凌瑞孫立潔，2陳祥松袁麗霞吳金勇姚建銘

（1. 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所，合肥 230031；2. 中國(guó)科學(xué)院湖北產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與育成中心，武漢 430072）

技術(shù)與方法

高山被孢霉的基因組及轉(zhuǎn)錄組的提取技術(shù)研究

凌瑞1孫立潔1，2陳祥松1袁麗霞1吳金勇1姚建銘1

（1. 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所，合肥 230031；2. 中國(guó)科學(xué)院湖北產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與育成中心，武漢 430072）

基因組和轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序?qū)悠返募兌群秃恳筝^高，旨在通過研究高山被孢霉在不同培養(yǎng)條件下和采用不同菌絲處理方法對(duì)其基因組和轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量的影響來(lái)確定最佳提取方式。結(jié)果表明，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲與發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲經(jīng)基因組提取后在瓊脂糖凝膠電泳中有明顯不同的表現(xiàn)，使用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲提取的基因組DNA無(wú)降解，而以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲提取的基因組DNA出現(xiàn)部分降解。在使用國(guó)產(chǎn)試劑盒做高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組RNA提取實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用液氮速凍后破碎菌絲并結(jié)合使用β-疏基乙醇更易提取到高濃度且無(wú)降解的轉(zhuǎn)錄組樣品。

高山被孢霉；基因組；轉(zhuǎn)錄組；提取技術(shù)

隨著微生物分子技術(shù)的發(fā)展，對(duì)真菌基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全序列測(cè)定進(jìn)而分析關(guān)鍵酶、基因及其動(dòng)態(tài)變化是定向改造菌種特性的依據(jù)，并已逐漸成為微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。提取基因組和轉(zhuǎn)錄組則是測(cè)序的第一步，其質(zhì)量及收率決定著能否進(jìn)行有效測(cè)序并得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。多種真菌的基因組提取方法已見報(bào)道［1-3］，但每種真菌有其獨(dú)特的生理特性，基因組和轉(zhuǎn)錄組的提取技術(shù)和方法不盡相同。高山被孢霉（Mortierella alpina）是一類絲狀真菌，是工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）的高產(chǎn)菌種，在基因序列中，有高達(dá)60%的基因參與脂肪酸代謝［4］。

高山被孢霉培養(yǎng)條件一般有3種：PDA固體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。由PDA固體培養(yǎng)基及PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲提取基因組的優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)單易行、節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間；其缺點(diǎn)是菌絲量較小，易受PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯DNA的干擾；由液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲提取基因組的優(yōu)勢(shì)在于菌絲量大，可降低外源DNA干擾，提取效率高，缺點(diǎn)是培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，操作相對(duì)繁瑣復(fù)雜。

高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組的提取過程相對(duì)于基因組提取過程對(duì)環(huán)境和操作技術(shù)的要求更高、更復(fù)雜。對(duì)于高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組的提取方法報(bào)道較少［5］，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，使用繁瑣的化學(xué)試劑進(jìn)行各類生物和細(xì)胞組織的基因組和轉(zhuǎn)錄組的提取已基本被方便快捷高效的試劑盒所取代，而進(jìn)口的試劑盒價(jià)格高昂，使得很多實(shí)驗(yàn)室望而卻步。本研究首次使用國(guó)產(chǎn)試劑盒對(duì)高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行提取，并通過電泳、OD值、RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，旨在確定提取高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 高山被孢霉Mortierella alpina cfcc88447，購(gòu)于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。高山被孢霉Mortierella alpina G2，由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，菌種以甘油管保存于-80℃冰箱內(nèi)，每6個(gè)月轉(zhuǎn)存一次。

1.1.2 儀器和設(shè)備 氣相色譜儀：GC1690，島津；自動(dòng)凝膠成像儀：JS-680D，500萬(wàn)像素，上海培清；流式芯片：Agilent 2100 生物分析儀，美國(guó)；微量紫外分光光度計(jì)：Thermo NANODROP，美國(guó)；PCR擴(kuò)增儀：Bio-Rad，MyCycler，美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，KH2PO40.05%，MgSO40.025%，pH自然。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.05%，MgSO40.025%，pH自然。菌種種子液培養(yǎng)基：葡萄糖8%，酵母粉2%，pH自然。菌種發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8%，酵母粉2%，pH自然。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)與菌絲收集 菌種活化：將甘油管保存的菌種分別轉(zhuǎn)接到PDA固體及液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5-8 d，濕度40%-60%。

