使光合作用器官受氧化的風(fēng)險增強(qiáng)，這種氧化作用將導(dǎo)致PSII系統(tǒng)的慢性損傷，導(dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)改變［23］。裂片石莼在低溫和高溫脅迫下Fv/Fm顯著降低，5℃、35℃條件下的Fv/Fm＜0.44，說明溫度脅迫對PSII系統(tǒng)造成傷害，5℃、35℃使裂片石莼PSII系統(tǒng)完全失活［24］。環(huán)境脅迫能夠嚴(yán)重影響光合反應(yīng)效率［25］，高溫和低溫條件下Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量）、α（光化學(xué)利用效率）、qP（光化學(xué)淬滅）顯著性降低，表明溫度脅迫阻礙了光能的傳遞，造成大量光能的積累，從而損傷了光合系統(tǒng)，降低光能的利用效率。但是低溫和高溫對植物脅迫機(jī)制不同，低溫對植物主要造成物理性可逆的凍傷，削弱了光能利用效率，造成光能過剩，產(chǎn)生光抑制，適度的低溫脅迫下NPQ增加說明光化學(xué)效率降低積累的過量光能通過非光化學(xué)過程耗散來保護(hù)PSII的結(jié)構(gòu)［22］。高溫脅迫直接導(dǎo)致捕光色素復(fù)合體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對光合系統(tǒng)造成化學(xué)性不可逆的傷害。10℃條件下的裂片石莼表現(xiàn)出最大NPQ，經(jīng)過25℃培養(yǎng)2 d后Fv/Fm、Fv'/Fm'顯著提升，進(jìn)一步說明低溫脅迫下光抑制現(xiàn)象提高了裂片石莼對低溫的耐受性［26］。高溫33℃、35℃脅迫下的NPQ顯著小于低溫，經(jīng)過25℃培養(yǎng)后Fv/Fm、Fv'/Fm'沒有顯著提升，說明高溫對裂片石莼的光合系統(tǒng)造成了不可逆的傷害。5℃、35℃條件下的qP、NPQ同時急劇下降，說明 5℃、35℃條件嚴(yán)重?fù)p害了它的反應(yīng)中心和天線系統(tǒng)，不能發(fā)展有效的NPQ途徑進(jìn)行保護(hù)［27］，這可能已經(jīng)達(dá)到了裂片石莼的極限低溫和高溫。本實驗僅從裂片石莼的生長和葉綠素?zé)晒馓匦苑矫娣治隽肆哑粚囟鹊倪m應(yīng)機(jī)制，在后續(xù)實驗中應(yīng)該進(jìn)行不同溫度下藻類各種生理生化指標(biāo)的測量，以更深入地了解裂片石莼對溫度的響應(yīng)機(jī)制。
4 結(jié)論
本研究表明，15℃-30℃范圍內(nèi)是裂片石莼的適宜溫度范圍，5℃-15℃以及30℃-35℃范圍內(nèi)，裂片石莼處于溫度的耐受范圍，當(dāng)溫度為5℃和35℃時已達(dá)到裂片石莼的極限低溫和高溫。
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（責(zé)任編輯 李楠）
Effect of Temperature on Growth and Chlorophyll Fluorescence of Ulva fasciata
HUANG Yan-hua1，2YANG Rui1，2SUN Qing-hai3
（1. School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211；2. Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，Ningbo 315211；3. Wenzhou Seatiger Seaweed Cultivation Co.，Ltd.，Wenzhou 325400）
In order to study the temperature adaptation mechanism of Ulva fasciata Delile，culturing the U. fasciata under the temperatures：5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，33℃ and 35℃ for 7 d，and the growth change，chlorophyll content，and indexes of chlorophyll fluorescence of U. fasciata at different temperatures as well as the parameters of chlorophyll fluorescence after re-culturing at 25℃were examined to understand the effects of different temperatures on the U. fasciata. Results showed that growth rate，chlorophyll content，the indexes of fluorescence（optimal photo-chemical quantum yield（Fv/Fm），effective optimal photo-chemical quantum yield（Fv'/Fm'），photosynthetic light use efficiency（α），and photo-chemical quenching（qP））all reached the maximum at 25℃. All these physiological indexes of the seaweeds decreased gradually when the temperature were higher or lower than 25℃，and the lowest at 5℃ and 35℃；however，the non-photo-chemical quenching（NPQ）gradually rose with the increase or decrease of temperature，and till its maximum value at 10℃. The Fv/Fmand Fv'/Fm' values of the samples of 5℃ to 30℃ groups increased a bit after they were recovered at 25℃ for 2 d，and the highest increment occurred in 10℃ group. Meanwhile，the indexes did not change in the group of 33℃ and 35℃ after recovered cultivation. The results indicated that the most appropriate temperature for U. fasciata to grow and photo-synthesis was in a range of 15℃ to 30℃，5℃and 35℃ were the lowest and highest growth temperature respectively，and U. fasciata showed greater tolerance to low temperature than to high temperature.
