泰山白皮松花粉對雛雞免疫增強作用的初步研究

孟秀彥，黃河，廉愛玲，胡莉萍，朱瑞良

1.泰山職業(yè)技術(shù)學院，山東泰安2710002.山東新希望六和集團有限公司，山東青島2660613.山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南2500224.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018

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泰山白皮松花粉對雛雞免疫增強作用的初步研究

孟秀彥1，黃河2，廉愛玲3，胡莉萍3，朱瑞良4*

1.泰山職業(yè)技術(shù)學院，山東泰安271000
2.山東新希望六和集團有限公司，山東青島266061
3.山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南250022
4.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018

摘要：本試驗設(shè)計旨在研究泰山白皮松花粉對雛雞免疫功能的增強作用。取1日齡海蘭褐公雛1050只，隨機分為7組，3個松花粉佐劑組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），2個松花粉投喂組（Ⅳ、Ⅴ），另外2組分別為無松花粉對照組（Ⅵ）和正常對照組（Ⅶ）。以不同含量的泰山白皮松花粉作為免疫佐劑配制ND疫苗，胸肌注射接種各試驗組雛雞，9日齡1免，32日齡2免。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、V、Ⅵ組松花粉佐劑劑量分別為162 μg/只，108 μg/只，54 μg/只，0，0，0；IV、V組6～11日齡投喂松花粉，劑量分別為0.3 g/只，0.1 g/只；VII組注射滅菌生理鹽水。各試驗組分別于1免后的第3 d、7 d、14 d、21 d及2免后的第3 d、7 d、14 d、21 d采取血液，用β-微量法檢測血清抗體。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ組2 免14 d后，每組隨機取30只雞采血進行體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化率檢測。數(shù)據(jù)采用SPSS11.2軟件進行T值檢驗分析。結(jié)果表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組各指標均顯著高于Ⅵ組（P＜0.05），其中Ⅰ、Ⅱ組與Ⅵ組相比差異極顯著（P＜0.01）。Ⅳ、Ⅴ組顯著高于Ⅵ組（P＜0.05），Ⅵ組、Ⅶ組差異不顯著。并且1免后14 d，2免后14 d、21 d的各試驗組顯著高于相應對照組（P＜0.05）。因此，泰山白皮松花粉能提高雛雞的抗體水平、血液淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。

關(guān)鍵詞：白皮松花粉；抗體；淋巴細胞；免疫增強

松花粉，藥名松花、松黃，始載于唐《新修本草》，其味甘平無毒，蘊藏著豐富的營養(yǎng)成分，具有增強機體免疫力，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，抗疲勞，增加鋅利用度等功能［1-4］。我國松花粉產(chǎn)量高，采集方便，開發(fā)潛力巨大。近幾年松花粉在人類保健方面的研究利用逐漸產(chǎn)業(yè)化。新型植物免疫增強劑的研究與開發(fā)正在成為國內(nèi)畜牧行業(yè)研發(fā)的新熱點［5，6］。松花粉在增強免疫方面的獨特功效引起了畜牧界的重視，探索將松花粉研制成為新型高效的免疫佐劑，對控制畜禽傳染病的發(fā)生，生產(chǎn)綠色安全的畜禽產(chǎn)品具有十分重要的意義。在松科中不同品種花粉的營養(yǎng)物質(zhì)含量不一，有的品種之間某些營養(yǎng)物質(zhì)含量可能差異較大［7，8］，利用松花粉時需要考慮花粉品種和營養(yǎng)之間的關(guān)系，以便選用適合的松花粉。破壁后的松花粉氨基酸含量高于天然松花粉，對體液免疫功能和鋅的利用度的增強作用更明顯［9，10］。本試驗將泰山白皮松松花粉破壁后作為雞新城疫疫苗佐劑和飼料添加劑，通過測定雛雞新城疫抗體效價和淋巴細胞轉(zhuǎn)化率來研究松花粉對機體免疫效果的影響，旨在探索松花粉的免疫增強作用，為進一步研究、開發(fā)、利用松花粉作為免疫佐劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1松花粉采自泰山白皮松成熟的松花粉，經(jīng)晾干、260目過篩、破壁處理［11］，其破壁率達95%～98%；并在山東農(nóng)業(yè)大學輻照中心以60 Coγ、6 kGy輻照劑量滅菌后［12］，4℃貯存。

