酚酮類對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵及脂肪酸組成的影響

楊金龍，程逸超，朱圓圓，朱均均,2，陳婷婷，徐勇,2，勇強(qiáng)，余世袁,2 南京林業(yè)大學(xué)　化學(xué)工程學(xué)院，江蘇　南京　200372 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇　南京　20037

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酚酮類對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵及脂肪酸組成的影響

楊金龍1*，程逸超1*，朱圓圓1，朱均均1,2，陳婷婷1，徐勇1,2，勇強(qiáng)1，余世袁1,2
1 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210037
2 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210037

楊金龍, 程逸超, 朱圓圓, 等. 酚酮類對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵及脂肪酸組成的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(2): 185–194.

Yang JL, Cheng YC, Zhu YY, et al. Effect of phenolic ketones on ethanol fermentation and cellular lipid composition of Pichia stipitis. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 185–194.

摘 要:木質(zhì)素降解產(chǎn)物對(duì)微生物產(chǎn)生的抑制作用，是燃料乙醇生物煉制的主要瓶頸之一。本文以樹干畢赤酵母為發(fā)酵菌株，研究木質(zhì)素降解產(chǎn)物中3種酚酮類 (4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮) 對(duì)其木糖乙醇發(fā)酵及酵母細(xì)胞脂肪酸組成的影響。采用高效液相色譜 (HPLC) 和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC/MS) 技術(shù)對(duì)乙醇發(fā)酵性能和酵母細(xì)胞脂肪酸組成進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，酚酮類物質(zhì)對(duì)乙醇發(fā)酵呈現(xiàn)抑制作用且其分子量越低抑制作用越明顯，當(dāng)4-羥基苯乙酮濃度為1.50 g/L時(shí)，發(fā)酵24 h的木糖利用率、乙醇得率和乙醇濃度分別下降了42.47%、5.30%和9.76 g/L；培養(yǎng)基中存在酚酮類物質(zhì)時(shí)，酵母細(xì)胞中的不飽和脂肪酸的比例上升，添加1.50 g/L的3種酚酮類物質(zhì)后，樹干畢赤酵母細(xì)胞不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例從原來的2.58分別上升到3.03、3.06和3.61，酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性隨之上升，不穩(wěn)定性提高。因此，酚酮類物質(zhì)能夠降低酵母生長、提高不飽和脂肪酸的比例以及降低乙醇發(fā)酵能力，有效降低或去除木質(zhì)素降解產(chǎn)物含量是提高木質(zhì)纖維原料生物煉制的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞:酚酮類物質(zhì)，樹干畢赤酵母，乙醇發(fā)酵，脂肪酸組成

Received: June 3, 2015; Accepted: August 17, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31100432), National Science and Technology Pillar Program during the Twelfth Five-Year Plan Period (No. 2015BAD15B09), Graduate Research and Innovation Plan of Jiangsu Province (No. SJLX_0406), A Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31100432)，“十二五”國家科技支撐計(jì)劃 (No. 2015BAD15B09)，江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No. SJLX_0406)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目 (PAPD) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-10-21網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151021.1032.001.html

