納他霉素高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化

張帥瀅，韋蘭蘭，張　穎，何　佳,2，王大紅,2

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023;2.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

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納他霉素高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化

張帥瀅1，韋蘭蘭1，張穎1，何佳1,2，王大紅1,2

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023;2.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

摘要：以納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)4.3505為出發(fā)菌株，以紫外線作為誘變方法，篩選抗乙酸鈉高產(chǎn)納他霉素的突變菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，篩選誘導(dǎo)子及添加工藝。研究結(jié)果表明：高產(chǎn)突變菌株為納塔爾鏈霉菌HW-2，其納他霉素產(chǎn)量在發(fā)酵120 h后達(dá)到452.2 mg/L，比原始菌株提高了242.6%，該菌株遺傳性能穩(wěn)定。納塔爾鏈霉菌HW-2生產(chǎn)納他霉素最佳發(fā)酵條件：接種量為發(fā)酵液總體積的6%，250 mL三角瓶裝液量為30 mL，初始pH值為7.5。乙酸鈉為最佳前體物質(zhì)，乙酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，添加時(shí)間為發(fā)酵后24 h。

關(guān)鍵詞：納塔爾鏈霉菌；納他霉素；菌株選育；發(fā)酵條件

0引言

納他霉素(natamycin，也稱匹馬菌素)是由褐黃孢鏈霉菌(Streptomycesgilvosporeus)、納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)和恰塔努加鏈霉菌(Streptomyceschattanoogensis)等菌株產(chǎn)生的一種能有效抑制真菌生長和真菌毒素產(chǎn)生的二十六元環(huán)多烯類抗真菌抗生素[1]，具有低劑量、高效率和高安全性等特點(diǎn)。該物質(zhì)無抗細(xì)菌活性，與乳酸鏈球菌肽結(jié)合使用可起到很好的防腐作用[2]。因此，1982年，美國食品和藥物管理局正式批準(zhǔn)納他霉素可以用作食品防腐劑。1997年，中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)納他霉素可以用作食品防腐劑[3]。

雖然納他霉素在食品原料保鮮和成品防腐方面的應(yīng)用顯示了良好前景，但是因成本太高而限制了其使用。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)納他霉素是一個(gè)很好的發(fā)展方向。工業(yè)上納他霉素的生產(chǎn)菌主要為納塔爾鏈霉菌和褐黃孢鏈霉菌[4]。國外關(guān)于納他霉素發(fā)酵方面的研究比較深入和成熟[5]，文獻(xiàn)[6]報(bào)道了連續(xù)發(fā)酵法可使納他霉素產(chǎn)量達(dá)6～12 g/L。國內(nèi)的學(xué)者也做了相關(guān)的研究工作[7-8]，對(duì)褐黃孢鏈霉菌研究較多，而對(duì)納塔爾鏈霉菌的菌株選育研究較少[9]。因此，本文主要根據(jù)納他霉素的生物合成途徑，篩選抗乙酸鈉的高產(chǎn)突變菌株，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1材料

納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)4.3505，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司生產(chǎn)；蛋白胨、酵母粉、麥芽浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨，購于北京奧博星公司；葡萄糖、乙酸鈉、丙酸鈉，國藥集團(tuán)生產(chǎn)。

試驗(yàn)儀器：高效液相色譜(HPLC1260)，安捷倫公司；LS-B50型滅菌器，上海博迅設(shè)備廠；HYL-C型恒溫?fù)u床，江蘇太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

納塔爾鏈霉菌培養(yǎng)基分為平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10 g/L，麥芽浸粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，瓊脂20 g/L，水1 L，pH7.0。種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，氯化鈉10 g/L，水1 L，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖30 g/L，酵母浸膏2 g/L，牛肉膏10 g/L，水1 L，pH7.0。

1.2方法

1.2.1納塔爾鏈霉菌培養(yǎng)及孢子懸液的制備

將S.natalensis4.3505接種于斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察其生長情況。取斜面試管中生長較好的菌種，加入10 mL已經(jīng)滅過菌的生理鹽水，將孢子振蕩洗下，然后倒入50 mL滅過菌的含有玻璃珠的三角瓶中，用振蕩器振蕩30 min后過濾，將溶液的孢子濃度調(diào)至108個(gè)/mL。

