香蕉水通道蛋白SIP2-1基因的克隆和表達分析

許奕侯曉婉徐碧玉金志強胡偉宋順

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，?？?570102；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，湛江 524091）

香蕉水通道蛋白SIP2-1基因的克隆和表達分析

許奕1，2侯曉婉3徐碧玉2金志強1，2胡偉2宋順1

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海口實驗站 海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，?？?570102；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，湛江 524091）

從香蕉中克隆了一個水通道蛋白（AQP）基因MaSIP2-1。序列分析表明，該基因存在一個完整的開放閱讀框（ORF）717 bp，編碼 239個氨基酸。多序列比對和進化樹分析表明，MaSIP2-1所編碼的蛋白與其他植物中AQP編碼的蛋白具有較高的一致性。其中與馬來西亞野生香蕉、油棕、麻風樹、野茶樹的AQP編碼的氨基酸序列的同源性較高，分別為98%、74%、65%和63%。器官特異性分析表明，MaSIP2-1在香蕉的根、莖、葉片、花和果實中均有所表達，其中在莖中表達量較高。通過對其在干旱、高鹽、低溫、澇害脅迫下的表達結(jié)果分析顯示，該基因響應干旱、高鹽、澇害3種脅迫。

水通道蛋白；SIP；香蕉；生物信息學；脅迫；熒光定量PCR

植物的生長依賴植物的根系從土壤中吸取水分運輸?shù)狡渌鞴僦校?］。然而，干旱、高鹽、寒冷等外界環(huán)境的脅迫會導致植物水分缺失而影響植物的生長和產(chǎn)量。水分的運輸是維持植物使其具有忍耐干旱和高鹽脅迫的一個重要過程［2-4］。水通道蛋白（AQP）能夠運輸水分以及其他小分子物質(zhì)，如甘油、CO2和硼等［5-7］。AQP在植物中的生物活性是多樣性的，包括種子萌發(fā)、氣孔運動、細胞伸長及響應外界脅迫等［8，9］。在許多植物中都已經(jīng)鑒定出了AQP蛋白，包括擬南芥中的35個［10］，水稻種的33個［11］，玉米種的36個［12］。水通道蛋白根據(jù)序列同源性分成4類，包括液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast in-trinsic protein，TIPs）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIPs）、NOD26-like內(nèi)在蛋白（NOD26-like intrinsic proteins，NIPs）和小的內(nèi)在蛋白（small and basic intrinsic proteins，SIP）［13］。這4類AQP具有高度保守結(jié)構(gòu)，均有6個傾斜的右旋性跨膜結(jié)構(gòu)（TM1-TM6），并被5個環(huán)（Loop）所連接［12］。AQP在植物中涉及許多發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、果實成熟、細胞伸長等［9］。在Liu等［14］研究中，過表達OsPIP1；1能夠增加轉(zhuǎn)基因水稻種子產(chǎn)量，提高種子的發(fā)芽率。而GhPIP1；2 和 GhgammaTIP1能使水分快速進入液泡，從而促進棉花纖維細胞伸長［15］。此外，關(guān)于AQP對植物抵御外界非生物脅迫的研究近年來成為研究其功能的一個熱點，許多實驗結(jié)果顯示，植物能夠通過調(diào)節(jié)AQP的活性響應各種逆境的脅迫，如旱害、冷害、鹽害、機械損傷、滲透脅迫及重金屬脅迫等。本研究從香蕉中克隆出一個MaSIP2-1基因，并對其在非生物脅迫處理下的表達模式做了研究，旨在為進一步研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年1 月初采集巴西香蕉（Musa acuminata L.AAA group‘Brazilian’）的根、莖、葉、花及果實，用無菌水清洗后立即放置于液氮中速凍，于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。實驗所用香蕉均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院儋州組培中心。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 從香蕉A基因組測序數(shù)據(jù)庫中得到一個AQP家族基因MaSIP2-1，根據(jù)其序列設計一對引物S1，S2（表1），擴增MaSIP2-1全長序列。PCR擴增程序為：95℃預變性5 s；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)。按照分子克隆實驗指南進行PCR擴增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定。對已鑒定的陽性克隆進行測序分析。