接種方式：制備菌懸液，按5%的接入量至100 mL種子液培養(yǎng)基，220 r/min，28℃，培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：按8%的接入量接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，220 r/min，28℃，培養(yǎng)7-10 d。

菌絲收集：刮取PDA固體培養(yǎng)基表面菌絲，避免刮到培養(yǎng)基。PDA液體培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲使用接種環(huán)挑取，于無(wú)菌條件下使用超純水反復(fù)清洗4-5次，將洗凈菌絲轉(zhuǎn)移至無(wú)菌燒杯中。

1.2.3 高山被孢霉基因組提取 菌絲處理方法：將清洗完全的PDA固體培養(yǎng)基菌絲、PDA液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)菌絲置于真空冷凍干燥機(jī)中抽真空24 h至菌絲完全干燥，干燥后的菌絲放于研缽中，倒入液氮進(jìn)行研磨，將菌絲研磨的盡量細(xì)，收集菌粉，轉(zhuǎn)到離心管中?；蚪M提取方法：稱取菌粉0.04 g，使用QIAGEN試劑盒DNeasy Plant Mini Kit進(jìn)行抽提。

1.2.4 高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組提取 挑取發(fā)酵6 d的高山被孢霉菌絲至15 mL離心管中，用DEPC處理水清洗菌絲，反復(fù)多次，盡量去除多余水。稱量菌絲0.5 g至離心管中，使用北京艾德萊生物科技有限公司的RN38-EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取［6］；比較對(duì)破碎組織及分離RNA的兩種方法，方法一是直接取新鮮的菌絲組織稱取。0.5 g放入研缽，加入裂解液室溫下充分研磨成勻漿，迅速研磨讓組織和裂解液立即充分接觸以抑制RNA酶活性；方法二是稱取0.5 g菌絲用液氮速凍后取出立即進(jìn)行研磨，加強(qiáng)菌絲壁的裂解程度，研好后呈細(xì)漿狀。此時(shí)加入5% β-巰基乙醇及裂解液，于65℃水浴中預(yù)熱，加入到研磨好的菌漿中立即吹打混勻裂解，振蕩混勻后按照試劑盒步驟進(jìn)行提取。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 菌體生物量的測(cè)定 搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液用布氏漏斗進(jìn)行抽慮；抽干的菌體會(huì)形成菌餅，計(jì)算干重W即為生物量。

1.2.6.2 總油脂抽提和計(jì)算方法（索氏提取法）將烘干的菌體放入研缽進(jìn)行研磨至細(xì)小的顆粒狀，稱取上述研磨的顆粒（粉末）1-2 g，取精確值W0，用濾紙包住，系上棉繩，放入烘箱105℃烘至恒重（約30 min），稱濾紙包重量W1；將烘后的濾紙包放入索氏提取器內(nèi)，用石油醚進(jìn)行索氏提取，8-10 h后取出，105℃烘干，稱紙包重量W2。

總油脂%=（W1-W2）/ W0×100%

1.2.6.3 油脂中ARA百分含量的測(cè)定和計(jì)算 （1）樣品處理（甲酯化）：稱取研磨菌渣0.1 g左右，加入0.5%氫氧化鉀甲醇溶液1 mL，60℃水浴30 min，每5 min搖勻一次，加入三氟化硼甲醇溶液1 mL，60℃水浴30 min，每5 min搖勻一次，取出后，加入2 mL正己烷，混勻后加入1 mL飽和氯化鈉溶液，反應(yīng)完畢。4 000 r/min離心5 min，取上層進(jìn)行氣相檢測(cè)。（2）氣相色譜條件：DB-23ms（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管色譜柱柱；柱溫程序：90℃保持1 min，以9℃/min升至240℃，保持5 min；載氣：氮?dú)?；流速：約2.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣（分流比1∶10）；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)器溫度：280℃。（3）計(jì)算方法：ARA百分含量的計(jì)算使用的是面積歸一法，即ARA在氣相檢測(cè)圖譜中的峰面積占總峰面積的百分比。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組的分析 DNA樣品進(jìn)行電泳：取1 μL loading buffer（6×）與5 μL DNA樣品混合，緩慢將樣品及Marker分別注入加樣孔中，跑膠電壓90 V。在瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)中使用配套軟件，進(jìn)行樣品質(zhì)量分析。樣品濃度使用Thermo NANODROP設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)轉(zhuǎn)錄組的分析 RNA樣品進(jìn)行電泳：取1 μL loading buffer（6×）與5 μL RNA樣品混合，緩慢將樣品及Marker分別注入加樣孔中，跑膠電壓100 V。在瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)中使用配套軟件，進(jìn)行樣品質(zhì)量的分析。樣品濃度使用Thermo NANODROP設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 RT-PCR 取1.2.4中方法二提取的轉(zhuǎn)錄組，使用北京艾德萊生物科技有限公司的PC1801試劑盒合成第一鏈cDNA。引物設(shè)計(jì)：選取高山被孢霉GMER蛋白設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，即LR1：5'-AT GTCTCCCTCAAAGTCGGTCATCATGGTC-3'；LR2：5'-CCATAGTTGGAGTCGTGGGGAGGTCCTT-3'。反應(yīng)體系：使用北京艾德萊生物科技有限公司的PC0902 Taq PCR MassterMix。PCR擴(kuò)增程序如為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1-2 kb/min，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。