1.2.2納他霉素的發(fā)酵和菌體生物量的測(cè)定

將培養(yǎng)48 h的納他霉素種子培養(yǎng)基以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)108 h。發(fā)酵結(jié)束后取3 mL發(fā)酵液置于已知質(zhì)量的5 mL干燥離心管中，10 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀中再加入3 mL去離子水洗滌沉淀2次，棄上清留沉淀后將沉淀置于65 ℃的烘箱內(nèi)干燥8 h，稱質(zhì)量。

1.2.3納他霉素含量的測(cè)定

取2 mL發(fā)酵液和18 mL甲醇混合，搖床上充分振蕩2 h后，10 000 r/min離心10 min，吸取離心后的上清液，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，過濾液即為待測(cè)液。

色譜柱：型號(hào)為YMC-Pack ODS C18，柱長250 mm，柱直徑4.6 mm，流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)=35∶65，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長λ=304 nm。

1.2.4高產(chǎn)納他霉素菌株的選育

(1)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對(duì)菌體生成的影響

制備含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液(0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.15%和0.20%)的平板培養(yǎng)基，將制備好的0.2 mL孢子懸液分別涂布于平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。觀察不同平板培養(yǎng)基上的菌落生長情況，確定乙酸鈉對(duì)該菌的最低抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)納塔爾鏈霉菌的紫外線誘變處理

取濃度為108個(gè)/mL的孢子懸液10 mL置于直徑為9 cm的已滅菌的培養(yǎng)皿中，在距15 W紫外燈30 cm處進(jìn)行不同時(shí)間的照射 (照射時(shí)間分別為5 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s和60 s)，同時(shí)均勻攪拌。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋度為10-4、10-5和10-6的菌懸液0.2 mL，將其涂布在平板培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度進(jìn)行3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)，7 d后計(jì)算菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)致死率并確定誘變時(shí)間。

(3)高產(chǎn)菌株的篩選

選擇最佳誘變時(shí)間處理菌懸液0.2 mL，將其涂布于含有最低抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙酸鈉平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d，觀察菌落生長狀況。待菌落長出后，將菌落分別接種于斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7～10 d，測(cè)定其發(fā)酵性能。

1.2.5高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將誘變獲得的抗乙酸鈉高產(chǎn)菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，經(jīng)發(fā)酵測(cè)定其納他霉素的產(chǎn)量，觀察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6發(fā)酵條件的優(yōu)化和前體物質(zhì)的篩選

分別考察接種量、溶氧和初始pH值對(duì)納他霉素產(chǎn)生的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸鈉、丙酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的乙醇、正丁醇、乳酸、檸檬酸和異丁醇作為前體添加物，篩選出最佳前體物質(zhì)，并對(duì)添加量和添加時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對(duì)菌體生成的影響

根據(jù)納他霉素的生物合成途徑，二碳和三碳小分子物質(zhì)為其生物合成的前體，但前體也具有一定的毒性，濃度越大，其毒性越強(qiáng)。因此，通過測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對(duì)菌體生長的影響，確定最低抑制質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。從表1中可以看出：0.15%乙酸鈉能夠完全抑制納塔爾鏈霉菌的生長。

表1　不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸鈉溶液對(duì)菌體生長的影響

圖1　紫外線照射時(shí)間對(duì)納塔爾鏈霉菌致死率的影響

2.2紫外線照射時(shí)間的確定

在一定的范圍內(nèi)，照射時(shí)間越長，微生物突變率也越高，但超過此范圍時(shí)，突變率將下降。本研究采用紫外線照射，照射距離為30 cm，照射時(shí)間分別為5 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s和60 s，以不經(jīng)過紫外照射的菌株為對(duì)照。不同紫外線照射時(shí)間對(duì)納塔爾鏈霉菌致死率的影響結(jié)果見圖1。

致死率過高或過低都不利于誘變菌株的篩選，一般致死率為85%～90%效果較好[10]，菌株的正突變概率較高，有利于突變株的進(jìn)一步篩選。從圖1中可以看出：照射時(shí)間為50 s時(shí)，納塔爾鏈霉菌的致死率為87.10%，處于85%～90%區(qū)間內(nèi)，所以選擇最佳誘變時(shí)間為50 s。

2.3紫外線照射誘變結(jié)果

經(jīng)過紫外線照射誘變，共獲得56株突變菌株，經(jīng)過發(fā)酵性能測(cè)試，其中5株菌株出現(xiàn)了正突變，分別命名為HW-2、HW-8、HW-10、HW-12和HW-26。5株突變菌株的納他霉素產(chǎn)量如表2所示。由表2可知：5株誘變菌株與親本的納他霉素產(chǎn)量相比，HW-2產(chǎn)量最高，為452.2 mg/L。

