復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中ICAM-1和IL-6表達的影響

葉翠萍，向麗，童東，王文倩,曾勇

·藥理毒理·

復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中ICAM-1和IL-6表達的影響

葉翠萍，向麗，童東，王文倩,曾勇

目的：觀察復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中ICAM-1和IL-6表達的影響。方法：連續(xù)6周給家兔耳緣靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白制得腎炎模型，將動物分為空白對照組、模型對照組、復(fù)方保腎顆粒1.2、0.6、0.3 g．kg-1劑量組、醋酸地塞米松組，灌胃給藥10周后，用免疫組化發(fā)檢測ICAM-1和IL-6在家兔腎臟中的表達情況。結(jié)果：復(fù)方保腎顆粒能明顯降低C-BSA腎炎模型家兔腎臟中ICAM-1和IL-6的積分光密度值。結(jié)論：復(fù)方保腎顆粒治療慢性腎炎的作用機制可能為通過降低ICAM-1、IL-6這兩種細胞因子的活性來達到抑制腎臟組織病變，從而達到改善腎功能的目的。

復(fù)方保腎顆粒；慢性腎炎；C-BSA；ICAM-1；IL-6

復(fù)方保腎顆粒是由黃芪、絡(luò)石藤、魚腥草等中藥組成的臨床科研經(jīng)驗方，具有祛風清熱利濕，活血通絡(luò)之功效，前期研究已經(jīng)證實其對家兔C-BSA陽離子化牛血清白蛋白型實驗性腎炎模型具有良好的治療作用[1]，不僅能能降低模型家兔的尿蛋白、血清肌酐、尿素氮含量，還能減輕腎臟的損傷程度。臨床上慢性腎炎是由循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）沉積于腎小球，從而引起一系列炎癥反應(yīng)而致，這一發(fā)病機制已經(jīng)得到公認，因此動物模型也以免疫模型最佳。本文選取了細胞間粘附因子-1（ICAM-1）和白介素-6（IL-6）兩種腎病常見的免疫炎癥因子，通過檢測其在家兔腎臟組織中的分布來進一步探求復(fù)方保腎顆?？赡艿淖饔脵C制。

1 材料

1.1 實驗動物

家兔，雌雄各半，體重1.8-2.0 kg。由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2008-24。

1.2 實驗藥物

復(fù)方保腎顆粒，由黃芪、絡(luò)石藤、魚腥草、土牛膝、水紅花子等中藥組成，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取濃縮成干浸膏并粉碎，與部分藥材粉末混合成浸膏粉，每1 g浸膏粉含5 g生藥量，批號：20120511，由成都中醫(yī)藥大學炮制與制劑教研室提供，測得浸膏粉中黃芪甲苷含量為0.379 mg．g-1，臨用前用0.3%CMCNa配成濃度分別為0.12、0.06、0.03 g．mL-1的混懸液；醋酸地塞米松片，由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：20130123，臨用前用0.3%CMC-Na配成濃度為0.01 mg．mL-1的混懸液。

1.3 實驗試劑

天然牛血清白蛋白（BSA）、大腸桿菌內(nèi)毒素：Sigma公司。無水乙二胺（EDA）：四川西隴化工有限公司。碳化二亞胺（EDC）：上海共價化學科技有限公司。兔抗ICAM-1、兔抗IL-6：博奧森生物技術(shù)有限公司。生物素化山羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標記鏈霉素卵蛋白、顯色劑DAB：北京中山金橋生物有限公司。陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)：參考Border[2]方法加以改進，制得陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA），于4℃保存，臨用前溶于PH=7.4的磷酸鹽緩沖液。

1.4 主要儀器

冷凍干燥機（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（浙江余姚工業(yè)儀表二廠）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；切片機（徠卡-1015，德國）；TSJ-Q型全自動封閉式組織脫水機；BMJ-Ⅲ型包埋機；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威醫(yī)療儀器有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Motic BA400顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪公司）；Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics，Inc.公司）；顯微鏡Motic BA400等。

2 方法[3～5]