1.2.10 高山被孢霉結(jié)晶紫染色方法 載玻片固定：在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取少量菌絲于干凈的載玻片上涂布均勻，加熱以殺死菌種并使其粘附固定；草酸銨結(jié)晶紫染1 min；自來(lái)水沖洗，去掉浮色。

2 結(jié)果

2.1 高山被孢霉菌絲來(lái)源對(duì)基因組提取的影響

對(duì)PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的高山被孢霉菌絲、PDA液體培養(yǎng)基中的菌絲和三角瓶中培養(yǎng)的液體發(fā)酵菌絲進(jìn)行同等條件下的基因組提取實(shí)驗(yàn)，比較菌絲生理狀態(tài)、提取純度和提取收率，并確定最優(yōu)的基因組提取方法。本實(shí)驗(yàn)所使用菌種為高山被孢霉cfcc88447，培養(yǎng)于PDA固體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基的菌絲與發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌絲略有不同（表1），顯微鏡觀察染色后的對(duì)比圖片見圖1，染色前培養(yǎng)于PDA固體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，見圖2。

瓊脂糖凝膠電泳圖（圖3）顯示，PDA培養(yǎng)基中菌絲提取的基因組條帶不清晰，并出現(xiàn)了嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象（圖3中泳道1和2），而Marker樣品的條帶清晰，分離效果較好，證明電泳條件無(wú)問題。相對(duì)比而言，使用液體發(fā)酵菌絲提取的高山被孢霉基因組條帶非常清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，均出現(xiàn)此結(jié)果，表明PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的高山被孢霉菌絲用作基因組提取原料，樣品出現(xiàn)了部分DNA斷裂現(xiàn)象，且培養(yǎng)基中的馬鈴薯不易徹底去除，從而導(dǎo)致對(duì)DNA樣品造成污染，進(jìn)而對(duì)基因組測(cè)序造成干擾，影響DNA測(cè)序過程的分析和結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)基因組樣品進(jìn)行收率計(jì)算，使用液體發(fā)酵菌絲提取的基因組收率高且條帶清晰，滿足測(cè)序要求（表2）。

2.2 高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組提取方法的嘗試和改進(jìn)

進(jìn)口轉(zhuǎn)錄組提取試劑盒價(jià)格昂貴，且并非適合所有微生物轉(zhuǎn)錄組的提取，有時(shí)出現(xiàn)提取效率低，轉(zhuǎn)錄組純度和質(zhì)量不理想等問題。本研究首次嘗試使用國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)錄組試劑盒進(jìn)行高山被孢霉的轉(zhuǎn)錄組提取［7，8］，研究使用國(guó)產(chǎn)試劑盒提取高山被孢霉的轉(zhuǎn)錄組提取效果和條件，如該方法成功，將大大節(jié)約提取成本，還可對(duì)國(guó)產(chǎn)品牌起到一定的宣傳推廣作用。該實(shí)驗(yàn)所用菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的高山被孢霉G2菌。按照試劑盒提供方法所述進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組提取實(shí)驗(yàn)，見1.2.4中的具體提取方法描述，使用方法一中所述的在新鮮的菌絲體中加入裂解液，室溫下將菌絲充分研磨成勻漿，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，該方法提取得到的RNA濃度偏低達(dá)不到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所需總量和濃度要求（圖4中泳道1），推測(cè)由于高山被孢霉細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量較高，普通裂解液不能對(duì)其進(jìn)行完全破碎，導(dǎo)致RNA釋放受限，收率偏低。因而，在菌絲體處理方法上加以改進(jìn)，使用1.2.4中所述的方法二進(jìn)行提取，并用液氮對(duì)菌絲進(jìn)行迅速冷凍加強(qiáng)菌絲壁的破碎程度，然后使用裂解液及β-巰基乙醇的共同作用來(lái)裂解細(xì)胞壁釋放總RNA（圖4泳道2），經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，均證明RNA濃度提高了10-20倍以上，5S條帶非常弱，說(shuō)明RNA無(wú)明顯降解，經(jīng)RTPCR，成功獲得GMER的基因片段（圖4泳道3），因此所獲高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組的濃度和質(zhì)量均達(dá)到測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)［9］，具體濃度見表3。