表2　5株突變菌株的納他霉素產(chǎn)量　mg/L

2.4突變菌株遺傳穩(wěn)定性研究

為了觀察篩選到的高產(chǎn)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)誘變選育的5株菌株分別進(jìn)行傳代，共傳5代，結(jié)果見表3。由表3可以看出：HW-2、HW-12和HW-26菌株遺傳性比較穩(wěn)定，其中，HW-2菌株納他霉素產(chǎn)量基本維持在450 mg/L左右，說明突變菌HW-2具有較好的遺傳穩(wěn)定性，而HW-8和HW-10菌株的遺傳穩(wěn)定性較差。

表3　高產(chǎn)突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖2　納塔爾鏈霉菌突變菌株HW-2的發(fā)酵過程曲線

2.5納他霉素?fù)u瓶發(fā)酵過程曲線

對(duì)納塔爾鏈霉菌HW-2的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行了考察，在發(fā)酵第1～7天，分別檢測(cè)納他霉素和細(xì)胞生長的變化，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出：納他霉素的產(chǎn)量從第2天到第6天快速上升，第6天時(shí)，產(chǎn)量上升到513 mg/L。但是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，納他霉素產(chǎn)量下降。因此，納他霉素的最佳發(fā)酵時(shí)間是6 d。而發(fā)酵液中納塔爾鏈霉菌的菌體質(zhì)量濃度在第4天時(shí)達(dá)到最大值62 g/L。

2.6發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.6.1接種量

接種量的大小與菌種特性和發(fā)酵條件等有關(guān)，不同微生物發(fā)酵的接種量有所不同。將種子液分別按體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%和7%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 d后測(cè)定納他霉素的產(chǎn)量，結(jié)果見表4。

表4　接種量對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

由表4可以看出：不同接種量對(duì)菌體產(chǎn)納他霉素的影響很大。菌體的生長需要一定的密度，接種量小會(huì)導(dǎo)致菌體生長緩慢，菌體生長會(huì)消耗掉大量營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響了納他霉素的產(chǎn)量；接種量大會(huì)使菌體生長過快，導(dǎo)致菌體過早衰老，也會(huì)影響納他霉素的產(chǎn)量。接種量在6%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量最大，達(dá)531 mg/L。

2.6.2溶氧

納塔爾鏈霉菌是好氧菌，氧氣對(duì)菌體生長和納他霉素產(chǎn)生的影響很大。在固定搖床轉(zhuǎn)速條件下，設(shè)置不同的搖瓶裝液量，導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解氧不同，納他霉素的產(chǎn)量會(huì)不同。表5為溶氧對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響。由表5可以看出：當(dāng)250 mL三角瓶中裝液量為30 mL時(shí)，納他霉素產(chǎn)量達(dá)到最大值830 mg/L。

表5　溶氧對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

2.6.3初始pH值

在250 mL三角瓶中裝入28.2 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將培養(yǎng)基pH值調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，接入1.8 mL種子液，培養(yǎng)6 d后，測(cè)定納他霉素的產(chǎn)量。結(jié)果如表6所示。

表6　初始pH值對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

從表6可以看出：初始pH值在7.5時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量最高，達(dá)885 mg/L。但隨著初始pH值的進(jìn)一步升高，納他霉素產(chǎn)量開始下降。這可能是因?yàn)樵诓煌膒H值條件下，納他霉素合成途徑中一些關(guān)鍵酶的活性不同。所以在納他霉素發(fā)酵時(shí)，應(yīng)將初始pH值控制在7.5。

2.7前體物質(zhì)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

表7　不同前體物質(zhì)對(duì)納他霉素合成的影響　 mg/L

2.7.1不同前體物質(zhì)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

根據(jù)納他霉素的生物合成途徑，本試驗(yàn)選用乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、正丁醇、乳酸、檸檬酸和異丁醇作為前體添加物，在發(fā)酵時(shí)按0.1%的比例分別加入，采用上文已優(yōu)化的發(fā)酵條件，發(fā)酵6 d，納他霉素產(chǎn)量如表7所示。由表7可知：添加乙酸鈉或丙酸鈉后，納他霉素產(chǎn)量有顯著的提高，其中以乙酸鈉效果最好，產(chǎn)量達(dá)到1 150 mg/L，比對(duì)照提高了35%。因此試驗(yàn)最終選用乙酸鈉為前體物質(zhì)。