Ulva fasciata；temperature；growth；chlorophyll fluorescence
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.015
2015-11-09
浙江省公益項目（2015C32004），寧波市科技富民項目（2015C10062），寧波大學(xué)水產(chǎn)浙江省重中之重一級學(xué)科開放基金項目（xkzsc1509）
黃艷花，女，碩士，研究方向：藻類生物技術(shù)；E-mail：861246343@qq.com
楊銳，女，博士，副研究員，研究方向：藻類生物技術(shù)；E-mail：yangrui@nbu.edu.cn
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黃艷花楊銳孫慶海
（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 浙江省海洋生物重點實驗室，寧波 315211；3. 溫州市?；⒑Ｔ屦B(yǎng)殖有限公司，溫州 325400）
溫度對裂片石莼生長及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
黃艷花1，2楊銳1，2孫慶海3
（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 浙江省海洋生物重點實驗室，寧波 315211；3. 溫州市?；⒑Ｔ屦B(yǎng)殖有限公司，溫州 325400）
旨在研究裂片石莼（Ulva fasciata Delile）對溫度適應(yīng)機(jī)制，將藻體于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、35℃培養(yǎng)7 d，再經(jīng)過25℃培養(yǎng)2 d，通過測定不同溫度下裂片石莼的生長變化、葉綠素含量、葉綠素?zé)蓞?shù)及25℃再培養(yǎng)后葉綠素?zé)晒鈪?shù)探討不同溫度對裂片石莼的影響。結(jié)果顯示，25℃培養(yǎng)的藻體的生長、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm、Fv'/Fm'、α、qP）等最大；隨著溫度的升高或者降低，各項生理指標(biāo)逐漸降低，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ隨著溫度增大或者降低逐漸升高，10℃培養(yǎng)最大，5℃、35℃條件下的各項生理指標(biāo)最低。5℃、10℃、15℃、20℃、30℃下的藻體經(jīng)過25℃培養(yǎng)2 d后Fv/ Fm、Fv'/Fm'都有所提高，10℃培養(yǎng)后的藻體提高最大，33℃、35℃再培養(yǎng)后Fv/Fm、Fv'/Fm'幾乎沒有變化。研究表明，裂片石莼生長和光合作的最適溫度范圍為15℃-30℃，5℃和35℃分別為其最高和最低耐受溫度，裂片石莼對低溫的耐受性大于高溫。
裂片石莼；溫度；生長；葉綠素?zé)晒?/p>
裂片石莼（Ulva fasciata Delile）屬于綠藻門（Chlorophyta），石莼屬（Ulva Linnaeus），為亞熱帶性海藻，生長在風(fēng)浪較小的大干潮線附近的巖石或低潮帶的石沼中，主要分布于福建、廣東、廣西、海南等亞熱帶地區(qū)［1］。對浙江藻類的研究中發(fā)現(xiàn)有裂片石莼的存在，并且近幾年其分布位置出現(xiàn)了很明顯的北移現(xiàn)象。2002年調(diào)查發(fā)現(xiàn)裂片石莼以臺州灣為分布北界存在于溫州等浙南海域［2］，2006年裂片石莼存在于浙南海域的南麓海域［3］；2008發(fā)現(xiàn)裂片石莼在浙北海域、浙中海域、浙南海域均有分布［4］。其它海藻例如馬尾藻屬（Sargassum C.Ag）海藻也出現(xiàn)北移的現(xiàn)象，并且這種現(xiàn)象與氣候變暖有較大的關(guān)系［5］。氣候變暖也是綠潮爆發(fā)的主要原因［6，7］，藻類的生長和生理代謝的不同是決定綠潮藻類型的關(guān)鍵因素，而石莼屬海藻是形成綠潮的主要成分［8］，因此研究溫度對裂片石莼的生長及生理代謝的影響對于研究藻類分布以及預(yù)防綠潮爆發(fā)十分必要。
溫度對藻類的生長及生理代謝具有重要影響，生長量的不同是藻類對不同溫度最直觀的反映。通過測定不同溫度下長石莼（Ulva linza）、孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）生長量的差異研究了綠潮形成機(jī)制［8，9］。通過比較不同溫度下巨藻屬（Macrocystis Agardh）海藻生長量的變化確定了其在高溫下不適宜生存［10］，根據(jù)不同溫度下硬毛藻（Chaetomorpha antennina（Bory）Kützing）的生長速率及生長狀態(tài)的好壞確定其生存溫度范圍［11］。溫度對植物生長的影響主要是通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生理生化反應(yīng)來實現(xiàn)的。