1.1.2試驗動物1050只1日齡海蘭褐公雛，購自泰安市東岳種禽有限公司，平均體重為77 g。

1.1.3病毒液和試劑滅活雞新城疫病毒尿囊液，HA效價為1：211，由山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院微生物研究室提供；1%雞紅細胞懸液；淋巴細胞分離液，上海恒信化學試劑有限公司產(chǎn)品，批號20141220，4℃避光保存；D-Hank's液；PRMI 1640培養(yǎng)液（Gbico）（加10%小牛血清和雙抗），伴刀豆球蛋白A（ConA，試驗濃度為10 μg/mL）（Sigma公司產(chǎn)品，PBS液；0.4%臺盼蘭液；MTT （Sigm公司產(chǎn)品，5 mg/mL，用PBS配制，pH=7.4）；裂解液（DMF-SDS）（20%SDS，50%DMF，用鹽酸調(diào)至pH7.4）。

1.1.4主要儀器離心機800型，上海手術(shù)器械廠；光學顯微鏡OLYMPUS，CH-2型，JAPAN；5%CO2培養(yǎng)箱SANYO；超凈工作臺1012型，美國產(chǎn)；電子天平FA1104型，上海天平儀器廠；自動酶標儀，澳大利亞TECAN公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡；微型振蕩器。

1.2方法

1.2.1松花粉佐劑的制備破壁白皮松花粉溶解在一定溶劑中，再加入一定比例的聚乙二醇6000和丙三醇，配制成松花粉佐劑溶液（每mL含有松花粉有效成份600μg）。

1.2.2疫苗的制備將松花粉佐劑溶液按照不同的比例分別與滅活雞新城疫病毒尿囊液及滅菌生理鹽水混勻，即依次為I號苗、II號苗、III號苗、IV號苗（見表1）。

表1　松花粉佐劑疫苗的配制Table 1 The formulation of pine pollen vaccine adjuvant

1.2.3松花粉飼喂液制備取10 g經(jīng)破壁處理的白皮松花粉加生理鹽水至總體積200 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4動物試驗設(shè)計將1050只海蘭褐公雛隨機分為7組，每組150只。試驗分組：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為松花粉佐劑組，Ⅳ、Ⅴ組為松花粉投喂組，Ⅵ組為無松花粉對照組，Ⅶ組為正常對照組。松花粉用量：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組松花粉佐劑劑量分別為162 μg/只，108 μg/只，54 μg/只，0，0，0；IV、V組松花粉投喂劑量分別為0.3 g/只，0.1 g/只。各試驗組均采用胸肌注射的方式進行疫苗接種，9日齡1免，0.3 mL/只；32日齡2免，0.6 mL/只；I、II、III組分別接種I、II、III號疫苗；IV、V、VI組均接種IV號疫苗，VII組接種滅菌生理鹽水。IV、V組在6～11日齡每天早上空腹投喂松花粉。

1.2.5抗體效價的檢測首先于7日齡時對雛雞測定母源抗體，以后分別于1免后的第3 d、7 d、14 d、21 d以及2免后的第3 d、7 d、14 d、21 d取各組雛雞心臟采血0.5 mL，分離血清，用β-微量法檢測血清的ND抗體效價。數(shù)據(jù)采用SPSS 11.2軟件進行T值檢驗分析。

1.2.6雛雞淋巴細胞轉(zhuǎn)化率（MTT法）的檢測以I、II、III、VI組雛雞作為檢測對象，I、II、III組為松花粉佐劑組，VI組為對照組。二免14 d后，每組隨機取30只雞心臟采血進行檢測。