化石能源日益短缺，生物質(zhì)能源是一種很有前景的替代能源[1]。在綠色經(jīng)濟(jì)中，燃料乙醇是一種發(fā)展較快并且很有前途的產(chǎn)業(yè)。在我國對(duì)國外石油依賴度很高、能源危機(jī)的今天，發(fā)展燃料乙醇更有著特殊的意義[2]。可再生植物資源主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3大部分組成。在一些農(nóng)作物如玉米秸稈中，半纖維素 (尤其是木聚糖) 的含量與纖維素含量相當(dāng)。植物纖維素原料中半纖維素的主要單糖是木糖，有效地利用木糖和其他半纖維素單糖是植物纖維素原料發(fā)酵生成乙醇的關(guān)鍵[3-4]，已知樹干畢赤酵母是少數(shù)天然能夠發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇并且發(fā)酵效率較高的菌種之一[5]。木質(zhì)纖維原料作為可再生植物資源制取燃料乙醇一般包括3大步驟：原料預(yù)處理、酶水解和乙醇發(fā)酵[6]，然而木質(zhì)纖維素在預(yù)處理過程中會(huì)產(chǎn)生一定量的副產(chǎn)物，其中包括弱酸、糠醛、酚類等[7]，這些副產(chǎn)物具有一定的毒性，嚴(yán)重降低了發(fā)酵效率，甚至可以完全抑制發(fā)酵的進(jìn)行[8-9]。在木質(zhì)纖維原料預(yù)處理和水解過程中，根據(jù)甲氧基化程度和官能團(tuán)的不同，酚類可以分為酚醛、酚酮、酚酸等3類。Zhu等[10]研究了3種酚醛類 (香草醛、紫丁香醛、4-羥基苯甲醛) 和3種酚酸類（香草酸、紫丁香酸、4-羥基苯甲酸）對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，酚醛類和酚酸類均有一定的抑制作用。Klinke等[11]在綜述中總結(jié)了在稀酸預(yù)處理的水解液中發(fā)現(xiàn)了酚酮類物質(zhì)。目前已知的酚酮類物質(zhì)主要有4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮[12]。然而酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵的影響尚未見報(bào)道。此外，抑制物對(duì)微生物發(fā)酵的影響首先作用于微生物的細(xì)胞膜[13]，細(xì)胞膜的流動(dòng)性直接影響到物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。而細(xì)胞膜脂肪酸是細(xì)胞總脂肪酸中含量最高、最為關(guān)鍵的一類，并且目前尚無統(tǒng)一的微生物細(xì)胞膜脂肪酸分析程序，因此，可以通過測(cè)定細(xì)胞總脂肪酸來間接反映細(xì)胞膜磷脂中脂肪酸的變化，從而推測(cè)抑制物對(duì)細(xì)胞膜的影響[14]。本文主要研究3種酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵及其細(xì)胞脂肪酸組成的影響，這對(duì)于提高乙醇產(chǎn)率、降低植物纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇的成本具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

樹干畢赤酵母Pichia stipitis NLP31，由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所篩選并保藏，保存在4 ℃瓊脂-糖斜面上。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基 (g/L)：木糖20，蛋白胨5，酵母浸膏3，瓊脂25，pH值5.5；活化及增殖培養(yǎng)基 (g/L)：木糖30，蛋白胨5，酵母浸膏3，用蒸餾水配制；發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖45 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，EDTA 30 mg/L，ZnSO4·7H2O 9 mg/L，MnCl2·2H2O 2 mg/L，CoCl2·6H2O 0.6 mg/L，CuSO4·5H2O 0.6 mg/L，Na2MoO4·H2O 0.8 mg/L， CaCl2·2H2O 9 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 6 mg/L，H3BO32 mg/L，KI 0.2 mg/L。用pH 6.0的檸檬酸緩沖液配制[15]。

1.2方法

1.2.1酵母培養(yǎng)方法

活化及增殖培養(yǎng)條件：溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速170 r/min。當(dāng)酵母增殖幾輪，酵母OD600達(dá)到10以后，將離心后的酵母轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.2.2木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制物的發(fā)酵

向木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 g/L) 的3種酚酮類抑制物 (4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮)，接入初始接種量OD600為10的樹干畢赤酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

1.2.3總脂肪酸的提取

脂肪酸的提取參考Bligh和Dyer脂肪酸提取步驟[16]。發(fā)酵結(jié)束后離心收集酵母 (3.0 g濕重)，酵母泥用30 mL無菌水洗滌，4 000 r/min離心10 min，重復(fù)洗滌兩次，將洗滌后的酵母泥懸浮在10 mL的10 %冷的三氯乙酸中。然后向三氯乙酸酵母懸浮液中加入20 mL蒸餾水、80 mL甲醇和40 mL氯仿，超聲波下破碎細(xì)胞30 min。超聲波結(jié)束后將該混合物再電磁攪拌90 min，電磁攪拌結(jié)束后加入40 mL氯仿和40 mL蒸餾水于該懸浮液，分層后得到的氯仿層，用無水硫酸鈉干燥后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，得到酵母總脂肪。

