馬索羅酚對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠Th1/Th2細(xì)胞炎癥因子平衡的影響

張彥博　王高寧　孔鵬　王梁　郭力　李彬

馬索羅酚對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠Th1/Th2細(xì)胞炎癥因子平衡的影響

張彥博王高寧孔鵬王梁郭力李彬

050000河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

摘要:目的探討馬索羅酚對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-12、干擾素-γ(IFN-γ)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法將8～10周雌性C57BL/6小鼠54只隨機(jī)分成對照組、模型組、治療組。每組再隨機(jī)均分為發(fā)病后10 d及20 d亞組，每亞組9只。采用皮下注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)多肽0.1 mL誘導(dǎo)EAE模型。自發(fā)病當(dāng)天起，治療組小鼠給予馬索羅酚10 mg/(kg·d)治療，模型組及對照組給予等量5%二甲基亞砜(DMSO)10 mL/(kg·d)處理。比較3組小鼠臨床癥狀評分。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測小鼠脊髓和脾組織中IL-4、IL-12、IFN-γ mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA檢測腦組織中IL-4、IL-12、IFN-γ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與模型組比較，治療組小鼠臨床癥狀較減輕(P<0.05)。與模型組相比，治療組小鼠10 d時(shí)脊髓和脾組織IL-12、IFN-γ mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，IL-4 mRNA水平增高(P<0.05)，腦組織IL-12、IFN-γ蛋白水平降低(P<0.05)，IL-4蛋白水平增高(P<0.05)；與模型組相比，治療組20 d時(shí)脊髓組織IL-12、IFN-γ mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，腦組織IFN-γ含量降低(P<0.05)。結(jié)論馬索羅酚可能通過降低腦、脊髓及脾組織中IL-12、IFN-γ表達(dá)，增加IL-4表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞炎癥因子平衡，進(jìn)而改善EAE小鼠疾病嚴(yán)重程度。

關(guān)鍵詞:馬索羅酚；腦脊髓炎，自身免疫性，實(shí)驗(yàn)性；白細(xì)胞介素4；白細(xì)胞介素12；干擾素Ⅱ型

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種發(fā)生在腦和脊髓的以炎癥反應(yīng)、髓鞘脫失和軸索損傷為特征的自身免疫性疾病[1]。目前已有大量有關(guān)MS/實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)病機(jī)制的研究證明髓鞘激活的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生不同種類的促炎癥及抗炎癥因子，兩者之間的變化決定了MS/EAE嚴(yán)重程度及病程[2-3]。馬索羅酚(NDGA)是石炭酸灌木綠葉中提取的一種酚類化合物。既往研究表明NDGA通過調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1/ARE通路參與抗氧化反應(yīng)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤作用，已應(yīng)用于腫瘤治療。此外，其在中樞系統(tǒng)變性疾病如阿爾茨海默病、帕金森綜合征，以及缺血再灌注損傷等疾病中均具有保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建C57BL/6小鼠EAE模型，觀察NDGA是否通過糾正Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡以緩解EAE病情。

1材料和方法

1.1動(dòng)物近交系SPF級雌性C57BL/6小鼠共54只，8～10周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。將小鼠隨機(jī)分成對照組、模型組和治療組。依據(jù)EAE模型達(dá)到發(fā)病高峰期(發(fā)病后10 d)及緩解期(發(fā)病后20 d)的時(shí)間[5]，將各組再隨機(jī)分為發(fā)病后10 d組及20 d組，各亞組為9只。

1.2主要試劑和材料 NDGA購自百靈威科技有限公司；髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)購自西安霖肽生物科技有限公司；完全福氏佐劑購自美國Sigma公司；百日咳毒素購自ENZO corporation；結(jié)核菌素H37Ra，購自美國DIFICO corporation；All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒以及All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購自復(fù)能基因公司；小鼠干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-12定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自中國上海巧伊生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR引物由賽百盛公司合成，序列如下：IFN-γ：上游5′-AGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGA-3′，下游5′-TCAGGTGTGATTCAATGACGCTTAT-3′；IL-12：上游5′-GGTGTCTTAGCCAGTCCCGA-3′，下游5′-GGTTTGGTCCCGTGTGATGT-3′；IL-4：上游5′-TCGTCTGTAGGGCTTCCAAGGTGCT-3′，下游5′-GTGGACTTGGACTCATTCATGGTGC-3′。

1.3方法

1.3.1EAE動(dòng)物模型建立：按參考文獻(xiàn)[5]方法制作EAE模型，給予小鼠皮下注射5 mg/mL MOG35-55多肽0.1 mL誘導(dǎo)EAE模型，對照組以相同方法給予等量生理鹽水。以小鼠weaver評分≥1分為造模成功[6]。治療組自發(fā)病(記為第0天)起給予腹腔注射NDGA溶液(1 mg NDGA溶于1 mL 5% DMSO)10 mg/(kg·d)，模型組于發(fā)病起、對照組自EAE造模半數(shù)動(dòng)物發(fā)病起給予同等體積5%DMSO 10 mL/(kg·d)處理。

