循環(huán)包裝回收技術(shù)在篩選肝癌細(xì)胞相關(guān)耐藥基因中的應(yīng)用

戴文燕，朱瑞宇，金堅(jiān)江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇　無(wú)錫　214122

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循環(huán)包裝回收技術(shù)在篩選肝癌細(xì)胞相關(guān)耐藥基因中的應(yīng)用

戴文燕，朱瑞宇，金堅(jiān)
江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122

戴文燕, 朱瑞宇, 金堅(jiān). 循環(huán)包裝回收技術(shù)在篩選肝癌細(xì)胞相關(guān)耐藥基因中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(2): 204–211.

Dai WY, Zhu RY, Jin J. Screening of drug resistent gene by cyclical packaging rescue of hepatocellular carcinoma retroviral cDNA libraries. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 204–211.

摘 要:肝癌先天性多表達(dá)多藥耐藥基因，嚴(yán)重影響肝癌的化療效果，篩選肝癌細(xì)胞中的耐藥基因，研究其耐藥機(jī)制有助于提高肝癌化療效果，提高肝癌的治愈率。首先構(gòu)建肝癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒的cDNA文庫(kù)，感染成纖維細(xì)胞，使得逆轉(zhuǎn)錄病毒基因整合進(jìn)細(xì)胞，加藥篩選，存活細(xì)胞中的基因再次包裝成病毒，用于下一輪篩?選。采用循環(huán)包裝回收 (Cyclical packaging rescue，CPR) 技術(shù)進(jìn)行肝癌細(xì)胞耐藥基因的篩選即是通過(guò)病毒包裝將基因從細(xì)胞中釣取出來(lái)，相比于常規(guī)篩選方法，僅通過(guò)一輪篩選可能會(huì)出現(xiàn)很多假陽(yáng)性基因，采用CPR技術(shù)則是通過(guò)多輪篩選，很大程度減少了假陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)。通過(guò)該方法經(jīng)過(guò)四輪篩選獲得核糖體蛋白S11 (RPS11)、核糖體蛋白L6 (RPL6)、核糖體蛋白L11 (RPL11)、核糖體蛋白L24 (RPL24) 等幾種基因，經(jīng)初步檢測(cè)，增加了細(xì)胞的耐藥性。

關(guān)鍵詞:循環(huán)包裝回收技術(shù)，肝癌，cDNA文庫(kù)，耐藥基因

Received: March 17, 2015; Accepted: April 27, 2015

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-06-04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150604.0914.001.html

近年來(lái)，隨著功能基因研究的不斷深入，高效快捷的功能基因篩選方法受到廣泛關(guān)注。循環(huán)包裝回收 (CPR) 技術(shù)是在2002年美國(guó)科學(xué)院院報(bào) (PNAS) 的一篇文獻(xiàn)上首次應(yīng)用，并篩選出多個(gè)功能基因[1]。此后，對(duì)采用CPR技術(shù)篩選的功能基因iRhom2進(jìn)行研究，其成果刊登在2012年美國(guó)Science雜志上[2]。CPR技術(shù)的成功運(yùn)用顯示了其在功能基因篩選領(lǐng)域的優(yōu)越性，但是在國(guó)內(nèi)還未曾有使用該技術(shù)進(jìn)行功能基因篩選的相關(guān)報(bào)道。

CPR技術(shù)篩選的一個(gè)大致過(guò)程如下：首先用逆轉(zhuǎn)錄病毒的cDNA文庫(kù)感染宿主細(xì)胞，使得逆轉(zhuǎn)錄病毒的cDNA文庫(kù)中的基因整合到宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，再加藥處理細(xì)胞，使得細(xì)胞90%死亡，存活的細(xì)胞用逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝質(zhì)粒pGP vector和pE-eco vector將細(xì)胞的中的基因重新包裝成病毒，再用于下一輪感染宿主細(xì)胞。

CPR篩選的具體流程如圖1所示。

圖1　CPR篩選流程圖Fig. 1 The flow chart of CPR.