1.2.4甲酯化制備

在10 mL具塞玻璃管中，將10 mg左右的總脂肪溶解于9 mL新鮮配制的2%硫酸溶液(用無水甲醇溶解)，于70 ℃水浴中加熱 2 h后，加入9 mL蒸餾水稀釋，用正己烷萃取，將萃取后的正己烷混合，用蒸餾水洗滌正己烷，用無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行GC/MS分析。

1.3分析方法

1.3.1木糖、乙醇和木糖醇濃度的測(cè)定

木糖、乙醇和木糖醇等濃度定量分析在美國Agillent1260型高效液相色譜儀 (HPLC) 上進(jìn)行。采用Bio-Rad HPX-87H柱 (7.8 mm× 300 mm)，柱溫55 ℃，流動(dòng)相0.005 mol/L的硫酸，流速0.6 mL/min，上樣量10 μL，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。外標(biāo)法測(cè)定[15]。

1.3.2酵母濁度的測(cè)定

采用比濁法測(cè)定[10]。取0.5或1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min后去除上清液，用生理鹽水洗滌，重懸酵母，再重復(fù)操作一次后用蒸餾水稀釋，在723N型分光光度計(jì)600 nm波長下用0.5 cm光徑的比色皿測(cè)定吸光度，再乘以稀釋倍數(shù)即為酵母的光密度(OD) 值。

1.3.3發(fā)酵參數(shù)的計(jì)算方法

糖利用率表示消耗糖的濃度與發(fā)酵初始糖的濃度的百分比。乙醇得率是指實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的乙醇濃度與發(fā)酵過程中所消耗的糖在理論上能夠轉(zhuǎn)化成乙醇濃度的百分比，理論上1 g葡萄糖得到0.51 g乙醇，而1 g木糖得到0.46 g乙醇[17]。

1.3.4脂肪酸成分分析

使用Trace GC/MS聯(lián)用儀對(duì)甲酯化后的樣品進(jìn)行分析，色譜柱采用DB-5MS (30 m×0.25 mm ×0.25 μm)，N2作為柱中的載氣，載氣流速：1.0 mL/min。質(zhì)譜儀中離子化方式為EI，發(fā)射電流200 μA，電子能量為70 eV，氣化室溫度250 ℃。柱溫采用程序升溫：初溫80 ℃，保持3 min；以8 ℃/min升到260 ℃，保持5 min。測(cè)定完后，經(jīng)計(jì)算機(jī)化學(xué)工作站分析檢索其中的脂肪酸組分，并經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)按峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸組分的相對(duì)百分含量。

2　結(jié)果與討論

2.1未添加抑制物的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基的乙醇發(fā)酵歷程

在研究酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵影響之前，需要對(duì)樹干畢赤酵母進(jìn)行木糖乙醇發(fā)酵歷程的研究。在250 mL的三角瓶中加入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，以P. stipitis NLP31為發(fā)酵菌株，在初始接種量OD=10，150 r/min、30 ℃的搖床中發(fā)酵24 h，每隔4 h取樣，HPLC分析發(fā)酵液成分，其木糖、乙醇、糖利用率和乙醇得率隨時(shí)間的變化如圖1所示。

圖1　樹干畢赤酵母木糖發(fā)酵過程中參數(shù)的變化Fig. 1 Changes in the parameters during the fermentation of xylose medium by P. stipitis NLP31.