1.3.2臨床癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)：于免疫當(dāng)天起每天對小鼠稱重并進(jìn)行神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分采用weaver(15分)法[6]，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：尾巴：無癥狀0分，張力減低或遠(yuǎn)端癱瘓1分，全癱2分；四肢：無癥狀0分，步態(tài)不穩(wěn)1分，肢體輕癱、行走時(shí)肢體拖曳2分，肢體全癱，行走時(shí)肢體外翻3分。計(jì)算各部位評分總和，如小鼠死亡時(shí)計(jì)為15分。計(jì)算各組小鼠每天平均臨床癥狀評分。

1.3.3組織取材：于注射NDGA或DMSO后10 d、20 d從各組隨機(jī)取9只小鼠，置冰盤上迅速取腦、脊髓、脾，置液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。其中4只小鼠用于脊髓及脾組織細(xì)胞因子mRNA檢測，5只小鼠用于腦組織細(xì)胞因子蛋白檢測。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá)水平：取小鼠脊髓及脾組織，用Trizol提取每個(gè)樣本的總RNA，All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測IL-4、IL-12、IFN-γ mRNA表達(dá)水平。GAPDH作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，重復(fù)45個(gè)循環(huán)。70℃至95℃繪制熔解曲線。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因的Ct 差值，計(jì)算IL-4、IL-12、IFN-γ mRNA相對表達(dá)量。

1.3.5ELISA方法檢測蛋白表達(dá)水平：取小鼠腦組織，采用4℃混有蛋白酶抑制劑的0.1% PBS溶液制備10%腦組織勻漿液，并置4℃以2655g離心10 min。取上清液，按定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書檢測IL-4、IL-12、IFN-γ蛋白濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Shapiro-Wilk法對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Levene法對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)組間比較應(yīng)用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1臨床癥狀評分比較 模型組及治療組小鼠免疫后全部發(fā)病，平均發(fā)病潛伏期分別為模型組(11.33±1.00)d，治療組(11.44±1.23)d。主要臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振、體重下降、尾部遠(yuǎn)端無力下垂，伴有皮毛暗淡、食欲下降。模型組小鼠癥狀逐漸加重，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、后肢癱瘓、大小便失禁，嚴(yán)重者累及雙前肢，進(jìn)入緩解期后癥狀較前好轉(zhuǎn)，肢體無力較前減輕，但仍遺留尾部及雙后肢癱瘓。治療組小鼠癥狀較EAE模型組輕，無累及前肢及大小便失禁者，恢復(fù)期僅遺留尾部癱瘓癥狀。對照組小鼠體重漸增，反應(yīng)靈敏，尾部有張力。具體臨床癥狀評分比較見圖1。

2.2脊髓及脾組織IL-4、IL-12、IFN-γ mRNA表達(dá)發(fā)病10 d時(shí)，與對照組相比，模型組脊髓及脾組織IL-12、IFN-γ mRNA水平增高(P<0.05)，IL-4 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組IL-12、IFN-γ mRNA水平降低(P<0.05)，IL-4 mRNA水平增高(P<0.05)。發(fā)病20 d時(shí)，與對照組相比，模型組脊髓組織中IL-12、IFN-γ水平增高(P<0.05)；與模型組相比，治療組IL-12、IFN-γ水平降低(P<0.05)。具體結(jié)果見表1、2。

與模型組相比，*P<0.05

圖1各組小鼠發(fā)病后不同時(shí)間weaver評分比較

2.3腦組織IL-4、IL-12、IFN-γ蛋白濃度測定 具體結(jié)果見表3。發(fā)病10 d時(shí)，與對照組對比，模型組腦組織IL-12、IFN-γ蛋白水平增高(P<0.05)，IL-4蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組IL-12、IFN-γ蛋白水平降低(P<0.05)，IL-4蛋白水平增高(P<0.05)。發(fā)病20 d時(shí)，與對照組對比，模型組IFN-γ蛋白水平增高(P<0.05)；與模型組相比，治療組IFN-γ蛋白水平降低(P<0.05)。

表 1　實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組小鼠脊髓組織細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較±s，n=4)

注：對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。表2、3同

表 2　實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組小鼠脾組織細(xì)胞炎癥因子±s，n=4)

表 3　ELISA法檢測各組小鼠腦組織細(xì)胞炎癥因子蛋白水平比較

3討論

EAE是一種由髓鞘特殊蛋白誘發(fā)的自身免疫疾病，主要特征為脫髓鞘和軸索破壞[7]。EAE 在病理生理及病程上模擬了人類MS疾病過程，已經(jīng)成為研究MS的標(biāo)準(zhǔn)模型。本研究應(yīng)用EAE模型探討干預(yù)藥物NDGA對EAE病程的影響及其在病理生理中可能的治療機(jī)制。