圖1 高山被孢霉PDA固體培養(yǎng)基（A）、PDA液體培養(yǎng)基（B）、發(fā)酵培養(yǎng)基（C）經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫染色后的形態(tài)比較

圖2 高山被孢霉PDA固體培養(yǎng)基菌絲（A）、PDA液體培養(yǎng)基菌絲（B）、發(fā)酵培養(yǎng)基菌絲（C）的形態(tài)比較

表1 高山被孢霉（cfcc 88447）不同培養(yǎng)條件下菌絲主要特點(diǎn)

圖3 菌絲不同培養(yǎng)方式提取基因組的瓊脂糖凝膠成像圖譜比較

根據(jù)表3中數(shù)據(jù)顯示可知，使用兩種方法所獲得的RNA最終的A260/A230均大于2，說(shuō)明使用該試劑盒脫鹽較充分，A260/A280均大于2，且在數(shù)值2.2左右，說(shuō)明蛋白去除較徹底，經(jīng)比較兩種菌絲的前處理方法，證明以第二種方法，將菌絲速凍后進(jìn)行研磨提取，并加入β-巰基乙醇，可大大提高RNA收率，其質(zhì)量也可達(dá)到測(cè)序所需標(biāo)準(zhǔn)。綜合分析證明該試劑盒適合于高山被孢霉的轉(zhuǎn)錄組提取。

表2 高山被孢霉（cfcc 88447）不同培養(yǎng)條件下提取基因組質(zhì)量比較

圖4 RNA及RT-PCR瓊脂糖凝膠成像

表3 菌絲破裂處理方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組RNA質(zhì)量的影響比較

2.3 高山被孢霉基因組和轉(zhuǎn)錄組提取所使用的發(fā)酵菌絲的驗(yàn)證

高山被孢霉的每批次發(fā)酵是否正常主要是通過評(píng)判發(fā)酵菌絲的生物量、其中總油脂含量和ARA的百分含量這3項(xiàng)指標(biāo)，用以作為任何下一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論的基本依據(jù)。本研究中所涉及的基因組和轉(zhuǎn)錄組提取條件和技術(shù)的研究所使用的發(fā)酵菌絲體均同步進(jìn)行了該3項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，達(dá)到預(yù)期水平后方可進(jìn)行下一步的提取條件和技術(shù)的研究工作，ARA的GC圖譜見圖5，ARA的峰出現(xiàn)在17.763 s，含量為油脂總量的31.8791%。提取用菌絲發(fā)酵產(chǎn)量及正常發(fā)酵取值范圍，見表4。

