海參溶菌酶C端多肽的異構(gòu)肽酶活性

牛 慶 昌，　李　 成，　梁 雯 婧，　馬　俊，　隨 瑞 瑞，　張　洋，　叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

海參溶菌酶C端多肽的異構(gòu)肽酶活性

牛 慶 昌，李 成，梁 雯 婧，馬俊，隨 瑞 瑞，張洋，叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:海參溶菌酶C端多肽與5種異構(gòu)肽酶的氨基酸殘基序列比對發(fā)現(xiàn)，其具有較高同源性，維持異構(gòu)肽酶活性的兩個關(guān)鍵位點(diǎn)組氨酸(His)和絲氨酸(Ser)也高度保守。水解底物L(fēng)-γ-Glu-pNA生成4-硝基苯胺的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C端多肽具有異構(gòu)肽酶活性。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF能有效破壞蛋白酶活性，表明Ser是異構(gòu)肽酶rSjLys-C的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，即rSjLys-C屬于絲氨酸蛋白酶。確定最適催化條件為37 ℃、pH 7.4、NaCl 50 mmol/L。rSjLys-C的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Vmax為1.446×10-5mmol/(L·s)，Km為0.395 7 mmol/L，kcat為1.509×10-3s-1，kcat/Km為23.813 L/(mol·s)。

關(guān)鍵詞:海參；溶菌酶；異構(gòu)肽酶；活性位點(diǎn)

0引言

作為免疫系統(tǒng)的組成成分，溶菌酶在海參機(jī)體內(nèi)具有重要作用，對許多病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性[1-3]。近期研究表明，作為i型溶菌酶，海參溶菌酶(SjLys)屬于“多功能蛋白”，除了具有抑菌活性，還可能具有異構(gòu)肽酶活性[4-6]。作為絲氨酸蛋白酶，異構(gòu)肽酶(isopeptidase)通過水解賴氨酸和谷氨酸間的異肽鍵，降解纖維蛋白及其類似物[7-9]。Cong等[1]研究發(fā)現(xiàn),海參溶菌酶蛋白的C端區(qū)域(49～125 aa，SjLys-C)與水蛭異構(gòu)肽酶氨基酸序列高度保守，可能是蛋白異肽酶活性的重要功能區(qū)。研究SjLys-C蛋白的異構(gòu)肽酶活性，可以進(jìn)一步分析海參溶菌酶蛋白的性質(zhì)、作用和功能。同時，不溶性的纖維蛋白是引發(fā)血栓的重要原因之一，SjLys-C蛋白異構(gòu)肽酶活性的研究也為海參在醫(yī)藥方面中治療各種血栓引起的病癥提供重要的參考價值[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)利用體外重組表達(dá)的海參溶菌酶C端多肽(rSjLys-C)檢測其異構(gòu)酶活性，為深入研究rSjLys-C性質(zhì)提供理論基礎(chǔ)，為充分發(fā)揮異構(gòu)肽酶活性提供必備的理論條件。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

DH5α和Rosetta-GamiB(DE3)pLysS，上海北諾生物科技有限公司；Rosetta-GamiB (DE3)pLysS/pET-32a-SjLys-C基因工程菌，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；質(zhì)粒提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；Protein markers，大連寶生物有限公司；Ni2+-NTA親和層析填料，GE healthcare公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸序列同源性分析

利用多序列比對軟件Cluster X[12]對SjLys蛋白的C-domain和5種異構(gòu)肽酶的氨基酸序列進(jìn)行序列比對，分析序列的同源性和結(jié)構(gòu)域的保守性。其中，水蛭(Hirudomedicinalis)，安德愛勝蚓(Eiseniaandrei)，花蛤(TapesJaponica)，美洲板口線蟲(Necatoramericanus)，魯本斯海星(Asteriasrubens)的氨基酸序列來源于GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。海參溶菌酶C端多肽氨基酸序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫中的SjLys序列。

1.2.2融合蛋白rSjLys-C的表達(dá)與純化

Rosetta-GamiB(DE3)pLysS/pET-32a-SjLys-C菌種活化后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體。菌體細(xì)胞超聲破碎后，離心收集上清液。經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化后， SDS-PAGE檢測[13]。

1.2.3融合蛋白rSjLys-C異構(gòu)肽酶的活性檢測

以MOPS配制0.75 mg/mL rSjLys-C母液和0.50 mg/mL L-γ-Glu-pNA母液。將0.25 mg/mL rSjLys-C加入到0.33 mg/mL L-γ-Glu-pNA樣品中，37 ℃水浴，每隔一段時間，測定405 nm處吸光度，檢測rSjLys-C蛋白的異構(gòu)肽酶活性[6]。

1.2.4PMSF對rSjLys-C蛋白異構(gòu)肽酶活性的抑制作用

向反應(yīng)體系內(nèi)加入不同濃度的PMSF，對照組加入相應(yīng)量的無水乙醇。37 ℃水浴反應(yīng)20 h，測定405 nm處的吸光度，分析PMSF對蛋白異構(gòu)肽酶活性的影響[14]。