從圖1中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，木糖濃度直線下降，發(fā)酵20 h時(shí)，木糖濃度僅為0.39 g/L，乙醇濃度達(dá)到18.06 g/L，此時(shí)糖利用率、乙醇得率分別為99.08%和92.57%，說明樹干畢赤酵母能夠高效地利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇；發(fā)酵24 h時(shí)，糖的利用率為99.15%，乙醇得率下降為87.08%，乙醇濃度下降為17.00 g/L，這可能是由于酵母利用乙醇作為碳源來滿足自身生存的需要。

2.2添加3種酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵的影響

木質(zhì)纖維原料預(yù)處理和水解過程中的抑制物對(duì)酵母發(fā)酵的影響已經(jīng)有了廣泛的研究，主要集中在碳水化合物降解產(chǎn)物 (甲酸、乙酸、乙酰丙酸、5-羥甲基糠醛和糠醛) 和木質(zhì)素降解產(chǎn)物 (酚酸和酚醛)，但很少有研究涉及到木質(zhì)素降解產(chǎn)物中的酚酮類物質(zhì)，尤其針對(duì)木糖乙醇發(fā)酵，本文探索了木質(zhì)纖維原料預(yù)處理和水解過程中已發(fā)現(xiàn)的3種酚酮類物質(zhì) (4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮) 對(duì)樹干畢赤酵母木糖乙醇發(fā)酵的影響。在45 g/L木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加一定濃度 (0.25、0.50、0.75、1.00和1.50 g/L) 的3種酚酮類物質(zhì)，在初始接種量OD=10，30 ℃、150 r/min的條件下發(fā)酵24、36 h，其發(fā)酵產(chǎn)物乙醇濃度、發(fā)酵副產(chǎn)物木糖醇濃度、糖利用率和乙醇得率隨時(shí)間的變化如表1所示。

表1　酚酮類對(duì)樹干畢赤酵母木糖發(fā)酵糖利用率、乙醇濃度、乙醇得率的影響Table 1 Sugar utilization ratios, ethanol concentrations, ethanol yields obtained from the fermentation of xylose by P. stipitis NLP31 in the presence of three phenolic ketones

從表1可以看出，當(dāng)3種酚酮類的濃度為0.25 g/L、發(fā)酵24 h時(shí)，木糖的利用率分別為98.78%、98.07%和98.08%，乙醇得率分別為92.32%、87.20%和88.37%，相比于不添加酚酮類發(fā)酵木糖利用率有所下降，說明低濃度 (0.25 g/L)的酚酮類已經(jīng)對(duì)樹干畢赤酵母發(fā)酵起到抑制作用，隨著酚酮類物質(zhì)濃度的增加，抑制作用也越發(fā)明顯，木糖利用率逐漸下降，乙醇得率也隨著下降，當(dāng)3種酚酮類物質(zhì)濃度達(dá)到1.50 g/L時(shí)，發(fā)酵24 h，糖利用率分別為56.61%、65.58% 和82.10%，乙醇產(chǎn)量分別為9.34、11.03和15.14 g/L，乙醇得率分別為85.74%、85.09%和93.42%，其中4-羥基苯乙酮對(duì)樹干畢赤酵母發(fā)酵的抑制作用最為明顯，木糖利用率降低42.47%，4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮抑制作用最弱，木糖利用率降低17.05%，此現(xiàn)象說明低分子量的酚酮類對(duì)樹干畢赤酵母發(fā)酵抑制更為明顯，Palmqvist等[18]研究發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生的多種抑制物中，酚類化合物對(duì)發(fā)酵具有最強(qiáng)的抑制作用，并且低分子量酚類化合物毒性更強(qiáng)，且取代基的位置 (鄰位、間位、對(duì)位) 也影響酚類的毒性。發(fā)酵36 h時(shí)，當(dāng)3種酚酮類物質(zhì)的濃度小于1.00 g/L時(shí)，木糖的利用率大于90%，隨著濃度的增加，糖利用率逐漸降低；當(dāng)3種酚酮類物質(zhì)的濃度為1.50 g/L，此時(shí)的木糖利用率分別為81.78%、73.05%和98.36%，乙醇得率分別為75.18%、79.16%和86.00%。通過比較24、36 h的糖利用率、乙醇濃度和乙醇得率可以發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，糖利用率和乙醇濃度在增加，但乙醇得率并沒有相應(yīng)的增加，這說明在抑制物存在的條件下，酵母利用木糖轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物乙醇的得率在降低，有部分木糖可能用于抵抗抑制物對(duì)酵母抑制作用的消耗。通過比較不難發(fā)現(xiàn)，3種酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵的抑制作用的大小為：4-羥基苯乙酮>4-羥基-3-甲氧基苯乙酮>4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮，低分子量的酚酮類物質(zhì)抑制作用更大。當(dāng)酚酮類物質(zhì)的濃度小于1.00 g/L時(shí)，延長了發(fā)酵時(shí)間，對(duì)樹干畢赤酵母木糖乙醇發(fā)酵性能影響較??；當(dāng)酚酮類物質(zhì)的濃度大于1.00 g/L時(shí)對(duì)樹干畢赤酵母木糖乙醇發(fā)酵性能已起到明顯的抑制作用。

