猴腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇對基質(zhì)金屬蛋白酶9及轉(zhuǎn)化生長因子β1表達水平的影響*

應(yīng)建有徐蔚

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猴腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇對基質(zhì)金屬蛋白酶9及轉(zhuǎn)化生長因子β1表達水平的影響*

應(yīng)建有①徐蔚②

【摘要】目的：觀察猴腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇對基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）表達的變化影響，探討超深低溫相關(guān)腦保護機制。方法：選擇9只成年雄性健康恒河猴作為研究對象，隨機分為常溫組2只與超深低溫組7只，分別建立等溫及超深低溫斷血流復(fù)蘇實驗?zāi)Ｐ?，分別對大腦皮質(zhì)腦組織切片用MMP-9、TGF-β1抗體進行免疫組化染色、圖像分析，對每張切片的平均灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較兩組MMP-9、TGF-β1含量和平均灰度值的情況。結(jié)果：超深低溫組神經(jīng)細胞MMP-9表達下調(diào)，而TGF-β1表達增高。結(jié)論：超深低溫能抑制MMP-9的表達，增加TGF-β1的表達，促進受損腦細胞的損傷修復(fù)，提高了腦細胞對缺血缺氧損害的耐受性，抑制細胞的凋亡，是缺血缺氧情況下腦重要的內(nèi)源性保護機制之一。

【關(guān)鍵詞】猴腦； 超深低溫； 基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）； 轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）

①河南省漯河市中心醫(yī)院 河南 漯河 462000

②昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

First-author’s address：Central Hospital of Luohe City，Luohe 462000，China

低溫對缺血性腦損傷有保護作用由Aleen于1939年最先報道，此后國內(nèi)外學(xué)者對低溫，尤其是亞低溫（32～35 ℃）從細胞因子、遞質(zhì)、受體、蛋白質(zhì)、酶、離子通道及基因表達等方面進行了相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究［1］，但對超深低溫腦保護的作用機制的研究尚在進一步探索中?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的細胞因子［2-3］，它們參與腦缺血缺氧過程中的損傷修復(fù)，其在超深低溫條件下的腦保護作用的研究目前尚沒有明確的報道。本研究通過檢測猴大腦皮質(zhì)中MMP-9與TGF-β1在常溫與選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇后的表達的水平變化程度，探索腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇對MMP-9 及TGF-β1表達的影響，將有助于研究其在腦的不同低溫腦保護技術(shù)中的作用變化，旨在為MMP-9抑制劑及TGF-β1的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物 選取9只成年雄性健康恒河猴（中國科學(xué)院昆明動物研究所提供）作為研究對象，平均體重（9.1±2.5） kg，年齡4～10歲，隨機分為常溫組2只與超深低溫組7只。

1.2實驗儀器與藥物 包埋機（Histocentre Shandon，英國），脫水機（Pathcentre Shandon，英國） ，漂片機 （3120058 Section Bath Shandon，英國），切片機（HM-325，德國Microm），烤片機（3120061 Hotplate Shandon，英國），二抗顯色系統(tǒng)（EnvisionTM System，丹麥DAKO公司），MMP-9、TGF-β1多克隆抗體（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），高清晰彩色病理圖文報告分析系統(tǒng) （同濟醫(yī)科大學(xué)千屏影像公司，HPIAS-1000），光學(xué)顯微照相裝置（TK-C 1381EG，日本）。

1.3實驗方法

1.3.1建立猴腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇實驗?zāi)Ｐ?超深低溫組通過建立腦局部體外循環(huán)，腦缺血10 min后經(jīng)降溫系統(tǒng)輸入4.0 ℃林格液維持腦溫于14.3～16 ℃ 60 min，使腦及中心體溫恢復(fù)正常，恢復(fù)猴自然狀態(tài)。常溫組輸入38.0 ℃林格液，腦溫不被降低，其余均同超深低溫組模型［4］。

1.3.2標(biāo)本的取材與固定 常溫組實驗猴于灌注死亡后直接取額葉腦組織以4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋。低溫組實驗猴飼養(yǎng)到術(shù)后12周后麻醉開胸處死，開顱手術(shù)取出全腦組織，取額葉腦組織以4%多聚甲醛固定。