采用CPR技術(shù)篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒的cDNA文庫(kù)中的功能基因在很大程度上減少了假陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)，更加高效地從逆轉(zhuǎn)錄病毒的cDNA文庫(kù)分離獲得功能基因[3-8]。

在我國(guó)，肝癌被稱(chēng)為“癌癥之王”，在惡性腫瘤死亡率中位居第二，僅次于肺癌[9-11]。肝癌先天性多表達(dá)多藥耐藥基因，嚴(yán)重影響化療效果[12-14]。因此肝癌治療過(guò)程中的耐藥性受到了廣泛的關(guān)注，促使科研工作者加強(qiáng)對(duì)肝癌耐藥方面的研究。目前普遍認(rèn)為腫瘤耐藥機(jī)制的發(fā)生與多種耐藥相關(guān)的酶和蛋白有關(guān)，采用CPR技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞耐藥基因，研究耐藥機(jī)制，有助于緩解肝癌耐藥，促進(jìn)肝癌治療技術(shù)的發(fā)展。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑、菌株、細(xì)胞株

RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。SMARTTMcDNA Library Construction Kit購(gòu)自Clontech (美國(guó))。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker均購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司。Expand High Fidelity PCR System購(gòu)自Roche公司。DMEM、1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司。Cell Titer-Blue?Cell Viability Assay購(gòu)自Promega公司。293T細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞、Bel-7402細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2肝癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

總RNA的提?。喝?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Bel-7402，加入適量的Trizol，按照說(shuō)明書(shū)的步驟提取總RNA，電泳檢測(cè)RNA的完整性，并測(cè)定OD值檢測(cè)RNA的純度。

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：根據(jù)Smart cDNA library構(gòu)建試劑盒 (Clontech) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行肝癌細(xì)胞文庫(kù)的構(gòu)建。首先以提取的總RNA為模板，有SfiⅠ酶切位點(diǎn)的SMART IV Oligonucleotide和CDSⅢ /3′PCR primer為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)PCR儀以及模板用量，確定最佳循環(huán)數(shù)后，合成cDNA第二鏈。雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化以及SfiⅠ酶切及片段純化后，進(jìn)行DNA的分級(jí)，連接到pLIB載體上，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，獲得cDNA文庫(kù)。

cDNA文庫(kù)豐度的檢測(cè)：以cDNA文庫(kù)為模板，載體兩端序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)文庫(kù)的豐度。

1.3逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝

逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)通常是由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、兩個(gè)包膜蛋白載體和包裝細(xì)胞系組成。本研究選用293T細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，用連逆轉(zhuǎn)錄病毒載體cDNA文庫(kù)、pGP vector和pE-eco vector質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，分別收集轉(zhuǎn)染24、48和72 h的病毒，并測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度。

1.4耐藥基因的篩選

CPR技術(shù)是一種循環(huán)病毒包裝技術(shù)。CPR篩選過(guò)程中，首先選擇一株比較敏感的成纖維細(xì)胞NIH-3T3作為宿主細(xì)胞，這樣就減少了由于宿主細(xì)胞耐藥產(chǎn)生的假陽(yáng)性現(xiàn)象。首先NIH-3T3細(xì)胞鋪六孔板，12 h后細(xì)胞匯合度大概在80%左右，采用稀釋適當(dāng)倍數(shù)的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行感染，48 h后，撤去病毒上清，將細(xì)胞消化到兩個(gè)直徑10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加阿霉素處理細(xì)胞48 h，使得細(xì)胞死亡率達(dá)到90%。再次更換新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)使細(xì)胞狀態(tài)得到恢復(fù)，然后轉(zhuǎn)染pGP vector和pE-eco vector將細(xì)胞里面的基因包裝成病毒，用于下一輪篩選。轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞提取細(xì)胞基因組，以基因組作為模板，使用載體兩端的引物進(jìn)行PCR，檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的情況。

1.5耐藥基因功能的初步驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)特異性條帶的部分割膠回收，然后酶切再次連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體pLIB上，轉(zhuǎn)化挑取單菌落，進(jìn)行測(cè)序。然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，加入不同濃度的阿霉素，48 h后，采用Promega公司試劑盒CellTiter-Blue?Cell Viability Assay測(cè)定宿主細(xì)胞耐藥指數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1肝癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

2.1.1總RNA提取和雙鏈DNA的合成

在cDNA文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，RNA的提取是第一步，這一步驟直接關(guān)系到構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的質(zhì)量，RNA如果降解將會(huì)降低文庫(kù)的豐度。圖2A是提取的RNA的凝膠電泳圖，泳道M為1 kb的Marker，泳道1為細(xì)胞Bel-7402的RNA，顯示28S和18S的條帶較亮，28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍，且5S的條帶幾乎看不到，說(shuō)明RNA在提取過(guò)程中幾乎沒(méi)有降解。檢測(cè)RNA的OD280和OD260，比值為1.83。從RNA的電泳圖以及RNA的OD280和OD260分析所得，RNA提取質(zhì)量符合文庫(kù)構(gòu)建的要求。在合成cDNA雙鏈的過(guò)程中實(shí)際上就直接關(guān)系到最終連接到載體上的DNA片段的大小，所以在這一實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須保持雙鏈DNA的彌散程度，此外不應(yīng)該有特異性條帶出現(xiàn)，特異性條帶的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中相同基因的量增加，使得庫(kù)容量降低。圖2B中泳道M為1 kb plus Marker，泳道1為細(xì)胞Bel-7402的dsDNA，由圖可知dsDNA的條帶主要集中在0.4–2 kb之間，且沒(méi)有特異性的條帶。