圖2為發(fā)酵36 h時(shí)，酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母細(xì)胞OD值及發(fā)酵副產(chǎn)物木糖醇生成的影響。從圖2可以看出，當(dāng)不添加酚酮類物質(zhì)時(shí)，酵母的生長繁殖速度較快，隨著酚酮類物質(zhì)濃度的增加，酵母生長繁殖的速度也減緩，然而酵母的生長速率仍然大于酵母的死亡速率，當(dāng)酚酮類物質(zhì)的濃度為1.50 g/L時(shí)，酵母的生長繁殖速度最慢，但酵母濃度高于發(fā)酵前的酵母濃度，說明酚酮類物質(zhì)對(duì)酵母生長繁殖的抑制作用并不十分明顯。

通過比較發(fā)酵副產(chǎn)物木糖醇，我們不難發(fā)現(xiàn)，隨著酚酮類物質(zhì)濃度的增加，木糖醇的產(chǎn)生也增加，同時(shí)，不同酚酮類物質(zhì)對(duì)木糖醇的產(chǎn)量影響也有所不同。當(dāng)不添加酚酮類物質(zhì)時(shí)，發(fā)酵36 h，木糖醇的濃度小于0.5 g/L，隨著酚酮類物質(zhì)濃度的增加，木糖醇濃度也隨之增加，當(dāng)酚酮類物質(zhì)的濃度為1.50 g/L時(shí)，添加4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮的木糖醇濃度分別為2.03、1.99和0.94 g/L，木糖醇的積累說明在含有抑制物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，木糖代謝過程中的木糖醇脫氫酶的輔酶NADH積累，抑制了木糖醇脫氫酶的活力，使得木糖醇不能生成木酮糖，由此導(dǎo)致木糖醇的積累[12]。同時(shí)，不同分子量的酚酮類對(duì)生成樹干畢赤酵母的發(fā)酵副產(chǎn)物的影響也不同，其中4-羥基苯乙酮影響最大，這也與4-羥基苯乙酮對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵抑制作用最強(qiáng)的情況相一致，說明4-羥基苯乙酮對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵代謝途徑抑制作用最為明顯。研究表明酚類物質(zhì)和芳香族化合物抑制細(xì)胞的生長和代謝產(chǎn)物可能與具體的官能團(tuán)有關(guān)[19]，其中低分子量酚類化合物毒性更強(qiáng)[18]，取代基的位置 (鄰位、間位、對(duì)位) 對(duì)酚類毒性的強(qiáng)弱也有影響，根據(jù)這3種酚酮類物質(zhì)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響及其結(jié)構(gòu)可以看出，隨著甲氧基數(shù)目的增加，其抑制作用逐漸降低。但是并未闡明其毒性機(jī)制，一種可能的機(jī)制是酚類通過影響微生物的功能和蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比值干擾了細(xì)胞膜[20]。

圖2　添加酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵過程中參數(shù)的變化Fig. 2 Changes in the parameters during the fermentation of phenolic ketones artificially added to the xylose medium by P. stipitis NLP31. (A) 4-hydroxyacetophenone. (B) 4-hydroxy-3-methoxy-acetophenone. (C) 4-hydroxy-3,5-dimethoxy-acetophenone.