1.2.2 生物信息學分析 將基因MaSIP2-1的cDNA序列和開放閱讀框（open reading frame，ORF）編碼的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLASTx進行同源性搜索和比對，利用Clustal X1.81 和MEGA 3.1 軟件分析MaSIP2-1蛋白與其他植物的SIP2-1蛋白的進化關(guān)系，構(gòu)建分子進化樹。

表1 香蕉MaSIP2-1基因的克隆及實時熒光定量PCR所用引物

1.2.3 MaSIP2-1在香蕉不同器官中的表達分析 以香蕉五葉一心期的根、莖、葉片及花和果實采后當天的cDNA為模板，采用RT-PCR 方法分析其組織特異性表達。以香蕉MaActin片段為內(nèi)參，引物為NCBI 上已登錄序列MaActin1和MaActin2，MaSIP2-1引物為P1和P2。PCR 反應體系為25 μL。反應程序：95℃預變性30 s；95℃ 7 s，56℃ 15 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)后作熔解曲線（95-55℃，0.1℃· s-1）。

1.2.4 基因的表達分析

1.2.4.1 干旱脅迫處理 取20株五葉一心、心葉未展、生長健壯的香蕉幼苗，分為4組，每組5株。測定各組中土壤水分含量并調(diào)整為一致。實驗設計如下：第1組：正常生長（作為對照），按規(guī)律澆水，土壤相對含水量保持在75%-80%；第2組：低度失水干旱脅迫，土壤相對含水量保持在55%-60%；第3組：中度失水干旱脅迫，土壤相對含水量保持在45%-50%；第4組：高度失水干旱脅迫，土壤相對含水量保持在30%-35%。將所有香蕉苗均放入恒溫人工氣候箱中培養(yǎng)。設定環(huán)境溫度為25-30℃，光照強度為2 000 lx，空氣相對濕度40%。利用烘干土法控制調(diào)節(jié)土壤相對含水量，每隔3 h進行測定，達到不同脅迫標準后取出植株葉片置于液氮中迅速冷凍，提取RNA。

1.2.4.2 高鹽脅迫處理 在培養(yǎng)液（1/2Hoagland營養(yǎng)液）中加入300 mmol/L NaCl進行鹽脅迫處理。白天的平均溫度為33-35℃，夜間的平均溫度為26-28℃，光照充分，于0、2、4和6 h分別觀察和取樣。將材料的葉片置于液氮中冷凍，提取RNA。

1.2.4.3 低溫脅迫處理 選取生長一致，長勢健壯的香蕉幼苗，分為5組，置于人工氣候箱培養(yǎng)進行低溫處理。處理方法如下：從25℃開始降溫到15℃、10℃、7℃和5℃四個不同的溫度。第1組：對照組，將香蕉苗在25℃下連續(xù)培養(yǎng)12 h；第2組將香蕉苗從25℃降至15℃環(huán)境中并培養(yǎng)12 h；第3組：使香蕉苗從25℃降至10℃，并在10℃培養(yǎng)箱中生長12 h；第4組：將培養(yǎng)箱溫度降至7℃，將香蕉苗置于其中生長12 h；第5組：使香蕉苗從25℃降至在5℃，并在該低溫下處理材料12 h。處理期間光照強度均為2 000 lx，相對濕度為85%。處理完畢后，取各組材料心葉下第一片完全展開葉立即置于液氮中冷凍，提取RNA。

1.2.4.4 水澇脅迫處理 選取長勢一致的土栽苗，將根部全部浸入水中進行澇害實驗，設置淹水0、12、24 和36 h 4個處理，每個處理重復3次。定期取樣：直徑為1 mm左右白色新嫩根，迅速吸干根表面水分，立即用液氮速凍，提取RNA。