來自于光系統(tǒng)II的葉綠素?zé)晒鈱Νh(huán)境壓力非常敏感，能夠反應(yīng)光合系統(tǒng)損傷程度，對研究植物生理代謝反應(yīng)特別是光合作用受環(huán)境脅迫具有指示作用［12］。目前研究環(huán)境因素對葉綠素?zé)晒獾挠绊懼饕性谘芯縁v/Fm（最大光化學(xué)量子產(chǎn)量）、Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量）、光能利用效率（α）、qP（光化學(xué)淬滅系數(shù)）、NPQ（非光化學(xué)淬滅系數(shù)）、rETR（電子傳遞速率）等葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。根據(jù)不同溫度下α、rETR葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化確定了麒 麟 菜（Eucheuma denticulatum（Burman）Collins et Hervey）的適溫范圍為23℃-32℃［13］，通過研究不同溫度下Fv/Fm的變化篩選出了耐高溫的海帶（Laminaria japonica Aresch）品種［14］，造礁石珊瑚（Scleractinian coral）的Fv/Fm隨著溫度的升高逐漸降低表明其對溫度較為敏感［15］，杉葉藻（Hippuris vulgaris L.）在高低溫脅迫下NPQ會升高，qP、Fv/Fm等則會降低［16］。
本研究通過研究不同溫度下裂片石莼的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，確定裂片石莼的生存溫度范圍及對溫度的響應(yīng)機(jī)制，以期為藻類的遷徙消亡及綠潮的爆發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗藻樣于2015年7月采集自溫州霞關(guān)。用滅菌海水多次沖洗藻體，并用軟毛刷輕輕刷洗藻體表面，以去掉藻體表面泥沙及雜藻。將部分健康葉狀體培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中備用，溫度為20℃，光強(qiáng)為40 μmol/（m2·s）左右，光暗比為12D∶12L。培養(yǎng)液每2 d更換一次。
1.2 方法
1.2.1 藻體生長及相對生長率的測定 從上述預(yù)培養(yǎng)的材料中挑選生長狀態(tài)相似且健康的藻體，稱量0.2 g藻體記為M0，培養(yǎng)于含有PES培養(yǎng)液的400 mL海水中（海水∶PES=100∶2），處理溫度為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、33℃、35℃，光照與預(yù)培養(yǎng)光照一致，光周期為12D∶12L，每個處理5個平行，周期為7 d，每2 d換一次海水，每2 d稱量一次藻體鮮重記為Mt，t為培養(yǎng)的天數(shù)。相對生長率的計算［17］：
1.2.2 葉綠素含量的測定［18］藻體培養(yǎng)同1.2.1，培養(yǎng)7 d后，稱取0.1 g鮮重藻體，用95%的乙醇研磨，取上清，再用95%的乙醇定容至25 mL，用721分光光度計測定OD663、OD645。
按Arnon公式計算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量。
Ca=12.7OD663-2.69OD645（mg/L）Ma=Ca*25/0.1/ 1000（mg·g-1）
Cb=22.9OD645-4.68OD663（mg/L）Mb=Cb*25/0.1/ 1000（mg·g-1）
C=8.02OD665+20.21OD645（mg/L）M=C*25/0.1/ 1000（mg·g-1）
1.2.3 不同溫度下葉綠素?zé)晒鉁y定 藻體培養(yǎng)同
1.2.1 ，經(jīng)過5℃-35℃條件培養(yǎng)7 d后，將藻體組織進(jìn)行20 min黑暗處理，用便攜式調(diào)制脈沖熒光儀（WATER-EDF1.5B；WALZ，Gemany）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)：Fv/Fm（最大光化學(xué)量子產(chǎn)量）、Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量）、qP（光化學(xué)淬滅系數(shù)）、NPQ（非光化學(xué)淬滅系數(shù)）、光能利用效率（α），測定后將每個溫度條件下培養(yǎng)后的藻體放到25℃條件下再培養(yǎng)，其他條件與之前相同，2 d后再次測Fv/Fm、Fv'/Fm'。
1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 采用 Origin8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS13.0中的one-way ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，設(shè)顯著性水平為P＜0.05。