2.3酚酮類對(duì)樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸組成的影響

外界環(huán)境發(fā)生變化，微生物細(xì)胞膜首先受到?jīng)_擊，因此可以推測(cè)，細(xì)胞對(duì)抑制物的反應(yīng)可通過測(cè)定膜性質(zhì)的變化而得知。磷脂是細(xì)胞膜的重要組成部分，磷脂中脂肪酸的變化會(huì)影響到膜的流動(dòng)性。而目前對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸的測(cè)定尚無統(tǒng)一方法，因此，可以通過測(cè)定細(xì)胞總脂肪酸來間接反映細(xì)胞膜磷脂中脂肪酸的變化，而細(xì)胞膜中脂肪酸組成的變化是細(xì)胞適應(yīng)外部環(huán)境的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制作用[21]。細(xì)胞可以通過脂肪酸組成的變化來改變膜的一些特性以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，如不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例可以間接反映細(xì)胞膜的流動(dòng)性。飽和脂肪酸緊密有序地排列，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性減??；不飽和脂肪酸由于不飽和鍵的存在，使分子鍵排列疏松而無序，從而會(huì)使膜的流動(dòng)性增加。

實(shí)驗(yàn)以45 g/L木糖為發(fā)酵底物，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1.50 g/L的4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮，樹干畢赤酵母發(fā)酵72 h時(shí)取樣，收集酵母提取脂肪酸并甲酯化后采用GC/MS分別測(cè)定添加抑制物發(fā)酵前后樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸的含量，總離子圖經(jīng)數(shù)據(jù)處理后按峰面積歸一化法計(jì)算出各脂肪酸的相對(duì)百分含量，表2為樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸的組成及相對(duì)含量。

表2　樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸的組成及相對(duì)含量Table 2 The composition and relative content of fatty acid from P. stipitis NLP31 cell

采用GC/MS對(duì)未添加酚酮類物質(zhì)的對(duì)照組和分別添加4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮的樹干畢赤酵母的脂質(zhì)成分分析。將得到的結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)化學(xué)工作站分析檢索其中的脂肪酸成分，得到樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸主要含有辛酸 (C8:0)、肉豆蔻酸 (C14:0)、棕櫚酸 (C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)、硬脂酸 (C18:0)、油酸 (C18:1) 和亞油酸 (C18:2)。其中飽和脂肪酸4種，單不飽和脂肪酸有2種，多不飽和脂肪酸有1種。不飽和脂肪酸主要有櫚油酸 (16:1) 和油酸 (18:1)，飽和脂肪酸主要為棕櫚酸 (16:0) 以及少量的硬脂酸 (18:0)。由表2可以看出，發(fā)酵液中不添加酚酮類物質(zhì)的樹干畢赤酵母細(xì)胞中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例為2.58，發(fā)酵液中添加酚酮類物質(zhì)的樹干畢赤酵母細(xì)胞中的不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例分別上升到3.03、3.06和3.61。影響細(xì)胞膜流動(dòng)性的因素主要有脂肪酸碳鏈的長度及飽和程度、膽固醇含量、溫度、酸堿度及離子強(qiáng)度等。添加酚酮類發(fā)酵后酵母細(xì)胞不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例從原來的2.58上升到3.61，樹干畢赤酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性隨之上升，不穩(wěn)定性提高。由于樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量較高，使膜磷脂的不飽和度增加，很容易發(fā)生過氧化，從而影響酵母生長和乙醇發(fā)酵能力[12]。

3　結(jié)論

植物纖維素原料生物煉制燃料乙醇的過程中，第一步原料預(yù)處理產(chǎn)生了一些對(duì)酵母乙醇發(fā)酵有抑制作用的物質(zhì)，其中對(duì)弱酸類、糠醛類以及酚類中的酚醛和酚酸類的研究較多，而對(duì)酚酮類物質(zhì)抑制樹干畢赤酵母乙醇發(fā)酵的影響尚未見報(bào)道，同時(shí)輔以研究細(xì)胞脂肪酸含量的變化，進(jìn)一步表征抑制物存在條件下對(duì)酵母乙醇發(fā)酵的影響。

