草莓衰老過(guò)程中幾種酶的變化

郭 明 麗，　薛 永 常

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

草莓衰老過(guò)程中幾種酶的變化

郭 明 麗，薛 永 常

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:分析了草莓衰老過(guò)程中淀粉酶、纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性的變化情況，探討其衰老過(guò)程中酶的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在草莓的衰老過(guò)程中，幾種酶的酶活力隨衰老時(shí)間呈現(xiàn)不同的變化。纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶隨著衰老時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，其中纖維素酶活力最大，為612.16 U/g(按鮮重計(jì)算)；淀粉酶和多酚氧化酶均呈現(xiàn)波動(dòng)性變化；而過(guò)氧化物酶在整個(gè)衰老過(guò)程中一直保持著上升趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞:草莓；衰老；酶

0引言

草莓屬薔薇科草莓屬，其果實(shí)香味濃郁，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有一定的抗腫瘤生物活性，對(duì)多種致癌物質(zhì)有較好的抑制作用[1-2]。但極易破損被微生物感染，嚴(yán)重制約了草莓的貨架期或貯藏壽命[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在草莓采后貯藏保鮮方面已做了不少研究，Vicente等[4]通過(guò)熱處理降低草莓在貯藏過(guò)程中的果實(shí)損傷，提高了其抗氧化能力。而γ射線輻照[5]、低溫冷藏及臭氧處理可使草莓的防御酶活力增大[6]，呼吸作用降低[7]，對(duì)草莓貯藏保鮮有很好的效果。草莓衰老還與許多酶有關(guān)，如半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶活性隨草莓果實(shí)成熟而提高，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，纖維素酶活性、果膠酶活性不斷提高[8]。蘇艷等[9]對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中糖含量及糖代謝相關(guān)酶活性的變化也進(jìn)行了研究。但是對(duì)草莓采后生理代謝及衰老中代謝酶的變化，特別是草莓貯藏期一些與代謝有關(guān)的酶的變化研究尚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同衰老期草莓內(nèi)源淀粉酶、纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的酶活力的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)草莓衰老過(guò)程相關(guān)酶類的變化規(guī)律，為草莓采后貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

大連市售草莓“豐香”品種，大小規(guī)格一致。選擇采后衰老前期(果實(shí)一半以上轉(zhuǎn)紅，記作樣品1)和衰老后期 (果實(shí)全紅，記作樣品2)兩個(gè)階段的草莓果實(shí)。

3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)，可溶性淀粉，羧甲基纖維素鈉(CMC)，果膠，兒茶酚，愈創(chuàng)木酚，30%過(guò)氧化氫等。

1.2方法

1.2.1酶的提取

稱取草莓果肉2～8g研成勻漿，用蒸餾水定容至25mL，于4 ℃下3 500r/min離心20min，上清液即為粗酶液，用于酶活力測(cè)定。

1.2.2淀粉酶的測(cè)定

淀粉酶測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]的方法，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.166 1x-0.181 7, R2=0.997 4。

淀粉酶酶活定義：在37 ℃、pH5.6時(shí)，以1g樣品1h水解淀粉生成1mg葡萄糖為一個(gè)酶活單位(U/g)。

淀粉酶活力=C1VT1/mV1t1

(1)

式(1)中，C1為α、β-淀粉酶共同水解淀粉生成的葡萄糖量，mg；VT1為樣品稀釋液總體積，mL；m為樣品鮮質(zhì)量，g；V1為顯色所用酶液體積，mL；t1為酶作用時(shí)間，h。

1.2.3纖維素酶的測(cè)定

纖維素酶的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.152 7x-0.186 7，R2=0.994 8。

纖維素酶酶活定義：在50 ℃、pH5.0時(shí)，1h由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U/g)。

纖維素酶活力=5.56C2VT2/mV2t2

(2)

式(2)中，C2為羧甲基纖維素酶水解CMC生成的葡萄糖量，mg；VT2為樣品稀釋液總體積，mL；m為樣品鮮質(zhì)量，g；V2為顯色所用酶液體積，mL；t2為酶作用時(shí)間，h；5.56為1mg葡萄糖的微摩爾數(shù)。

1.2.4多聚半乳糖醛酸酶的測(cè)定

多聚半乳糖醛酸酶測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]，將蒸餾水和糖標(biāo)準(zhǔn)液用量減半，DNS的用量為2mL，加熱冷卻后定容至20mL，在540nm處測(cè)吸光度。所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.068 3x-0.091 3，R2=0.997 9。

多聚半乳糖醛酸酶酶活定義：在50 ℃、pH5.0的條件下，將1h由底物生成1μmol半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U/g)。

多聚半乳糖醛酸酶活力=5.15C3VT3/mV

(3)