圖1 MaSIP2-1編碼的氨基酸序列與其他植物SIP2-1蛋白氨基酸同源性分析

2 結(jié)果

2.1 MaSIP2-1的克隆及序列分析

以正常生長的巴西蕉幼苗葉片cDNA為模板，MaSIP2-1 S1和MaSIP2-1 S2為引物，從香蕉栽培品種巴西蕉中克隆到一個AQP家族基因，其ORF為717 bp，編碼239個氨基酸。利用DNAman 將MaSIP2-1 cDNA 推導的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其它高等植物的SIP氨基酸序列進行同源關(guān)系比較，結(jié)果（圖1）顯示，各種植物SIP編碼的氨基酸序列存在較高的同源性，多數(shù)達63%以上。BLASTX分析表明，MaSIP2-1編碼的氨基酸序列與馬來西亞野生蕉MaSIP2-1-like（XP_009402451.1）、油棕EgSIP2-1（XP_010909819）、麻風樹JcSIP2-1（XP_012079611）、野茶樹CsSIP2-1（AHE93339.1）編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為98%、74%、65%和63%。利用Clustal X1.81和MEGA 3.1軟件，將MaSIP2-1 cDNA推導的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其它植物的SIP氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹的比對分析。結(jié)果（圖2）表明，本研究得到的 巴西蕉MaSIP2-1基因所編碼的氨基酸序列與馬來西亞野生蕉MaSIP2-1-like具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 不同植物SIP2-1氨基酸序列的系統(tǒng)樹分析

2.2 MaSIP2-1在香蕉不同器官中的表達特性

MaSIP2-1在香蕉的根、莖、葉片、花和果實各器官中均有所表達，其中在莖中表達量較高，是葉中表達量的12.22倍。在葉中的表達量最低為1，而在根、花和果實中表達量分別為3.83和1.3（圖3）。

圖3 MaSIP2-1在香蕉不同器官中的qPCR表達分析

2.3 MaSIP2-1基因在非生物脅迫處理下的表達分析

為了研究MaSIP2-1基因是否響應外界非生物脅迫，利用qPCR對MaSIP2-1在干旱、高鹽、低溫、水澇脅迫處理下葉片中的表達模式進行分析，如圖4所示，在干旱處理下，MaSIP2-1在土壤水分含量為60%是表達量最高，隨著水分含量降低，其表達量逐漸受到抑制。用300 mmol/L高鹽對香蕉幼苗進行脅迫處理，于0、2、4 和6 h分別取樣，如圖5所示，MaSIP2-1在高鹽脅迫處理4 h時被高度誘導表達，隨后其表達量又下降，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其在4 h的表達量分別為0、2和6 h的12.72、6.10和1.71倍。

圖4 MaSIP2-1在干旱脅迫下的差異表達

圖5 MaSIP2-1在高鹽脅迫下的差異表達

對其進行低溫脅迫處理，如圖6所示，隨著溫度的降低，MaSIP2-1的表達量均沒有呈現(xiàn)太大的變化，表達量均在1以下，其并未受到溫度的誘導表達。

在澇害脅迫處理下，如圖7所示，將香蕉苗淹水處理24 h后，其表達量達到最高值為2.13，而在處理36 h后其表達量反而達到最低值，說明淹水處理24 h時能夠高度誘導MaSIP2-1的表達。

3 討論

許多研究表明，水通道蛋白基因的表達和生物活性受到包括非生物脅迫，植物激素等許多信號的影響［6，10，16-19］。其響應非生物脅迫的調(diào)控及生物學功能是十分復雜的，在許多轉(zhuǎn)基因植株中，已經(jīng)證明了一些水通道蛋白能夠提高對非生物脅迫的耐受性［7，9，20-22］。例如，在擬南芥中過表達MaPIP1；1提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和高鹽脅迫的響應，而且轉(zhuǎn)基因株系的根系增長，根毛增多［23］。過表達TaAQP8使轉(zhuǎn)基因植株根系在高鹽脅迫下根系伸長［24］。在高鹽脅迫下，煙草NtAQP1能使轉(zhuǎn)基因植株提高水分利用率［7］。在200 mmol/L NaCl的處理下，大麥 HvPIP2能夠調(diào)節(jié)水分的流失，在非洲爪蟾卵母細胞中表現(xiàn)出了較強的水轉(zhuǎn)運活性［17］。在植物中過量表達一些AQP能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱脅迫的耐受性［7，9，22，24］。例如，過表達TaAQP7提高了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受性［24］。在干旱脅迫時，麻瘋樹根和莖中 JcPIP2被誘導表達［25］。在擬南芥中轉(zhuǎn)化大麥TaTIP2；2提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的響應，而且這種響應是通過不依賴于ABA的信號途徑［26］。MusaPIP1；2轉(zhuǎn)香蕉植株中，表現(xiàn)出了較好的抗逆的特性［27］。在Sreedharan 的研究中，將MusaPIP1；2轉(zhuǎn)化香蕉，轉(zhuǎn)基因植株在干旱處理后復水，其恢復能力明顯強于野生型。同時，對其生理生化指標進行測定，相對于對照其丙二醛含量降低，脯氨酸含量提高，相對水含量提高，說明轉(zhuǎn)基因植株具有較強的抗旱性。