2.1 模型制備

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取兩次測尿蛋白均為陰性的家兔用于實驗。預(yù)免疫：每只家兔每天耳緣靜脈注射1 μg大腸桿菌內(nèi)毒毒和1 mg C-BSA，連續(xù)7天。正式免疫：將預(yù)免疫的家兔每只每天耳緣靜脈注射C-BSA 10 mg，連續(xù)6周（第6周劑量加倍）。

2.2 分組及給藥

將造模成功的家兔按尿蛋白濃度、性別和體重均衡分組，隨機分為五組：模型對照組(0.3%CMCNa)，復(fù)方保腎顆粒3個劑量組（1.2、0.6、0.3 g．kg-1），醋酸地塞米松組(0.1 mg．kg-1)，另取未經(jīng)免疫的家兔作為空白對照組(0.3%CMC-Na)。按前述劑量連續(xù)灌胃給藥10周。

2.3 取材處理

于給藥結(jié)束后處死家兔，取相同部位的部分腎組織，10%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成 2 μm 的石蠟切片，采用SP法作腎臟組織ICAM-1、IL-1免疫組化檢測。

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中ICAM-1含量的影響 與空白對照組比較，模型組家兔腎臟組織ICAM-1積分光密度（IOD）值極顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，醋酸地塞米松組家兔腎臟組織ICAM-1積分光密度（IOD）值極顯著降低(P＜0.01)，復(fù)方保腎顆粒1.2 g．kg-1高劑量組家兔腎臟組織ICAM-1積分光密度（IOD）值顯著降低(P＜0.05)。復(fù)方保腎顆粒0.6 g．kg-1、0.3 g．kg-1劑量組雖無顯著性差異（P＞0.05），但有改善趨勢。結(jié)果見表1、圖1。

表1 復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中ICAM-1表達的影響 (±S)

表1 復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中ICAM-1表達的影響 (±S)

注：與模型對照組比較, *p＜0.05,**p＜0.01

組別劑量(g．kg-1)動物數(shù)(只)ICAM-1(IOD)空白對照組——80.1180±0.0318**模型對照組——70.2453±0.0175復(fù)方保腎顆粒1.260.1739±0.0325*復(fù)方保腎顆粒0.670.1914±0.0421復(fù)方保腎顆粒0.370.2169±0.0068醋酸地塞米松組0.1×10-360.1521±0.0312**

圖1 各組家兔腎臟組織ICAM-1免疫組織化學圖片（IHC×200）

3.2 復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中IL-6含量的影響 與空白對照組比較，模型組家兔腎臟組織IL-6積分光密度（IOD）顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，醋酸地塞米松組家兔腎臟組織IL-6積分光密度（IOD）顯著降低(P＜0.05)，復(fù)方保腎顆粒1.2 、0.6、0.3 g．kg-1劑量組雖無顯著性差異（P＞0.05），但均有不同程度的改善趨勢。結(jié)果見表2、圖2。

表2 復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中IL-6表達的影響(±S)

表2 復(fù)方保腎顆粒對C-BSA型腎炎家兔腎組織中IL-6表達的影響(±S)

注：與模型對照組比較, *p＜0.05

組別劑量（g．kg-1)動物數(shù)(只)ICAM-1(IOD)空白對照組——80.1776±0.0019*模型對照組——70.2270±0.0059復(fù)方保腎顆粒1.260.1907±0.0144復(fù)方保腎顆粒0.670.1902±0.0102復(fù)方保腎顆粒0.370.1935±0.0119醋酸地塞米松組0.1×10-360.1782±0.0068*

圖2 各組家兔腎臟組織IL-6免疫組織化學圖片（IHC×200）

4 討論

近年來,隨著分子生物學技術(shù)在腎臟病研究領(lǐng)域的應(yīng)用，一系列具有重要致炎作用的炎癥介質(zhì)被認識，現(xiàn)已證實細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α在腎炎發(fā)病機制中具有重要作用[6]。此外，還有ICAM-1、bFGF、TGF-β、CTGF等細胞因子也參與了腎臟的疾病[7]。在腎小管、腎間質(zhì)進行性損傷的過程中，巨噬細胞可產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì),如ICAM-1，它可作用于腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)成纖維細胞使之活化，既促使腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)肌成纖維細胞產(chǎn)生細胞外間質(zhì)，造成間質(zhì)纖維化，又促使上述細胞進一步產(chǎn)生炎癥因子造成病變的惡性循環(huán)[8]。