通過研究3種酚酮類 (4-羥基苯乙酮、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、4-羥基-3,5-二甲氧基苯乙酮) 對(duì)樹干畢赤酵母木糖發(fā)酵的影響結(jié)果表明，添加酚酮類物質(zhì)延長了發(fā)酵時(shí)間，抑制了細(xì)胞的生長，增加了發(fā)酵副產(chǎn)物木糖醇的生成；隨著酚酮類濃度的增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)酚酮類物質(zhì)大于1.00 g/L時(shí)，抑制作用較為明顯。通過比較添加濃度為1.50 g/L酚酮類物質(zhì)對(duì)樹干畢赤酵母細(xì)胞脂肪酸組成的影響，研究表明酚酮類物質(zhì)提高了細(xì)胞中不飽和脂肪酸的比例，添加3種酚酮類物質(zhì)后酵母細(xì)胞中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例從原來的2.58分別上升到3.03、3.06和3.61，樹干畢赤酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性隨之上升，不穩(wěn)定性提高，從而影響酵母生長以及酵母乙醇發(fā)酵能力。

因此，通過本文的研究結(jié)果表明，酚酮類物質(zhì)對(duì)乙醇發(fā)酵有一定的影響?？梢酝ㄟ^以下途徑來降低其抑制作用：1) 在原料預(yù)處理過程中，通過選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法來減少抑制物的產(chǎn)生；2) 對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的酚酮類物質(zhì)如何通過適當(dāng)?shù)姆椒ń档推湟种谱饔茫绮捎妹摱镜姆椒ń档推鋵?duì)微生物的抑制作用，或者通過菌株馴化和篩選、誘變等方法提高微生物對(duì)抑制物的耐受能力。此外通過本文的研究，可以為進(jìn)一步研究抑制物對(duì)乙醇發(fā)酵的影響機(jī)理、提高微生物乙醇發(fā)酵能力以及加快燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)、降低生產(chǎn)成本具有十分重要的指導(dǎo)意義。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

Effect of phenolic ketones on ethanol fermentation and cellular lipid composition of Pichia stipitis

Jinlong Yang1*, Yichao Cheng1*, Yuanyuan Zhu1, Junjun Zhu1,2, Tingting Chen1, Yong Xu1,2, Qiang Yong1, and Shiyuan Yu1,2
1 College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China
2 Jiangsu Key Laboratory of Biomass-based Green Fuel and Chemicals, Nanjing 210037, Jiangsu, China

Abstract:Lignin degradation products are toxic to microorganisms, which is one of the bottlenecks for fuel ethanol production. We studied the effects of phenolic ketones (4-hydroxyacetophenone, 4-hydroxy-3-methoxy-acetophenone and 4-hydroxy-3,5-dimethoxy-acetophenone) derived from lignin degradation on ethanol fermentation of xylose and cellular lipid composition of Pichia stipitis NLP31. Ethanol and the cellular fatty acid of yeast were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Results indicate that phenolic ketones negatively affected ethanol fermentation of yeast and the lower molecular weight phenolic ketone compound was more toxic. When the concentration of 4-hydroxyacetophenone was 1.5 g/L, at fermentation of 24 h, the xylose utilization ratio, ethanol yield and ethanol concentration decreased by 42.47%, 5.30% and 9.76 g/L, respectively, compared to the control. When phenolic ketones were in the medium, the ratio of unsaturated fatty acids to saturated fatty acids (UFA/SFA) of yeast cells was improved. When 1.5 g/L of three aforementioned phenolic ketones was added to the fermentation medium, the UFA/SFA ratio of yeast cells increased to 3.03, 3.06 and 3.61, respectively, compared to 2.58 of the control, which increased cell membrane fluidity and instability. Therefore, phenolic ketones can reduce the yeast growth, increase the UFA/SFA ratio of yeast and lower ethanol productivity. Effectively reduce or remove the content of lignin degradation products is the key to improve lignocellulose biorefinery.

Keywords:phenolic ketones, Pichia stipitis, ethanol fermentation, lipid composition

Corresponding author:Junjun Zhu. Tel/Fax: +86-25-85427587; E-mail: zhujj@njfu.edu.cn*These authors contributed equally to this study.