圖2　細(xì)胞Bel-7402的RNA和dsDNA電泳圖Fig. 2 Electrophoresis analysis of total RNA and dsDNA of Bel-7402.

2.1.2cDNA文庫(kù)豐度的檢測(cè)

cDNA連接到載體上轉(zhuǎn)化之后進(jìn)行克隆數(shù)計(jì)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中Bel-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)化后共涂40個(gè)直徑15 cm的培養(yǎng)皿，為了計(jì)算涂布之后的克隆數(shù)，選擇涂布前的菌液取2 μL稀釋至100 μL，然后涂板計(jì)算克隆數(shù)，最終乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算總克隆數(shù)。此外還計(jì)算了空載率大概在2.7%左右。除去空載，計(jì)算所得Bel-7402克隆數(shù)大概為1.3×106個(gè)。

采用pLIB載體SfiⅠ酶切位點(diǎn)附近的序列作為引物，檢測(cè)文庫(kù)的豐度，電泳結(jié)果如圖3所示，泳道M為1 kb plus的Marker，泳道1為Bel-7402的cDNA文庫(kù)PCR的結(jié)果，cDNA片段大小基本在0.4–2 kb之間，與SMART法構(gòu)建的cDNA文庫(kù)所要求的片段大小一致。

圖3　Bel-7402細(xì)胞cDNA文庫(kù)PCR電泳圖Fig. 3 Electrophoresis analysis of PCR of cDNA libraries of Bel-7402.

2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定

病毒包裝完成之后必須要對(duì)病毒的滴度進(jìn)行測(cè)定，從而確定下一步感染細(xì)胞時(shí)稀釋的倍數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中采用了熒光定量PCR的方法進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。圖4為熒光定量PCR測(cè)定模板RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)樣品的Ct算所測(cè)病毒的滴度分別為：

24 h收集的病毒：2.22×106ivp/mL；

48 h收集的病毒：4.19×107ivp/mL；

72 h收集的病毒：3.00×107ivp/mL。

2.3耐藥基因篩選

采用CPR技術(shù)進(jìn)行耐藥基因篩選后，每一輪篩選后的細(xì)胞包裝過(guò)病毒之后提取細(xì)胞基因組，進(jìn)行基因組PCR，電泳結(jié)果如圖5–8所示(其中M為DL2 000的Marker，標(biāo)號(hào)1、2、3、4……均代表六孔板中同一批次不同孔的細(xì)胞所提的基因組)。從結(jié)果可以看出，第一輪 (圖5) 和第二輪 (圖6) 篩選的條帶比較彌散，沒(méi)有特異性的條帶，而第三輪 (圖7) 和第四輪 (圖8) 篩選之后可以發(fā)現(xiàn)條帶仍比較彌散，但是已經(jīng)有一些特異性的條帶出現(xiàn)，這些特異性的條帶中可能就存在具有耐藥功能的基因。

圖4　RNA模板標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 A standard cure by using RNA control template.

圖5　CPR第一輪篩選細(xì)胞基因組PCRFig. 5 The first selection round of CPR.

圖6　CPR第二輪篩選細(xì)胞基因組PCRFig. 6 The second selection round of CPR.

圖7　CPR第三輪篩選細(xì)胞基因組PCRFig. 7 The third selection round of CPR.

圖8　CPR第四輪篩選細(xì)胞基因組PCRFig. 8 The fourth selection round of CPR.

2.4耐藥基因耐藥性的初步檢驗(yàn)

將第四輪篩選中特異性條帶的部分割膠回收，連接到pLIB載體上，轉(zhuǎn)化挑單克隆送去測(cè)序。經(jīng)測(cè)序出現(xiàn)頻率比較高的有核糖體蛋白S11 (RPS11)、核糖體蛋白L6 (RPL6)、核糖體蛋白L11 (RPL11)、核糖體蛋白L24 (RPL24)、細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ (COX2) 等幾種基因。提取這幾種基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH-3T3細(xì)胞測(cè)定NIH-3T3細(xì)胞的耐藥指數(shù) (圖9)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析所得，有RPS11、RPL6、RPL11、RPL24幾種基因的耐藥指數(shù)有所上升，但其具體耐藥功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖9　選出的基因的耐藥性的測(cè)定Fig. 9 The determination of drug resistent index of the screening genes.