2 結(jié)果
2.1 不同溫度下裂片石莼生長及相對生長率的變化
不同溫度培養(yǎng)裂片石莼的鮮重隨時間的變化（圖1）顯示，10℃-33℃的溫度梯度培養(yǎng)下，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，裂片石莼的鮮重不斷增加，25℃增加最多。5℃、35℃培養(yǎng)的裂片石莼隨著培養(yǎng)時間的延長出現(xiàn)了下降趨勢。經(jīng)過7 d不同溫度培養(yǎng)后裂片石莼的相對生長率（RGR）變化（圖2）表明，溫度低于25℃，隨著溫度的升高相對生長率逐漸升高，25℃最大；超過25℃時隨著溫度的升高，5℃、35℃條件培養(yǎng)的相對生長率顯著小于其它幾組溫度條件（P＜0.05）。
圖1 溫度對裂片石莼鮮重的影響
圖2 溫度對裂片石莼相對日均生長率的影響
2.2 不同溫度培養(yǎng)的裂片石莼葉綠素含量及葉綠熒光特性
2.2.1 不同溫度下裂片石莼葉綠素含量 不同溫度培養(yǎng)后的裂片石莼葉綠素含量（圖3）顯示，25℃葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、總?cè)~綠素（Chl）含量最多，隨著溫度的升高或者降低，葉綠素含量逐漸減少，這與不同溫度下裂片石莼生長情況一致。不同于5℃條件下裂片石莼的生長顯著小于15℃、10℃條件下的值，5℃下的Chla、Chlb、Chl含量與15℃、10℃條件下無顯著性差異（P＞0.05）。 高溫33℃、35℃條件下裂片石莼的Chla、Chlb、Chl含量顯著下降（P＜0.05），33℃下的Chla、Chlb、Chl含量卻顯著小于10℃、5℃條件下的值（P＜0.05），35℃培養(yǎng)的Chla、Chlb、Chl含量顯著小于5℃條件的值（P＜0.05），這與兩種溫度下的裂片石莼的生長情況不同?？梢娏哑粚Φ蜏氐哪褪苄詢?yōu)于高溫。
2.2.2 不同溫度下葉綠素?zé)晒鈪?shù) 不同溫度下的Fv/Fm（最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，圖4-A）表明，25℃最大為（0.791），隨著溫度的增高或者降低，F(xiàn)v/Fm逐漸下降，5℃、10℃、33℃、35℃條件下的Fv/Fm顯著小于25℃的值（P＜0.05），分別為25℃的21.2%、70.8%、85.9%和20.4%。而不同溫度處理過的裂片石莼經(jīng)過25℃馴化2 d后測得的Fv/Fm（圖4-B）表明，10℃培養(yǎng)過的裂片石莼再經(jīng)過25℃培養(yǎng)后Fv/Fm顯著性升高到25℃的97.3%（P＞0.05），5℃條件下的Fv/Fm升高到25℃的32.3%，33℃、35℃培養(yǎng)的Fv/Fm變化不明顯。
圖3 溫度對裂片石莼葉綠素a（A）、葉綠素b（B）、總?cè)~綠素（C）含量的影響
不同溫度下的Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量，圖5-A）表明，趨勢同F(xiàn)v/Fm一樣，溫度低于25℃時隨著溫度的升高，F(xiàn)v'/Fm'逐漸升高，溫度高于25℃隨著溫度的升高逐漸降低，25℃條件下的Fv'/Fm'（0.469）最大；5℃、35℃條件下的Fv'/Fm'顯著低于其他溫度的值（P＜0.05）。經(jīng)過25℃馴化2 d后測得的Fv'/Fm'（圖5-B）表明，10℃、15℃、20℃、30℃的馴化值與25℃的值無顯著性差異（P＞0.05）。5℃提高為25℃的56.8%、33℃、35℃條件下的值沒有顯著性提高，可見裂片石莼對于低溫的耐受性顯著高于高溫。
圖4 溫度（A）及25℃處理對不同溫度培養(yǎng)下（B）裂片石莼最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm的影響
圖6顯示，不同溫度下的α（光能利用效率），25℃最大，隨著溫度的升高或者降低α逐漸減小，其變化趨勢同不同溫度下的Fv/Fm基本一致。不同溫度下裂片石莼的光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ（表1）表明，10℃-25℃隨著溫度的降低qP逐漸下降，NPQ則逐漸升高，25℃-30℃隨著溫度的升高qP降低，NPQ顯著增大，25℃具有最大的qP，10℃具有最大的NPQ，5℃、33℃、35℃的qP、NPQ都顯著降低，5℃、35℃最低。從葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化規(guī)律可以看出，25℃時裂片石莼的光合系統(tǒng)最健康，光能利用效率最高，10℃、33℃條件下受到低溫和高溫的脅迫，并且光合系統(tǒng)對低溫的耐受性高于高溫。5℃、35℃顯著抑制了藻類的光合系統(tǒng)。
圖5 溫度（A）及25℃處理對不同溫度培養(yǎng)下（B）裂片石莼有效光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv'/Fm'的影響