1.3.3免疫組化染色 蠟塊經(jīng)切片（切片5 μm，90 ℃烤2 h）、脫蠟（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min）、水化（70%酒精、95%酒精及無水酒精各1～2 min，蒸餾水洗3 min）、磷酸鹽緩沖液漂洗（3 min/次，漂洗3次）、抗原修復(fù)、切片。免疫組化染色按實驗說明操作：（1）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性（阻斷劑一滴加于濕盒，放置常溫10 min）；（2）PBS沖洗3次，3 min/次；（3）擦干標(biāo)本周圍PBS液，加一滴第一抗體于濕盒，放置于4 ℃過夜；（4）PBS沖洗3次，5 min/次；（5）擦干標(biāo)本周圍PBS液，加一滴聚合物增強劑于濕盒，放置于室溫20 min；（6）PBS沖洗3次，3 min/次；（7）清除PBS液，加酶標(biāo)抗鼠聚合物一滴，放置于室溫30 min；（8）PBS沖洗3次，3 min/次；（9）擦干標(biāo)本周圍PBS液，加新鮮配制的DAB顯色液，于顯微鏡下調(diào)控顯色程度，在3～5 min后陽性染色顯著、且背景尚未染色前，放置于蒸餾水中終止顯色，并用水沖洗，再經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水、透明及樹膠封片后備用。

1.4結(jié)果判斷 MMP-9由包括巨噬細胞、中性粒細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及正常細胞在內(nèi)的多種細胞合成分泌并表達相應(yīng)的受體，TGF-β1亦由幾乎所有類型的細胞合成分泌，免疫組化染色陽性反應(yīng)為黃色-棕黃色顆粒。應(yīng)用Clour Video Camera和Nikon顯微鏡對每張切片采集10個視野圖像（兩人雙盲法，光鏡400倍視野），用高清晰彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)檢測陽性細胞灰度值（灰度值與染色陽性強度、含量呈反比），取灰度平均值反映MMP-9 及TGF-β1在額葉皮質(zhì)中的相對含量［5］。平均灰度值表示圖像分析中的透光率，若灰度值低，則透光率低，圖像染色強，則表明MMP-9及TGF-β1在細胞中的含量高，反之則含量低。

2　結(jié)果

常溫組實驗猴灌注后立即死亡，超深低溫組實驗猴安全復(fù)蘇并長期存活，未發(fā)現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺失。取9只實驗猴額葉標(biāo)本，經(jīng)免疫組化、圖像分析得到平均灰度值（圖1～4），超深低溫組MMP-9水平較常溫組低，而TGF-β1水平較常溫組高，見表1。

3　討論

人腦是控制運動、感覺、生物節(jié)律等一切生命活動的中樞，是全身代謝率最高的器官，重量僅占全身體重的2%，卻接受心輸出量15%的血液，消耗全身20%的氧量。在腦組織對缺血缺氧耐受時間窗和程度方面，腦組織的耐受性最差，腦組織缺血缺氧4～5 min后，所有需能生化反應(yīng)將全部停止，從而造成嚴(yán)重的不可逆的神經(jīng)損害，因此對缺血缺氧后腦保護的研究具有重要的研究價值。