圖6 MaSIP2-1在低溫脅迫下的差異表達

圖7 MaSIP2-1在水澇脅迫下的差異表達

本實驗從香蕉中克隆出香蕉水通道蛋白基因MaSIP2-1，為了進一步研究MaSIP2-1能否響應外界的非生物脅迫，本實驗用干旱、高鹽、低溫以及水澇脅迫處理香蕉幼苗，結(jié)果表明，在干旱脅迫處理下，土壤水分含量為60%時MaSIP2-1被高度誘導表達，當土壤水分減少至45%和30%時，MaSIP2-1表達下調(diào)，說明該基因響應外界干旱脅迫。在高鹽脅迫處理下，當處理2 h時其表達量升高，在4 h時達到峰值，處理6 h后表達反而下調(diào)，呈現(xiàn)先升后降的趨勢。該實驗結(jié)果表明MaSIP2-1受到高鹽脅迫的誘導表達。該結(jié)果與候曉婉等［28］報道的巴西蕉和粉蕉中MaPIP2-6在甘露醇和高鹽脅迫處理下的表達趨勢基本一致，在處理早期輕微下降，而后被誘導達到最大值，接著下降。結(jié)果表明，該基因在響應滲透脅迫的過程中，可能在早期出現(xiàn)了一個‘Shock’，隨后呈現(xiàn)出被誘導的趨勢。而在低溫處理下，該基因的表達量變化差異不顯著，其表達量均在1以下，表明其并未受到低溫誘導表達。在擬南芥中，低溫脅迫能夠誘導AtPIP2；5和AtPIP2；6表 達，卻抑制了AtPIP1；5和AtPIP2；3等基因的表達［29］。因此，AQP家族成員對低溫脅迫的響應表現(xiàn)出不同的模式。在水澇脅迫處理時，與對照相比，淹水處理12 h時MaSIP2-1表達下調(diào)，而處理24 h時MaSIP2-1被高度誘導表達，達到峰值，為對照的2.2倍，隨著處理時間的增加當達到36 h時，其表達量下調(diào)達到最低值，說明MaSIP2-1能夠被水澇脅迫誘導表達。

4 結(jié)論

綜上所述，本實驗中克隆到的香蕉MaSIP2-1屬于AQP家族中SIP亞類中的一個，QPCR實驗表明MaSIP2-1能夠參與非生物逆境脅迫應答，響應非生物脅迫包括干旱、高鹽和水澇脅迫。

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（責任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning and Expression Analysis of Aquaporins SIP2-1 Gene from Banana

XU Yi1，2HOU Xiao-wan3XU Bi-yu2JIN Zhi-qiang1，2HU Wei2SONG Shun1
（1. Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement，Haikou Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，
Haikou 570102；2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology（Ministry of Agriculture），Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101；3. South Subtropical Crops Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524091）

In the present study，we isolated an aquaporin gene from banana，and designated as MaSIP2-1. MaSIP2-1’s complete ORF was 717 bp，and it encoded 239 amino acids. Alignment of amino acid sequences and phylogenetic analysis indicated that the protein encoded by MaSIP2-1 was in high similarity with AQP-encoding protein in the other known plants；and highly homologous with amino acid sequences in Musa acuminate，Elaeis guineensis，Jatropha curcas，and Camellia sinensis by 98%，74%，65%，and 63%，respectively. Organ-specific analysis showed that MaSIP2-1 constitutively expressed in roots，stems，leaves，flowers and fruits，and the highest in stems. Stress analysis demonstrated that MaSIP2-1 responded to the stress such as the drought，salt and waterlogging.

aquaporins；SIP；banana；bioinformatics；stress；real-time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.012

2015-10-22

國家自然科學基金項目（31071788，31501371），海南省自然科學基金項目（314099），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金項目（CARS-32），“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目（2011AA10020605）

許奕，女，碩士，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：lukydog163@163.com

宋順，男，碩士，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：sss1984006@163.com