無菌取試驗雞抗凝血3 mL，用淋巴細胞分離液制備淋巴細胞，PRMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，臺盼蘭測活計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×106個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，加20 μLConA。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。倒置顯微鏡下觀察。每孔加MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加裂解液100 μL，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標儀上讀取490 nm處的光密度值（OD490nm）。同時設(shè)置對照孔（淋巴細胞、PRMI1640培養(yǎng)液、MTT、裂解液），空白調(diào)零孔（PRMI1640培養(yǎng)液、MTT、裂解液），其它試驗步驟保持一致。每組設(shè)4個復孔［13，14］。

結(jié)果用刺激指數(shù)SI表示。

2　結(jié)果

2.1ND抗體檢測結(jié)果

表2　一免后各組ND-HI的抗體效價Table 2 The antibody titers of each group ND-HI after first immunization（n=150,ˉX±SD）；log2）

由表2可見，1免后，試驗各組的抗體水平與對照組相比上升迅速。其中I、II組在免疫后抗體上升速度最快，抗體效價水平明顯高于其他各組。IV、V組是松花粉的飼料添加組，抗體水平居中，略高于對照組。

表3　二免后各組ND-HI的抗體效價Table 3 The antibody titers of each group ND-HI after second immunization（n=150,ˉX±SD）；log2）

由表3可見，二免7 d后，IV、V組抗體效價水平與對照組的差距有縮小趨勢，I、II組抗體持續(xù)高水平表達，二免后14 d、21 d時與對照組差異極顯著（P＜0.01）。

2.2體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的測定（OD490 nm）結(jié)果

表4　MTT試驗的數(shù)據(jù)Table 4 The data of MTT test

由圖1可見，試驗組的刺激指數(shù)SI明顯高于對照組，且在一定范圍內(nèi)與疫苗中松花粉佐劑劑量有一定的依賴關(guān)系。

圖1　MTT試驗刺激指數(shù)Fig.1 MTT test stimulation index

3　分析與討論

3.1破壁白皮松花粉可以明顯增強雛雞對雞新城疫疫苗的免疫反應，提高其抗體效價

抗體效價的變化能夠反映體液免疫的狀態(tài)［15］，本研究結(jié)果顯示：松花粉佐劑組HI抗體效價的明顯好于松花粉投喂組和對照組，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組各指標均顯著高于Ⅵ組（P＜0.05），其中Ⅰ、Ⅱ組與Ⅵ組相比差異極顯著（P＜0.01）。Ⅳ、Ⅴ組顯著高于Ⅵ組（P＜0.05），Ⅵ組、Ⅶ組差異不顯著。并且1免疫14 d，2免后14 d、21 d的各組顯著高于免疫后3 d、7 d的各對應組（P＜0.05）。證明了松花粉能夠明顯增強雛雞的體液免疫能力，其增強效果與劑量在一定范圍內(nèi)成依賴關(guān)系，高劑量組的松花粉佐劑疫苗組效果最好。

3.2破壁白皮松花粉可以增強雛雞淋巴細胞轉(zhuǎn)化率

體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化率變化能夠反映細胞免疫的狀態(tài)［16］。體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化（MTT法）試驗的結(jié)果表明：破壁白皮松花粉對淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率提高效果較好，刺激指數(shù)SI比對照組有所提高，且在一定范圍內(nèi)，與劑量有一定的依賴關(guān)系（圖1）。松花粉作為疫苗佐劑，具有提高細胞免疫的作用。