目前研究發(fā)現(xiàn)低溫具有確切的腦保護作用，并已得到世界的公認。低溫引起腦代謝和腦耗氧量的降低，腦組織易于維持和改善氧供需平衡，緩解腦缺血后Na+-K+-ATP酶活性下降、穩(wěn)定細胞膜和血腦屏障，并減少或抑制多種興奮性遞質(zhì)和氧自由基的合成與釋放，提供了良好的腦保護功能［6］。目前醫(yī)學(xué)界將低溫分為輕度低溫（33～35 ℃）、中度低溫（28～32 ℃）、深低溫（17～27 ℃）、超深低溫（2～16 ℃），1993年江基堯?qū)?8～35 ℃輕中度低溫命名為亞低溫并被廣泛接受，亞低溫腦保護在臨床神經(jīng)外科廣泛應(yīng)用于重型顱腦損傷的救治［7-8］。深低溫腦保護在上世紀(jì)50年代開始得到應(yīng)用，到20世紀(jì)60年代初，腦溫在降至12～18 ℃超深低溫下，阻斷腦部血流60 min并復(fù)蘇成功，未遺留明顯神經(jīng)功能障礙，但因深低溫所致的較嚴(yán)重的全身并發(fā)癥，目前這一技術(shù)尚未推廣應(yīng)用于臨床［9］。隨著腦保護液、灌注方法及凝血機制等方面的研究不斷進展，深低溫腦保護機制獲得了越來越多的實驗依據(jù)［10］，深低溫技術(shù)日趨完善。腦缺血是臨床常見的病理過程，腦缺血所引起的神經(jīng)損傷機制較為復(fù)雜，可能涉及多種因素，包括：腦缺血后微循環(huán)損害、能量障礙、自由基生成、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、細胞酸中毒、細胞骨架的降解、凋亡基因激活及膠質(zhì)細胞的反應(yīng)等［11］。2002年徐蔚等［4］首次采用恒河猴成功建立了選擇性腦深低溫斷血流復(fù)蘇模型，腦溫最低降至12.8 ℃，阻斷腦血流60～80 min后復(fù)蘇成功，未造成明顯神經(jīng)功能障礙，心、肺、腎等重要臟器功能未受損害，腦細胞超微結(jié)構(gòu)亦未見明顯異常。該研究表明選擇性深低溫可顯著提高猴腦對缺血缺氧損害的耐受性，如在人類行類似操作亦可能獲得相似的結(jié)果。腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇技術(shù)在不降低中心體溫情況下，僅選擇性降低腦部溫度，最大限度的延長了腦細胞對缺血缺氧耐受的安全時限，避免了全身深低溫所造成的嚴(yán)重并發(fā)癥，為復(fù)雜中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的臨床救治提供了廣闊的應(yīng)用前景。

表1　兩組MMP-9、TGF-β1平均灰度值水平比較（±s）

表1　兩組MMP-9、TGF-β1平均灰度值水平比較（±s）

組別　MMP-9　TGF-β1常溫組（n=2）　113.7±1.9　128.1±7.2超深低溫組（n=7）　127.3±5.4　117.5±4.5

圖1　常溫組MMP-9表達（×400）

圖2　超深低溫組MMP-9表達（×400）

圖3　常溫組TGF-β1表達（×400）

圖4　超深低溫組TGF-β1表達（×400）

文獻［12］發(fā)現(xiàn)，腦缺血缺氧早期即出現(xiàn)MMP-9表達的升高，MMP-9參與一系列病理過程如血腦屏障破壞、無菌性炎性反應(yīng)、微血管通透性增加、腦水腫形成等，加重腦損害的程度，應(yīng)用合成的MMP-9抑制劑可在一定程度上阻止上述病理改變的發(fā)生。在本研究中，常溫組2只實驗猴于灌注后直接死亡，神經(jīng)細胞大量壞死，MMP-9呈高水平表達，平均灰度為（113.7±1.9），超深低溫組中MMP-9表達下調(diào)，平均灰度（127.3±5.4），與等溫組比較有差異，表明腦缺血過程中MMP-9高水平表達，神經(jīng)細胞難以生存，并且腦選擇性超深低溫可以抑制MMP-9及其受體的表達和激活，避免了MMP-9的過量表達對神經(jīng)細胞的損害。腦組織在正常狀態(tài)下可表達一定量的MMPs，激活后的MMPs參與正常的生理活動，通過降解細胞外基質(zhì)而促進血管生成和創(chuàng)傷愈合，但在腦缺血病理狀態(tài)下，MMPs過度表達起到病理損傷效應(yīng)，激活后的MMPs可降解細胞外基質(zhì)，并中斷細胞與細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系和相互作用，造成神經(jīng)細胞的損傷與死亡［13］。本實驗中低溫組中有少量MMP-9表達，也表明MMP-9參與并維持著腦組織正常的生理活動。