3　討論

本研究構(gòu)建了肝癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，采用CPR技術(shù)進(jìn)行肝癌細(xì)胞中耐藥基因的篩選。該技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于多輪循環(huán)篩選，很大程度減少了假陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)，增加篩選出的耐藥基因的可信度。CPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主的功能基因篩選，此外這種方法通過(guò)循環(huán)病毒包裝回收技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)功能基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞間的傳遞，使基因功能的鑒定更加快速方便。

本研究篩選獲得RPS11、RPL6、COX2、RPL11、RPL24等幾種基因，經(jīng)初步檢測(cè)RPS11、RPL6、RPL11、RPL24增加了細(xì)胞的耐藥性。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這幾種基因在細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用[15-18]。例如RPL6基因?qū)儆诤颂求wL6蛋白，有相關(guān)文獻(xiàn)顯示，在p53調(diào)控通路中發(fā)揮著重要作用，且在耐藥細(xì)胞中蛋白表達(dá)量增加[19-22]。RPS11與蛋白泛素化過(guò)程密切相關(guān)，而這一過(guò)程又關(guān)系到細(xì)胞的癌變[23]。關(guān)于RPL11在惡性腫瘤中的研究尚不是很多，但是RPL11與mTOR通路和p53因子間相關(guān)，RPL11能夠保持p53穩(wěn)定，但雷帕霉素抑制劑能夠下調(diào)RPL11的表達(dá)，從而破壞RPL11與p53之間的穩(wěn)定[16]。此外已有研究表明RPL24的過(guò)表達(dá)會(huì)引起肝癌細(xì)胞的耐藥[24-25]。但是這些因子具體如何在肝癌細(xì)胞的耐藥通路中發(fā)揮作用還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

在耐藥基因功能的初步鑒定中發(fā)現(xiàn)篩選獲得的細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅱ (COX2) 不能發(fā)揮耐藥功能。COX2是細(xì)胞色素氧化酶的一個(gè)亞基，必須要通過(guò)與其他亞基和輔助因子組裝才能發(fā)揮酶活性。這一因子單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可能無(wú)法發(fā)揮其功能，但是與其他因子相互作用是否能發(fā)揮耐藥功能也有待進(jìn)一步研究。

對(duì)篩選出的耐藥基因進(jìn)行功能研究，有助于進(jìn)一步研究肝癌的耐藥機(jī)制，為肝癌患者提供個(gè)性化的治療方案，且促進(jìn)抗肝癌藥物新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

組織工程與細(xì)胞培養(yǎng)

Screening of drug resistent gene by cyclical packaging rescue of hepatocellular carcinoma retroviral cDNA libraries

Wenyan Dai, Ruiyu Zhu, and Jian Jin
School of Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Abstract:Multidrug resistant genes are highly expressed in hepatocellular carcinoma that seriously affects the effect of chemotherapy. Screening of resistant genes from HCC cells and studying its mechanism of drug resistance will be helpful to improve the effecacy of chemotherapy for hepatocellular carcinoma. Here we described an alternative method called cyclical packaging rescue (CPR). First we constructed a retrovirus cDNA library of hepatoma cells and used it to infect fibroblasts. Then we added drugs to screen survival cells. The survival cells, stably integrated helper-free retroviral libraries, were recovered rapidly after transfection with plasmids expressing retroviral gag-pol and env genes. Through this method, retroviral RNAs were directly repackaged into new infectious virions. Recovered retroviral supernatant was then used to reinfect fresh target cells. When performed in concert with selection using functional assays, cDNAs regulating functional responses could be identified by enrichment through multiple rounds of retroviral library recovery and retransmission. Using CPR, we obtained several cDNAs. After a preliminary detection, we found Ribosomal protein S11 (RPS11), Ribosomal protein L6 (RPL6), Ribosomal protein L11 (RPL11), Ribosomal protein L24 (RPL24) possibly had drug resistant function.

Keywords:cyclical packaging rescue, hepatocellular carcinoma, cDNA libraries, drug resistant genes

Corresponding authors: Jian Jin. Tel: +86-510-85918219; E-mail: jinjian31@hotmail.com Ruiyu Zhu. E-mail: ry_zhu@sina.com