3.3松花粉作為免疫佐劑的廣泛應用還需要進一步研究

本試驗研究初步證明，白皮松花粉破壁后作為疫苗佐劑具有可行性，但仍存在一些問題：如對白皮松花粉的處理（直接使用完整的松花粉、破壁處理、發(fā)芽等）與其作用的關(guān)系尚不清楚；不能確定、提取其有效成分；最佳量效關(guān)系的確定等等。另外，在松科中不同種花粉的營養(yǎng)物質(zhì)含量不一，品種之間某些營養(yǎng)素差異較大，生長條件不同，同一種松花粉的營養(yǎng)物質(zhì)含量也不同［17，18］，在畜牧業(yè)中應用松花粉時是否需要考慮松花粉品種和營養(yǎng)之間的關(guān)系等，這些問題均需要我們在本試驗的基礎(chǔ)上進行更加深入、細致的研究。

3.4展望

泰山松花粉資源豐富，生產(chǎn)時間集中，較易采集且不與農(nóng)業(yè)爭地，如果成功利用新技術(shù)將松花粉開發(fā)研制為新型疫苗佐劑將有著十分巨大的經(jīng)濟價值和應用前景。

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Research on the Effect of Immune Enhancement of Taishan White Bark Pine Pollen on Chicks

MENG Xiu-yan1，HUANG He2，LIAN Ai-ling3，HU Li-ping3，ZHU Rui-liang4*

1. TaiShan Vocational Technical College，Taian 271000，China
2. Shandong New Hope Six and Group Co.，Ltd.，Qingdao 266061，China
3. Animal Disease Prevention and Control Center of Shandong Province，Jinan 250022，China
4. College of Animal Science and Technology/Shandong Agricultural University，Taian 271018，China

Abstract：An experiment was conducted to study the effects of immune enhancement caused by the Taishan white bark pine pollen on chicks. One thousand and fifty one-day-old Lyline male chicks were randomly divided into 7 groups：3 pine pollen adjuvant groups（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ），2 pine pollen feeding groups（Ⅳ，Ⅴ），the non-pine pollen control group（Ⅵ）and the control group（Ⅶ）. The ND-vaccines were made by the immune adjuvant with different content of Taishan white bark pine pollen. The experimental group chicks were injected with the ND-vaccine in chest muscle when they were 9 and 32 days old，pine pollen does of groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，IV and V was 162 μg/feather，108 μg/feather，54 μg/feather，0，0，0 respectively. Pine pollen was fed to group IV，V with 0.3 g，0.1 g respectively when they were 6 and 11 days old. Group VII was injected with physiological saline. Samples of blood were taken on the 3rd，7th，14th and 21st day after each immunization. The lever of systemic antibody was detected by β-Microtest HA and HI. 30 chicks were randomly selected fromⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅵgroup，Samples of blood were taken on 14th day after the second immunization，the conversion rate of Lymphocytes was detected by MTT. SPSS11.2 software was used for T-score test analysis. The results showed that the indices in Group I，Ⅱ，Ⅲwere significantly higher than GroupⅥ（P＜0.05）. The differences between Group I，Ⅱand GroupⅥwere very significant（P＜0.01）. GroupⅣ，Ⅴwere significantly higher than GroupⅦ（P＜0.05）.The difference between GroupⅥandⅦwas not significant .And the test results of the groups on the 14th day after first immunity，14th and 21st day after second immunization were significantly higher than that on the 3rd and 7th day（P＜0.05）. Therefore Taishan white bark pine pollen could improve antibody level and lymphocyte transformation rate of chick.

Keywords：White bark pine pollen；antibody；lymphocyte；immune enhancement

中圖法分類號：S852.4；S853.7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）03-0362-04

收稿日期：2015-05-18修回日期：2015-06-26

基金項目：山東省科技發(fā)展計劃項目（2012GNC11020）；泰安市科技發(fā)展專項計劃（20103001）；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新資助項目（XTCX2014B01-08）

作者簡介：孟秀彥（1969-），女，副教授，主要從事預防獸醫(yī)學教學和研究工作. E-mail：meng_xiuyan@163.com

*通訊作者：Author for correspondence. E-mail：zhurl@sdau.edu.cn