TGF-β1是一種普遍存在的細胞因子，對多種細胞具有廣泛的生物學(xué)作用，其中包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，它參與細胞生長、分化、組織修復(fù)、炎癥、抗氧化及抗凋亡等多種生物過程，提高神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞的存活與生長，在病理狀態(tài)下使更多的神經(jīng)細胞得以生存，體內(nèi)外實驗均已證實了TGF-β1的神經(jīng)保護作用［14-15］。本實驗結(jié)果表明，常溫組猴腦皮質(zhì)免疫組織化學(xué)染色顯示TGF-β1呈低水平表達，平均灰度（128.1±7.2），低溫組中TGF-β1表達較常溫組明顯增加，表明選擇性超深低溫可較長時間上調(diào)TGF-β1及其受體的表達，可能參與了腦缺血缺氧損傷的修復(fù)。腦選擇性超深低溫斷血流以及此后再灌注過程中，缺血缺氧的存在將對腦血管及神經(jīng)細胞造成一定的損傷。有研究表明，TGF-β1作為重要的血管生成調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)血管增生，對血管損傷具有明顯的修復(fù)作用［16］。急性腦缺血缺氧后，損傷周圍腦組織的微血管內(nèi)皮細胞、蛛網(wǎng)膜中的TGF-β1 mRNA表達增加。本實驗中低溫組TGF-β1呈持續(xù)高水平表達可以認為與血管、神經(jīng)細胞及軸突再生修復(fù)有關(guān)。研究證明TGF-β1的表達有兩種模式，即早期的普遍表達和后期的損傷相關(guān)的表達。本研究也提示選擇性超深低溫斷血流后機體通過上調(diào)TGF-β1的表達，降低腦代謝率，提高腦缺血缺氧耐受性，并通過TGF-β1的持續(xù)高表達參與細胞的生長分化與組織修復(fù)過程，減輕或避免了腦細胞的缺血缺氧性損傷。

綜上所述，猴腦選擇性超深低溫斷血流復(fù)蘇技術(shù)通過多種機制抑制了MMP-9的過量表達，同時誘導(dǎo)了TGF-β1的高表達，抑制神經(jīng)細胞的凋亡，減輕神經(jīng)功能障礙，有助于神經(jīng)細胞的生存，是選擇性超深低溫狀態(tài)下機體對缺血缺氧性腦損害的內(nèi)源性代償機制，具有明確的腦保護作用，但超深低溫對兩者相互作用的機制有待進一步的研究。

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Effects of Blood Flow Occlusion after Resuscitation Using Selective Cerebral Ultra-profound Hypothermia on the Expression Matrix Metalloproteinases-9 and Transforming Growth Factor-β1 for Monkey

YING Jian-you，XU Wei.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：020-023

【Abstract】Objective：To explore the effects of blood flow occlusion after resuscitation using selective cerebral ultra-profound hypothermia on the expression matrix metalloproteinases-9 and transforming growth factor-β1 for monkey and to investigate the mechanism of brain protection related to ultra deep hypothermia.Method：9 adult male healthy Ganges River monkeys were selected as the research subjects，randomly divided into the normal temperature group of two and the ultra deep low temperature group of seven，the isothermal and ultra deep hypothermic circulatory arrest recovery experimental model were established，and mmunohistochemical staining and image analysis were used to analyze the average gray value of each slice of brain cortex brain tissue sections with MMP-9 and TGF-β1 antibody，the MMP-9，TGF-β1 and the average gray value of the situation in two groups were compared.Result：The expression of MMP-9 was down regulated，while the expression of TGF-β1 was increased in the ultra deep hypothermia group.Conclusion：Selective ultra-profound hypothermia can attenuate MMP-9 expression and promote TGF-β1 expression which inhibit apoptosis，improve the tolerance of nerve cells to ischemia and hypoxia and promote the restoration of damaged nerve cells，it is one of the important endogenous protective mechanisms of cerebral ischemia and hypoxia.

【Key words】Monkey brain； Ultraprofound hypothermia； Matrix metalloproteinases-9（MMP-9）；Transforming growth factor-β1（TGF-β1）

*基金項目：教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目（02141）；云南省自然科學(xué)基金（2003C0010Z）

通信作者：應(yīng)建有

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.006

收稿日期：（2015-11-16） （本文編輯：李穎）