圖5 氣相檢測(cè)ARA圖譜

表4 高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)量

3 討論

高山被孢霉屬于長(zhǎng)菌絲真菌類，含有豐富的多糖和蛋白質(zhì)，菌絲壁較厚，在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌絲體狀態(tài)均不相同，需找出可提取高質(zhì)量DNA的菌絲體培養(yǎng)來(lái)源，以滿足基因組測(cè)序和其他分子生物學(xué)操作的高標(biāo)準(zhǔn)要求。在真菌菌絲來(lái)源方面，本研究嘗試了使用來(lái)源為PDA固體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的菌絲作為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)反復(fù)證明，PDA固體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲提取的基因組出現(xiàn)部分降解斷裂現(xiàn)象，并不適合用于DNA提取，推測(cè)是由于PDA培養(yǎng)基中含有馬鈴薯，不易去除干凈，可干擾最終DNA的純度影響測(cè)序結(jié)果，并且可能由于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲內(nèi)可降解DNA的酶含量較高，或者馬鈴薯中可降解高山被孢霉的DNA酶難以去除導(dǎo)致最終DNA的部分降解。而使用發(fā)酵液培養(yǎng)的菌絲作為原料進(jìn)行基因組的提取，可獲得符合要求的高質(zhì)量DNA，無(wú)斷裂降解，且收率較高，可滿足包括基因組測(cè)序在內(nèi)的各類分子生物學(xué)操作分析使用。關(guān)于真菌的基因組提取方法，文獻(xiàn)中多有報(bào)道，一般可采用冷凍研磨CTAB法及試劑盒提取法，所得的總DNA純度和濃度也較高，較適合分子生物學(xué)操作的要求［10］。另有文獻(xiàn)指出采用微波爐加熱法取代液氮研磨以使絲狀真菌破壁，也達(dá)到了較好的提取效果［11-13］。

經(jīng)本研究表明，使用國(guó)產(chǎn)試劑盒用于提取高山被孢霉轉(zhuǎn)錄組，方法簡(jiǎn)易，效率高，蛋白質(zhì)殘留少，效果穩(wěn)定，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)電泳、OD值、RTPCR三種方法的驗(yàn)證，提取的RNA適合于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及常規(guī)分子生物學(xué)分析，在液氮研磨及β-巰基乙醇的提取方法中，經(jīng)證明可增加RNA收率在10-20倍以上，并且RNA無(wú)降解。推測(cè)可能是由于真菌組織中含有一定量的酚類化合物，其被氧化后與RNA結(jié)合，從而導(dǎo)致RNA分離困難，β-疏基乙醇的加入可避免酚類化合物被氧化，進(jìn)而提高RNA的終濃度。而且，高山被孢霉菌絲體長(zhǎng)且細(xì)胞壁因幾丁質(zhì)含量較高，使用常規(guī)的普通裂解液很難將壁完全破碎，因此使用低溫速凍的物理學(xué)破壁方法配合裂解液才能達(dá)到完全或大部分破壁的目的，提高收率，同時(shí)提取轉(zhuǎn)錄組所用菌絲的發(fā)酵產(chǎn)量正常，通過新一代測(cè)序技術(shù)可以有效確定高山被孢霉發(fā)酵期間基因表達(dá)情況。

因不同真菌或植物在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄組大小及酚類等雜質(zhì)對(duì)RNA提取的影響，在提取過程中，對(duì)試劑盒的基本方法加以改進(jìn)已較為普遍。除了本研究提到的改進(jìn)方法，另有研究表明在進(jìn)行葡萄葉片RNA提取時(shí)，延長(zhǎng)提取試劑與樣品的接觸時(shí)間操作可以顯著提高RNA提取純度［14］。隨著轉(zhuǎn)錄組的研究及RNA-Seq逐步受到重視，利用新一代測(cè)序技術(shù)能夠更為快速、準(zhǔn)確地為人們提供更多的生物體轉(zhuǎn)錄信息，進(jìn)而揭示生物體的基因表達(dá)、研究結(jié)構(gòu)變異及發(fā)現(xiàn)新基因等［15］。

4 結(jié)論

在基因組提取過程中，經(jīng)本研究對(duì)高山被孢霉3種培養(yǎng)方式的對(duì)比表明，PDA固體培養(yǎng)基及PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的高山被孢霉菌絲因出現(xiàn)了部分DNA斷裂、培養(yǎng)基中的馬鈴薯對(duì)DNA樣品造成污染等，提取的DNA會(huì)影響測(cè)序結(jié)果的分析及準(zhǔn)確性。與之相反，使用液體發(fā)酵液中培養(yǎng)的菌絲提取的高山被孢霉基因組條帶清晰基本無(wú)降解，且收率較高，可用于DNA測(cè)序分析。在轉(zhuǎn)錄組提取過程中，使用經(jīng)改進(jìn)的菌絲前處理方法，即使用快速冷凍物理方法，并配合β-巰基乙醇的共同作用，經(jīng)證明可大大增加RNA收率，且RNA降解率非?；兌雀撸酭NA適于測(cè)序或其他相關(guān)研究。

［1］陳鋒菊, 李百元, 楊冰, 等. 一種經(jīng)濟(jì)快速提取絲狀真菌基因組DNA的方法［J］. 生命科學(xué)研究, 2010, 14（2）：122-124.