2.7.2乙酸鈉添加量和添加時(shí)間對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%的乙酸鈉，發(fā)酵6 d后檢測(cè)納他霉素的產(chǎn)量，結(jié)果如表8所示。從表8可以看出：在乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量最高，達(dá)到1 380 mg/L。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.20%時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量卻降低，這主要是因?yàn)榇罅康囊宜徕c會(huì)對(duì)菌體造成一定的毒性，導(dǎo)致納他霉素的產(chǎn)量降低，乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，其毒性越大。因此，最終選擇乙酸鈉添加量為0.20%。

分別在發(fā)酵培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h時(shí)加入0.20%乙酸鈉，發(fā)酵6 d后檢測(cè)納他霉素的產(chǎn)量，結(jié)果如表9所示。由表9可看出：在發(fā)酵24 h時(shí)添加乙酸鈉效果最好，納他霉素的產(chǎn)量最高，達(dá)到了1 550 mg/L。因此，本試驗(yàn)選擇在發(fā)酵24 h時(shí)添加0.20%乙酸鈉。

表8　乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

表9　乙酸鈉添加時(shí)間對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

3討論

近年來，以乳酸鏈球菌素和納他霉素為代表的生物防腐劑受到全球市場(chǎng)的青睞，有逐漸替代化學(xué)防腐劑的趨勢(shì)。目前，納他霉素的生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法。中國對(duì)于納他霉素的研究始于1995 年，研究者分別采用了菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和真菌誘導(dǎo)等方式來提高納他霉素的產(chǎn)量[11-13]，但與國外報(bào)道的產(chǎn)量相比，還有一定的差距。除此之外，采用物理方法和化學(xué)方法對(duì)微生物菌種進(jìn)行選育也是最普遍的方法，并結(jié)合抗生素、前體和結(jié)構(gòu)類似物等篩選劑進(jìn)行選擇性篩選[14]。文獻(xiàn)[15-16]分別采用亞硝基胍和紫外線對(duì)納他霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行選育，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，均獲得了較好的效果。

納他霉素的生物合成途徑可以分解為活化前體(乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A)的生成、大環(huán)內(nèi)酯的生物合成和氨基糖的形成，二碳和三碳類物質(zhì)是該物質(zhì)的前體(如乙酸、丙酸和丁醇等)，但過量的前體物質(zhì)嚴(yán)重影響S.natalensis的生長和納他霉素的生物合成[17]，因此，選育耐前體突變株是提高納他霉素產(chǎn)量的有效方法。本文采用紫外誘變與乙酸鈉抗性篩選相結(jié)合的方法，篩選到一株遺傳性能穩(wěn)定的納他霉素高產(chǎn)菌株S.natalensisHW-2，并采用搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)得出篩選到的菌種性能比原始菌株提高了2倍，使原菌種生產(chǎn)納他霉素的能力提高，而且該突變株更能夠耐受乙酸鈉。研究了S.natalensisHW-2發(fā)酵過程曲線，優(yōu)化了該菌的發(fā)酵條件。探討了不同的前體物質(zhì)對(duì)納他霉素生物合成的影響，認(rèn)為乙酸鈉為最佳前體物質(zhì)，并優(yōu)化了乙酸鈉的添加時(shí)間和添加量。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和前體物質(zhì)的添加，有效地提高了納他霉素的產(chǎn)量。雖然本研究所采用的抗乙酸鈉篩選方法有一定的效果，但未考慮其他生物途徑中其他前體物質(zhì)對(duì)納他霉素生物合成的影響，在高產(chǎn)菌的篩選上存在著一定的局限性，并且誘變后菌株出現(xiàn)正突變的概率比較小。因此，今后可以選用化學(xué)方法誘變或者物理化學(xué)復(fù)合誘變的方法來提高納他霉素的產(chǎn)量。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3140101119)

作者簡(jiǎn)介：張帥瀅(1992-),男,河南鞏義人,碩士生;何佳(1965-),男,河南洛陽人,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程.

收稿日期：2016-01-21

文章編號(hào)：1672-6871(2016)04-0081-06

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.04.017

中圖分類號(hào)：TQ927;Q939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A