圖6 溫度對裂片石莼光能利用效率α的影響
3 討論
3.1 不同溫度培養(yǎng)下裂片石莼生長的差異
生物對非生物環(huán)境都有一個耐受范圍，在耐受范圍內(nèi)能夠生長，超過耐受范圍不生長甚至死亡［19］。藻體在適宜的溫度范圍能夠快速增長，超過適宜范圍藻類生長則會下降［20］。研究表明，裂片石莼在適宜的溫度15℃-30℃條件下生長迅速，10℃-15℃及30℃-33℃條件下生長顯著下降，5℃、35℃條件下生長明顯受抑制。這也解釋了裂片石莼一般在夏季溫度較高時消失，早秋生長旺盛的季節(jié)性規(guī)律［21］。有研究表明綠潮藻的生長量在10℃時就可以達(dá)到很高的生長速率［7］。綠潮一般在夏季爆發(fā)，夏季溫度一般在30℃以上，本研究中當(dāng)溫度超過33℃時，裂片石莼的生長便會受到限制，夏季爆發(fā)的綠潮藻中裂片石莼成分很少。
表1 不同溫度對裂片石莼光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）的影響
3.2 溫度對裂片石莼葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
葉綠素含量影響藻類對光能的吸收和轉(zhuǎn)換，高溫和低溫脅迫都能降低藻類的葉綠素含量，影響捕獲光能并轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的效率，裂片石莼在高溫和低溫脅迫下葉綠素含量顯著降低，這與相應(yīng)的溫度脅迫下的生長率變化一致［22］。低溫脅迫下裂片石莼的葉綠素含量顯著高于高溫脅迫的含量，這與低溫和高溫之間的生長量的變化不同，因為低溫脅迫對于植物的傷害主要是物理性的凍傷，而高溫脅迫破壞了葉綠素結(jié)構(gòu)造成不可逆的傷害。
藻類吸收的光能，一部分用于驅(qū)動光合作用，還有一部分以葉綠素?zé)晒獾男问皆诠庀到y(tǒng)II轉(zhuǎn)動過程中釋放，檢測葉綠素?zé)晒獾淖兓梢苑从砅SII系統(tǒng)的光合情況。溫度脅迫阻礙光合作用中電子傳遞，使光合作用器官受氧化的風(fēng)險增強(qiáng)，這種氧化作用將導(dǎo)致PSII系統(tǒng)的慢性損傷，導(dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)改變［23］。裂片石莼在低溫和高溫脅迫下Fv/Fm顯著降低，5℃、35℃條件下的Fv/Fm＜0.44，說明溫度脅迫對PSII系統(tǒng)造成傷害，5℃、35℃使裂片石莼PSII系統(tǒng)完全失活［24］。環(huán)境脅迫能夠嚴(yán)重影響光合反應(yīng)效率［25］，高溫和低溫條件下Fv'/Fm'（有效光化學(xué)量子產(chǎn)量）、α（光化學(xué)利用效率）、qP（光化學(xué)淬滅）顯著性降低，表明溫度脅迫阻礙了光能的傳遞，造成大量光能的積累，從而損傷了光合系統(tǒng)，降低光能的利用效率。但是低溫和高溫對植物脅迫機(jī)制不同，低溫對植物主要造成物理性可逆的凍傷，削弱了光能利用效率，造成光能過剩，產(chǎn)生光抑制，適度的低溫脅迫下NPQ增加說明光化學(xué)效率降低積累的過量光能通過非光化學(xué)過程耗散來保護(hù)PSII的結(jié)構(gòu)［22］。高溫脅迫直接導(dǎo)致捕光色素復(fù)合體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對光合系統(tǒng)造成化學(xué)性不可逆的傷害。10℃條件下的裂片石莼表現(xiàn)出最大NPQ，經(jīng)過25℃培養(yǎng)2 d后Fv/Fm、Fv'/Fm'顯著提升，進(jìn)一步說明低溫脅迫下光抑制現(xiàn)象提高了裂片石莼對低溫的耐受性［26］。高溫33℃、35℃脅迫下的NPQ顯著小于低溫，經(jīng)過25℃培養(yǎng)后Fv/Fm、Fv'/Fm'沒有顯著提升，說明高溫對裂片石莼的光合系統(tǒng)造成了不可逆的傷害。5℃、35℃條件下的qP、NPQ同時急劇下降，說明 5℃、35℃條件嚴(yán)重?fù)p害了它的反應(yīng)中心和天線系統(tǒng)，不能發(fā)展有效的NPQ途徑進(jìn)行保護(hù)［27］，這可能已經(jīng)達(dá)到了裂片石莼的極限低溫和高溫。本實驗僅從裂片石莼的生長和葉綠素?zé)晒馓匦苑矫娣治隽肆哑粚囟鹊倪m應(yīng)機(jī)制，在后續(xù)實驗中應(yīng)該進(jìn)行不同溫度下藻類各種生理生化指標(biāo)的測量，以更深入地了解裂片石莼對溫度的響應(yīng)機(jī)制。
4 結(jié)論
本研究表明，15℃-30℃范圍內(nèi)是裂片石莼的適宜溫度范圍，5℃-15℃以及30℃-35℃范圍內(nèi)，裂片石莼處于溫度的耐受范圍，當(dāng)溫度為5℃和35℃時已達(dá)到裂片石莼的極限低溫和高溫。
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（責(zé)任編輯 李楠）
Effect of Temperature on Growth and Chlorophyll Fluorescence of Ulva fasciata