［2］程國(guó)旺, 吳中華, 徐劍, 等. 高山被孢霉DNA提取方法的比較與改進(jìn)［J］. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 31（2）：203-206.

［3］蔡文嬌, 徐大彬, 藍(lán)霞, 等. 一種提取真菌基因組DNA的新方法［J］. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用, 2014, 3（3）：95-110.

［4］Wang L, Chen W, Feng Y, et al. Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina［J］. 2011, 6（12）：319-325.

［5］任巖. 高山被孢霉全基因組序列破譯、轉(zhuǎn)錄組分析、巖藻糖代謝研究及陰溝腸桿菌全基因組序列破譯［D］. 天津：南開大學(xué), 2010.

［6］Cheng YQ, Liu JF, et al. Construction of ethylene regulatory network based on the phytohormones related gene transcriptome profiling and prediction of transcription factor activities in soybean［J］. Acta Physiol Plant, 2013, 35（4）：1303-1317.

［7］吳田, 藍(lán)增全. 茶梅花瓣總RNA提取方法的比較和分析［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29（28）：129-133.

［8］Bajpai PK, et al. Production of arachidonic acid by Mortierella alpina ATCC 32222［J］. J Ind Microb, 1991, 8（3）：179-186.

［9］劉建民. 高山被孢霉多不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因克隆及轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜研究［D］. 武漢：華中科技大學(xué), 2010.

［10］張曉暉, 郭春華, 江曉霞, 等. 康氏木霉基因組DNA提取方法的比較研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2007（5）：128-130.

［11］劉少華, 等. 一種快速簡(jiǎn)便的植物病原真菌基因組DNA提取方法［J］. 植物病理學(xué)報(bào), 2005, 35：362-365.

［12］何慧, 何松哲, 陳懿, 等. 六種真菌基因組DNA快速提取方法比較［J］. 中華臨床感染病雜志, 2015, 8（1）：36-41.

［13］蔣云露, 楊建濤, 王猛, 等. 四川泡菜鹽鹵中微生物總基因組DNA提取方法的比較［J］. 中國(guó)釀造, 2015, 34（4）：90-92.

［14］楊曉燕, 等. 適合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的葡萄葉片總RNA試劑盒提取法的改進(jìn)［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2013（6）：215-220.

［15］張春蘭, 秦孜娟, 王桂芝, 等. 轉(zhuǎn)錄組與RNA-Seq技術(shù)［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2012（12）：51-56.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Technologies of Extracting Genome and Transcriptome from Mortierella alpina

LING Rui1SUN Li-jie1，2CHEN Xiang-song1YUAN Li-xia1WU Jin-yong1YAO Jian-ming1
（1. Institute of Plasma Physics Chinese Academy of Sciences，Hefei Institute of Physical Science，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031；2. Hubei High-tech Innovation and Business Incubation Center，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072）

High-throughput sequencing of transcriptome and genome demands the high purity and content of sample，the purpose of this work is to determine the optimal extraction technology by studying the effects of Mortierella alpina in different culture conditions and using different hypha processing methods on the genome and transcriptome quality. The results showed that the mycelium from liquid fermentation medium after genome extraction presented a significant difference in agarose gel electrophoresis compared to the mycelium from PDA culture medium，the former gave degradation-free genome DNA but the latter was extracted genomic DNA of some degradation. During using domestic brand kit to study M. alpina tanscriptome RNA extraction，it was found that using liquid nitrogen fast-frozen method to break the hypha cell wall combined with applying β-Mercaptoethanol resulted in more likely to extract the high concentration and no-degradation transcription sample.

Mortierella alpina；genome；transcriptome；extraction technology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.005

2015-09-06

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2014AA021703），教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（教外司留［2013］693號(hào)）

凌瑞，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵工程與代謝調(diào)控；E-mail：lrr@mail.ustc.edu.cn

姚建銘，男，研究員，研究方向：低能離子束誘變育種、微生物發(fā)酵工程與代謝調(diào)控；E-mail：jmyao@ipp.ac.cn

孫立潔，女，副研究員，研究方向：微生物發(fā)酵工程與代謝調(diào)控；E-mail：ljsun@ipp.ac.cn