1.2.5rSjLys-C蛋白異構(gòu)肽酶活性的影響因素

以0.25 mg/mL L-γ-Glu-pNA為底物，在50 mmol/L MOPS (pH 7.0)，37 ℃水浴條件下，檢測不同的蛋白質(zhì)量濃度(25～300 μg/mL)的異構(gòu)肽酶活性。37 ℃水浴條件下檢測不同pH對蛋白異構(gòu)肽酶活性的影響。在pH 7.4，50 mmol/L MOPS條件下，研究不同溫度對活性的影響，并分析5～300 mmol/L NaCl離子強(qiáng)度對rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性的影響。

1.2.6酶反應(yīng)動力學(xué)

繪制p-NA標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.074 8x+0.000 4(R2=0.999 9)。

分析rSjLys-C蛋白的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。rSjLys-C酶促反應(yīng)條件：pH 7.4 50 mmol/L MOPS， 1～50 mmol/L，37 ℃。0.25 mg/mL rSjLys-C蛋白與不同濃度的底物反應(yīng)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算p-NA的生成量，繪制酶促反應(yīng)曲線，求出不同底物反應(yīng)的初始速度V0。以V0-[S]作圖，經(jīng)Origin 8.5非線性擬合，求出rSjLys酶促反應(yīng)的Vmax、Km、kcat及kcat/Km[15]。

2結(jié)果與討論

2.1SjLys-C氨基酸殘基與其他異構(gòu)肽酶序列同源性分析

Cong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，海參溶菌酶蛋白C端多肽(SjLys-C)可能同時具有抑菌活性和異構(gòu)肽酶活性。利用多序列比對軟件發(fā)現(xiàn)，SjLys-C多肽序列上異構(gòu)肽酶活性位點(diǎn)絲氨酸(Ser)和組氨酸(His)高度保守(如圖1所示)。分布在活性位點(diǎn)周圍的氨基酸殘基(方框內(nèi))相對于其他位置也具有較高的同源性，形成高度保守序列：CS-(A/C)V(Q/R)-YM-RY(G/A)(T/V)和C(E/Q)(D/G)(F/Y)AR-HNGG-G。通?；钚晕稽c(diǎn)附近的氨基酸序列對酶活性和功能至關(guān)重要，是其發(fā)揮催化作用的結(jié)構(gòu)域。序列比對結(jié)果表明，SjLys-C蛋白可能具有異構(gòu)肽酶活性。

2.2重組rSjLys-C蛋白的分離純化及鑒定

圖2為重組海參溶菌酶C端多肽的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。由于帶有標(biāo)簽，重組蛋白質(zhì)rSjLys-C的分子質(zhì)量為26.083 ku。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IPTG成功誘導(dǎo)宿主表達(dá)目的蛋白(1,2,4列)。經(jīng)過Ni2+-NTA親和層析純化后得到高純度的rSjLys-C。軟件分析[17]rSjLys-C的純度達(dá)95.37%，基本滿足體外實(shí)驗(yàn)的要求。

2.3rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性的檢測

L-γ-Glu-pNA作為特異性底物，能被異構(gòu)肽

圖1　海參溶菌酶C端多肽與其他異構(gòu)肽酶氨基酸序列比對結(jié)果

M，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量；1，誘導(dǎo)前菌體總蛋白；2，誘導(dǎo)后菌體總蛋白；3，細(xì)胞破碎后沉淀；4，細(xì)胞破碎后上清總蛋白；5，Ni-NTA洗脫液

圖2rSjLys-C的表達(dá)與純化結(jié)果

Fig.2Expression and purification results of rSjLys-C

酶有效水解，生成對硝基苯胺(p-NA，橙黃色)[11]。以L-γ-Glu-pNA為底物，檢測rSjLys-C的異構(gòu)肽酶活性。由圖3可知，rSjLys-C能有效地催化水解L-γ-Glu-pNA生成p-NA，表明rSjLys-C具有異構(gòu)肽酶活性。

圖3　rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性

2.4rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性位點(diǎn)

根據(jù)圖1結(jié)果推測，海參溶菌酶C端多肽上Ser66是異構(gòu)肽酶活性位點(diǎn)。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF，通過進(jìn)入絲氨酸蛋白酶的催化中心，與催化中心的絲氨酸反應(yīng)，生成苯甲?；酋＝z氨酸和HF，從而抑制了以Ser為主要酶活位點(diǎn)的絲氨酸蛋白酶的活性[14]。由圖4可知，PMSF可以有效抑制rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性，表明Ser66為rSjLys-C蛋白的主要催化位點(diǎn)，即rSjLys-C屬于絲氨酸蛋白酶超家族的一員。