NDGA具有抗炎、抗氧化雙重作用。前者主要通過調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1/ARE通路實(shí)現(xiàn)[8]。在對硫唑嘌呤誘發(fā)的腎病模型研究中，NDGA能夠上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)，從而改善腎功能，減少蛋白尿，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)其抗炎功能[9]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變研究中，NDGA能中斷阿爾茲海默病中神經(jīng)變性通路，減少淀粉樣肽β神經(jīng)毒性作用，發(fā)揮保護(hù)作用[10]。多項(xiàng)研究表明NDGA具有神經(jīng)保護(hù)功能[11]，提示NDGA在EAE中具有治療潛能。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用NDGA干預(yù)EAE小鼠研究發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠癥狀評分明顯減輕，表明NDGA可以改善EAE小鼠病情，對EAE產(chǎn)生保護(hù)作用；進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)定量PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)方法對比兩組小鼠IFN-γ、IL-12及IL-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，在發(fā)病急性期，與模型組相比，治療組小鼠體內(nèi)脊髓和脾組織炎癥因子IL-12、IFN-γ mRNA水平降低，IL-4 mRNA水平增高，腦組織中IL-12、IFN-γ蛋白水平降低，IL-4蛋白水平增高；在緩解期，與模型組相比，治療組脊髓組織IL-12、IFN-γ mRNA水平降低，腦組織中IFN-γ蛋白水平降低。在EAE病程中，初始T細(xì)胞在遇到抗原后，在不同條件下分化成不同類型的效應(yīng)細(xì)胞亞群——Th1細(xì)胞及Th2細(xì)胞。IL-12是激活和促進(jìn)Th1細(xì)胞成熟中重要的細(xì)胞因子，通過激活Th1細(xì)胞實(shí)現(xiàn)致炎作用[12]。當(dāng)細(xì)胞環(huán)境中富集了IL-12和/或IFN-γ時(shí)，初始T細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子T-bet驅(qū)動(dòng)下分化成為Th1細(xì)胞，并且分泌IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[13]。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的具有突出致炎作用的細(xì)胞因子。IFN-γ可以通過JAK12/STAT1通路促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，上調(diào)抗原呈遞中的重要分子，如MHCⅡ和共刺激因子CD80和CD86，增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞功能，從而在MS中起到促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用[14-16]。相反，抗炎癥因子IL-4在治療組較模型組表達(dá)增高。IL-4在EAE中可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子GATA3和Stat6，促進(jìn)初始T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化[17-18]，分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等抗炎性細(xì)胞因子，抑制MS中的炎癥反應(yīng)[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用NDGA干預(yù)顯著下調(diào)了Th1型細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ表達(dá)，上調(diào)了Th2型抗炎因子IL-4表達(dá)，提示NDGA可能是通過糾正Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，并影響初始T細(xì)胞分化，從而改善EAE疾病嚴(yán)重程度。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Effects of nordihydroguaiaretic acid on Th1/Th2 cytokine balance in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

ZHANGYanbo,WANGGaoning,KONGPeng,WANGLiang,GUOLi,LIBin*.

*DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，KeyLaboratoryofHebeiNeurology,ShijiazhuangHebei050000,ChinaCorresponding author: LI Bin, Email:Jack511@163.com

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the regulation effect of nordihydroguaiaretic acid(NDGA) on interleukin-4(IL-4), interleukin-12(IL-12) and interferon-gamma(IFN-γ) levels in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice. MethodsFifty-four female C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups: the control, EAE and treatment groups. Each group was divided into 10 day and 20 day subgroups according to the onset time. There were 9 mice in each subgroup. In the EAE and treatment group, the EAE models were induced with 0.1 mL myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55(MOG35-55)(5 mg/mL) by subcutaneous injection. Normal saline was used in the control group. The clinical scores of the mice were recorded and analyzed. For treatment, daily injection of NDGA at dose of 10 mg/(kg·d) was initiated on the day when clinical scores of mice≥1. The EAE group and the control groups were given 5% dimethyl sulphoxide(DMSO) at the dose of 10 mL/(kg·d). Clinical symptom scores of the three groups were compared. IL-4, IL-12, IFN-γ mRNA levels in the spinal cord and spleen were detected by qRT-PCR, and IL-4, IL-12, IFN-γ protein expression in the brain was detected by ELISA.ResultsCompared with the EAE group, the clinical score in the treatment group declined (P<0.05). Compared with the EAE group, the expression levels of IL-12, IFN-γ mRNA decreased in the spinal cord and spleen and IL-4 mRNA increased in the treatment group (P<0.05), the expression of IL-12 and IFN-γ in the brain decreased and IL-4 increased in the treatment group at 10 d(P<0.05).Compared with the EAE group, the expression levels of IL-12, IFN-γ in spinal cord decreased in the treatment group (P<0.05), and the expression level of IFN-γ in brain decreased at 20 d(P<0.05).ConclusionsNDGA attenuates disease severity by down-regulating the expression levels of IL-12 and IFN-γ and up-regulating IL-4 in the spinal cord, spleen and brain of EAE mice.

Key words:nordihydroguaiaretic acid; encephalomyelitis, autoimmune, experimental; interleukin-4; interleukin-6; interferon type Ⅱ

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.003

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100884)

通訊作者：李彬，Email：Jack511@163.com

中圖分類號：R744.5+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2963 (2016)01-0009-05

(收稿日期：2015-08-10)