HUANG Yan-hua1，2YANG Rui1，2SUN Qing-hai3
（1. School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211；2. Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province，Ningbo 315211；3. Wenzhou Seatiger Seaweed Cultivation Co.，Ltd.，Wenzhou 325400）
In order to study the temperature adaptation mechanism of Ulva fasciata Delile，culturing the U. fasciata under the temperatures：5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，33℃ and 35℃ for 7 d，and the growth change，chlorophyll content，and indexes of chlorophyll fluorescence of U. fasciata at different temperatures as well as the parameters of chlorophyll fluorescence after re-culturing at 25℃were examined to understand the effects of different temperatures on the U. fasciata. Results showed that growth rate，chlorophyll content，the indexes of fluorescence（optimal photo-chemical quantum yield（Fv/Fm），effective optimal photo-chemical quantum yield（Fv'/Fm'），photosynthetic light use efficiency（α），and photo-chemical quenching（qP））all reached the maximum at 25℃. All these physiological indexes of the seaweeds decreased gradually when the temperature were higher or lower than 25℃，and the lowest at 5℃ and 35℃；however，the non-photo-chemical quenching（NPQ）gradually rose with the increase or decrease of temperature，and till its maximum value at 10℃. The Fv/Fmand Fv'/Fm' values of the samples of 5℃ to 30℃ groups increased a bit after they were recovered at 25℃ for 2 d，and the highest increment occurred in 10℃ group. Meanwhile，the indexes did not change in the group of 33℃ and 35℃ after recovered cultivation. The results indicated that the most appropriate temperature for U. fasciata to grow and photo-synthesis was in a range of 15℃ to 30℃，5℃and 35℃ were the lowest and highest growth temperature respectively，and U. fasciata showed greater tolerance to low temperature than to high temperature.
Ulva fasciata；temperature；growth；chlorophyll fluorescence
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.015
2015-11-09
浙江省公益項目（2015C32004），寧波市科技富民項目（2015C10062），寧波大學(xué)水產(chǎn)浙江省重中之重一級學(xué)科開放基金項目（xkzsc1509）
黃艷花，女，碩士，研究方向：藻類生物技術(shù)；E-mail：861246343@qq.com
楊銳，女，博士，副研究員，研究方向：藻類生物技術(shù)；E-mail：yangrui@nbu.edu.cn
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