式(3)中，C3為多聚半乳糖醛酸酶水解果膠生成的半乳糖醛酸量，mg；VT3為樣品稀釋液總體積，mL；m為樣品鮮質(zhì)量，g；V3為顯色所用酶液體積，mL；t3為酶作用時(shí)間，h；5.15為1mg半乳糖醛酸的微摩爾數(shù)。

1.2.5多酚氧化酶的測(cè)定

多酚氧化酶活力參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。多酚氧化酶酶活定義：以每分鐘內(nèi)吸光度變化0.001作為一個(gè)多酚氧化酶的活力單位(U/(g·min))。

多酚氧化酶活力=ΔA1D/0.001mt4

(4)

式(4)中，ΔA1為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；t4為反應(yīng)時(shí)間，min；D為稀釋倍數(shù)(即提取的總酶液為反應(yīng)液內(nèi)酶液的倍數(shù))；m為樣品鮮質(zhì)量，g。

1.2.6過(guò)氧化物酶的測(cè)定

過(guò)氧化物酶活力參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。酶活力定義：以每分鐘內(nèi)A470變化0.001個(gè)單位作為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位(U/(g·min))。

過(guò)氧化物酶活力=ΔA2VT5/0.001mV5t5

(5)

式(5)中，ΔA2為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；m為樣品鮮質(zhì)量，g；VT5為提取酶液總體積，mL；V5為測(cè)定時(shí)取用酶液體積，mL；t5為反應(yīng)時(shí)間，min。

2結(jié)果與討論

2.1草莓衰老過(guò)程中淀粉酶的變化

分別測(cè)定樣品1和樣品2在室溫(20～25 ℃) 下不同保存時(shí)間的淀粉酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1　草莓衰老過(guò)程中淀粉酶活力的變化

由圖1可以看出，處于衰老前期的樣品1中淀粉酶活力呈W狀波動(dòng)，整體呈循環(huán)上升趨勢(shì)，酶活力范圍10～25U/g，48h時(shí)酶活力最高，為24.3U/g；而衰老后期的樣品2中，淀粉酶活力呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在18h時(shí)酶活力最高，為79.5U/g，總體樣品1的酶活力小于樣品2。淀粉作為果實(shí)發(fā)育過(guò)程中重要的碳水化合物貯藏物，在維持果實(shí)的硬度及正常生長(zhǎng)發(fā)育中十分重要。在草莓衰老前期，果實(shí)內(nèi)淀粉的含量較高，而淀粉酶活力未達(dá)高峰，隨著草莓的衰老，淀粉酶的活力逐漸增強(qiáng)，加快了草莓果實(shí)細(xì)胞內(nèi)的淀粉分解速度，果實(shí)硬度迅速下降，在衰老后期果實(shí)中的淀粉存留量逐漸降低，從而使淀粉酶的活力隨淀粉含量下降，趨于穩(wěn)定后停留在較低水平，這與周國(guó)忠等[14]的研究結(jié)果基本一致。

2.2草莓衰老過(guò)程中纖維素酶的變化

測(cè)定樣品1和樣品2在室溫(20～25 ℃)下不同保存時(shí)間的纖維素酶活力的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2　草莓衰老過(guò)程中纖維素酶活力的變化

由圖2可以看出，纖維素酶在草莓的衰老過(guò)程中一直保持較強(qiáng)的酶活力，為300～700U/g。處于衰老前期的樣品1中，草莓的纖維素酶活力整體呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，酶活力在常溫保存6h時(shí)顯著提高，由410.33U/g提高到562.17U/g；處于衰老后期的樣品2，草莓的纖維素酶活力在0～12h略微下降，隨著草莓衰老時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高，在常溫保存36h持續(xù)上升。這是因?yàn)橹参锛?xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠組成，纖維素酶可促進(jìn)纖維素的降解從而促進(jìn)了細(xì)胞壁的溶解，促進(jìn)了草莓的后熟過(guò)程及后期的軟化與腐爛，這與Abeles等[15]的研究結(jié)果基本一致。

2.3草莓衰老過(guò)程中多聚半乳糖醛酸酶的變化

測(cè)定了不同衰老階段的草莓果實(shí)在不同保存時(shí)間內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶的酶活力變化，其結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，處于衰老前期樣品1中，多聚半乳糖醛酸酶的酶活力呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，酶活力在常溫保存6h時(shí)有顯著提高；衰老后期的樣品2中，多聚半乳糖醛酸酶的活力卻呈先下降后上升再下降而后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。在草莓成熟過(guò)程中，多聚半乳糖醛酸酶能降解果膠使細(xì)胞壁破損，因此果實(shí)成熟前期的合成顯著增加，能使果實(shí)變紅變軟，但不利于保鮮。在草莓衰老階段，由于前期酶的作用已使果實(shí)細(xì)胞完全解離，此時(shí)的多聚半乳糖醛酸酶活性保持在較平穩(wěn)的動(dòng)態(tài)水平。