圖4　PMSF對rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性的影響

2.5rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性的影響因素

分別分析酶質(zhì)量濃度、pH、離子強(qiáng)度及溫度對rSjLys-C酶促反應(yīng)的影響,結(jié)果如圖6所示。當(dāng)rSjLys-C質(zhì)量濃度小于100 μg/mL，rSjLys-C的酶活性隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)；100～350 μg/mL(圖6(a))，rSjLys-C的催化程度100%。因此，選取0.025 mg/mL rSjLys-C和0.25 mg/mL L-γ-Glu-pNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖6(b) 可知，在pH 6.0～7.4，rSjLys-C具有較高的酶活，當(dāng)pH=7.4時，蛋白異構(gòu)肽酶活性最高；pH<6.0或pH>7.4時，蛋白異構(gòu)肽酶活性明顯下降。但rSjLys-C對pH具有較高的耐受性，在過酸(pH 4.0)或過堿(pH 9.0)的條件下，酶活仍維持在70%。圖6(c)結(jié)果表明，rSjLys-C的異構(gòu)肽酶活性對離子強(qiáng)度具有明顯的依賴性。當(dāng)NaCl濃度在50 mmol/L時，rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性最高；離子強(qiáng)度的降低或增加，都會降低其異構(gòu)肽酶活性(圖6(c))。溫度對rSjLys-C酶活有較大影響(圖6(d))。酶活的最適溫度為37 ℃；當(dāng)溫度超過50 ℃時，異構(gòu)肽酶的催化活性降低了80%。由此，確定最適酶反應(yīng)條件為:溫度37 ℃，pH 7.4，NaCl濃度50 mmol/L。

圖5　酶質(zhì)量濃度、pH、離子強(qiáng)度和溫度對rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性的影響

圖6　rSjLys-C異構(gòu)肽酶活性的動力學(xué)分析

2.6rSjLys-C異構(gòu)肽酶酶促反應(yīng)動力學(xué)分析

rSjLys-C異構(gòu)肽酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)分別為Vmax=1.446×10-5L/(mol·s),Km=0.395 7 mmol/L，kcat=Vmax/[rSjLys-C]=1.509×10-3s-1，kcat/Km=3.813 L/(mol·s)。

1/Km表示酶對底物的親和力。與其他的異構(gòu)肽酶進(jìn)行活性比較，分析rSjLys-C蛋白的異構(gòu)肽酶活性。從表1中可以看出，rSjLys-C蛋白對底物的Km明顯偏高，約為Medicinal leech失穩(wěn)酶和Tapesjaponica異構(gòu)肽酶兩種蛋白的7.9～18.5倍，表明rSjLys-C蛋白對底物L(fēng)-γ-Glu-pNA的親和力較弱。這是由于rSjLys-C是重組蛋白。

表1　不同異構(gòu)肽酶動力學(xué)參數(shù)

SjLys-C序列的N末端帶有重組標(biāo)簽，His-Tag，Trx-Tag和S-Tag，導(dǎo)致在重組蛋白的三級結(jié)構(gòu)中，海參溶菌酶C端多肽區(qū)域的氨基酸殘基出現(xiàn)一定程度的包埋，從而影響蛋白rSjLys-C與底物的結(jié)合。

在同一種目標(biāo)底物的條件下，酶促反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)中的kcat和kcat/Km分別表示不同酶對底物的催化速率和催化效率。由表1可知，相較于另兩種異構(gòu)肽酶，rSjLys-C對底物催化速率高；且rSjLys-C對底物的催化效率是Tapesjaponica異構(gòu)肽酶的3.56倍。

3結(jié)論

重組海參溶菌酶的C端多肽具有異構(gòu)肽酶活性，雖然rSjLys-C對底物的親和力較低，但是rSjLys-C對L-γ-Glu-pNA具有較高的水解速率和催化效率。實(shí)驗(yàn)為深入了解海參溶菌酶的性質(zhì)，提供了其異構(gòu)肽酶活性的理論基礎(chǔ)。

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Elucidation of the isopeptidase activity for the recombinant C-domain polypeptide of sea cucumber lysozyme

NIUQingchang,LICheng,LIANGWenjing,MAJun,SUIRuirui,ZHANGYang,CONGLina

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:It was demonstrated that the catalytic sites of Ser and His for the isopeptidase activity were highly conserved and the amino acids around the key sites were highly homologous, compared with five isopeptidases of different species by Cluster X software. The result of rSjLys-C catalyzed L-γ-Glu-pNA to generate p-NA indicated that rSjLys-C possessed the isopeptidase activity. PMSF could destroy the isopeptidase activity of rSjLys-C effectively as a serine protease inhibitor, indicating that Ser66was the key active site of rSjLys-C. The results showed that the optimum reaction conditions were 37 ℃, pH 7.4, NaCl 50 mmol/L. Kinetic parameters for the isopeptidase activity of rSjLys-C were determined as follows: Vmax=1.446×10-5mmol/(L·s), Km=0.395 7 mmol/L, kcat=1.509×10-3s-1, kcat/Km=3.813 L/(mol·s).

Key words:sea cucumber; lysozyme; isopeptidase; catalytic site

收稿日期:2015-02-23.

基金項(xiàng)目:海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201405003-3)；遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺專項(xiàng)項(xiàng)目(LT2011008)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2014217).

作者簡介:牛慶昌(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：叢麗娜(1962-)，女，教授.

中圖分類號:TS254.1；Q556.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1674-1404(2016)03-0162-05