復(fù)方保腎顆粒是由多種中藥組成的臨床經(jīng)驗復(fù)方，在臨床上治療慢性腎炎之風濕熱擾腎，腎絡(luò)瘀痹證。前期藥效學研究已經(jīng)證實其能夠降低腎炎模型家兔的尿蛋白和血清腎功能特征性指標的含量，還能減輕腎臟的損傷程度。在本實驗中，將研究角度滲入到更深層次的水平進行探索，采用免疫組織化學法測定與腎炎相關(guān)的兩個細胞因子（ICAM-1、IL-6）在家兔腎臟中的表達分布情況（積分光密度）。本實驗結(jié)果表明，模型家兔腎臟中ICAM-1、IL-6的積分光密度值顯著性增加（P＜0.01或P＜0.01），隨著復(fù)方保腎顆粒的干預(yù)治療后，各劑量組對模型家兔腎臟中ICAM-1、IL-6的積分光密度值有不同程度的降低作用，因此提示我們復(fù)方保腎顆粒治療慢性腎炎的作用機制可能為通過降低ICAM-1、IL-6這兩種細胞因子的活性來達到抑制腎臟組織病變，從而達到改善腎功能的目的。

[1] 林波,劉宇,向麗等.復(fù)方保腎顆粒對家兔C-BSA異種血清免疫復(fù)合型腎炎模型的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2014,30(3)：121.

[2] Border W A, Harry J W, Kamil E S, et al. Induction of membranousnephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen： demonstration of a pathogenic role for electrical charge[J]. Journal of Clinical Investigation,1982,69(2)：451.

[3] 魏偉,吳希美,李元建.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2010：1218.

[4] 韓琳,張邊江,陳志強.腎舒康對家兔C-BSA腎炎模型治療作用的研究[J].河北中醫(yī)藥學報,2006,21(3)：5.

[5] 趙玉庸,陳志強,白云靜,等.慢腎消對家兔實驗性膜性腎炎的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2001,7(7)：36.

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[7] 國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1986.

[8] 佟丹丹,金曉明,張磊,等.IgA腎病中ICAM-1和bFGF的表達與腎小管、腎間質(zhì)損傷的關(guān)系[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,2004,38(2)：118.

（責任編輯：陳思敏）

The effects of Fufangbaoshen granule on expression of ICAM-1 and IL-6 in kidney tissue from rabbit with C-BSA nephritis

/YE Cui-ping, XIANG Li, TONG Dong, WANG Wen-qian, ZENG Yong //(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To investigate the effect of Fufangbaoshen granule on expression of ICAM-1 and IL-6 in kidney tissue from rabbit with C-BSA nephritis.Method:Nephritis model was established by continuously injection of cationization bovine serum albumin through rabbits’ ear vein for 6 weeks. Then the rabbits were divided into 6 groups： normal control group, model group, fufangbaoshen granule 1.2, 0.6, 0.3 g．kg-1group, dexamethasone group. After 10 weeks gavage administration of drugs, the expression of ICAM-1 and IL-6 from rabbits’ kidney tissue were observed.Result:Fufangbaoshen granule significantly decreased integral optical density(IOD) of ICAM-1 and IL-6 in rabbits’ kidneys.Conclusion:Fufangbaoshen granule treatment of chronic nephritis may be related to the decrease of the activities of ICAM-1 and IL-6 to inhibit renal tissue lesions and improve renal function.

Fufangbaoshen granule；chronic nephritis；C-BSA；CAM-1；IL-6

R 285.5

A

1674-926X(2016)05-011-004

四川省科技廳省青年科技創(chuàng)新研究團隊專項計劃項目（2014TD0007）

成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

葉翠萍，在讀碩士研究生，主要從事中藥藥效與毒理研究

Tel：13688428398 Email：wsmm0827@126.com

曾勇，教授，主要從事中藥藥效與毒理研究

Tel：13882179818 Email：zengy1976@163.com

2015-12-20