圖3草莓衰老過(guò)程中多聚半乳糖醛酸酶活力的變化

Fig.3Changes of polygalacturonase activity during strawberry senescence

2.4草莓衰老過(guò)程中多酚氧化酶的變化

測(cè)定了不同衰老階段的草莓果實(shí)在不同保存時(shí)間內(nèi)源多酚氧化酶的變化，如圖4所示。

圖4　草莓衰老過(guò)程中多酚氧化酶活力的變化

由圖4可以看出，樣品1的多酚氧化酶活力在衰老前期變化不大，在36h后有上升趨勢(shì)，而樣品2的酶活力變化趨勢(shì)是先上升后下降，在36h后趨于平緩。處于成熟衰老前期的樣品1的多酚氧化酶的活性整體高于衰老后期的樣品2，說(shuō)明隨著果實(shí)的成熟及衰老，多酚氧化酶的活性逐漸增大。多酚氧化酶作為植物體內(nèi)普遍存在的一種非線粒體內(nèi)的末端呼吸氧化酶[12]，在草莓成熟衰老前期，促進(jìn)果實(shí)成熟的主要因子是內(nèi)部乙烯的產(chǎn)生，呼吸作用保持平穩(wěn)甚至有下降趨勢(shì)。隨著草莓果實(shí)的成熟后的逐漸衰老，果實(shí)呼吸作用加強(qiáng)，表現(xiàn)為多酚氧化酶活性的逐漸增加，在衰老的后期，隨著果實(shí)的染菌及腐爛，呼吸作用再度增加，多酚氧化酶的活性又出現(xiàn)了新的高峰，進(jìn)一步加快了草莓果實(shí)的衰老進(jìn)程。但是相比其他酶類，多酚氧化酶在草莓的衰老過(guò)程中的作用較小。

2.5草莓衰老過(guò)程中過(guò)氧化物酶的變化

不同衰老階段的草莓果實(shí)在不同保存時(shí)間的過(guò)氧化物酶活力變化，如圖5所示。

圖5　草莓衰老過(guò)程中過(guò)氧化物酶的變化

從圖5可以看出，草莓衰老過(guò)程中過(guò)氧化物酶的活力整體都呈上升趨勢(shì)，且衰老后期的樣品2中，過(guò)氧化物酶活力大于衰老前期的樣品1，且隨草莓的成熟衰老而逐漸增大。草莓為不具有呼吸驟變的非驟變型果實(shí)，隨著草莓果實(shí)的逐漸衰老及衰老后期的染菌與腐爛，過(guò)氧化物酶活性增大，這與該酶作為組織老化的一種生理指標(biāo)是一致的。

3結(jié)論

在草莓的衰老進(jìn)程中，纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶是草莓衰老的主要因素，其最大酶活力分別為612.16和237.42U/g，由于這兩種酶分解細(xì)胞壁直接導(dǎo)致了果實(shí)軟化及衰老。而多酚氧化酶隨著草莓的衰老和染菌腐爛，酶活力在小范圍內(nèi)逐漸上升(由2.50U/g上升到4.06U/g)，與其他酶相比多酚氧化酶的活力更低。過(guò)氧化物酶作為植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，隨著草莓的衰老，其酶活力整體為上升趨勢(shì)(由11.88U/g上升到26.56U/g)，這可以作為果實(shí)進(jìn)入衰老后期的一個(gè)標(biāo)志。可以看出草莓衰老與許多內(nèi)源酶的活性相關(guān)，合理控制相關(guān)酶的活性對(duì)于延長(zhǎng)草莓的貨架期具有重要的指導(dǎo)作用。

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Changesinenzymesactivitiesduringstrawberrysenescenceprocess

GUOMingli,XUEYongchang

(SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Abstract:Changes in activities of amylase, cellulase, polygalacturonase, polyphenol oxidase and peroxidase during strawberry senescence were determined. The enzymes activities showed different changes in different aging stages. Cellulase and polygalacturonase were gradually increased with the aging time and cellulase activity could reach to 612.16 U/g fresh weight. There were fluctuation in amylase and polyphenol oxidase, and the activity of peroxidase increased in the total senescence process.

Key words:strawberry; senescence; enzyme

收稿日期:2015-03-03.

作者簡(jiǎn)介:郭明麗(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：薛永常(1966-)，男，教授，E-mail:xueych@dlpu.edu.cn.

中圖分類號(hào):TS255.3；Q945.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)03-0185-05