取精后至冷凍前的間隔時間對精子冷凍復(fù)蘇效果的影響*

陳碧張維馬天仲荊霞張云山彭彩玲

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取精后至冷凍前的間隔時間對精子冷凍復(fù)蘇效果的影響*

陳碧①張維①馬天仲①荊霞①張云山①彭彩玲①

【摘要】目的：探討取精后至冷凍前的間隔時間對精子冷凍復(fù)蘇率的影響，規(guī)范精液標本冷凍技術(shù)操作，進一步提高凍存標本的復(fù)蘇率。方法：選取2015年3月在門診行精液分析的30例參數(shù)正常精液標本，同一例精液一式3份，分別在精液取出后15、30 min及60 min后行精液凍存，即按所有樣本按孵育時間的不同分為A（15 min）、B（30 min）、C（60 min）三組，每組30例。分析三組標本冷凍前后前向運動（PR）精子數(shù)、存活率及精子畸形率，比較各組精子的冷凍復(fù)蘇率。結(jié)果：A組的PR精子冷凍復(fù)蘇率（55.35±13.94）%及B組的（51.55±15.94）%均高于C組的（38.13±14.24）%，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而A組與B組PR精子冷凍復(fù)蘇率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但A組略高。三組精子存活率及正常形態(tài)精子百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：精子取出后應(yīng)盡快完成冷凍，有助于提高精子冷凍復(fù)蘇效果。

【關(guān)鍵詞】精子； 低溫保存； 精子參數(shù)； 精子冷凍復(fù)蘇率

①廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣東 湛江 524001

First-author’s address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China

精子冷凍技術(shù)的發(fā)展，使患者因各種因素需要冷凍自身精子用于后續(xù)輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technology，ART）治療成為可能，如取精困難、梗阻性無精癥患者在門診穿刺檢查時獲得的精子、隱匿精子癥等患者要求冷凍的自身精子。自精凍存成為生殖中心實驗室常規(guī)實施的技術(shù)。近年來，精子冷凍技術(shù)得到了快速發(fā)展，常用的方法包括程序降溫法與快速冷凍法［1-2］，在臨床應(yīng)用時仍需進一步完善。對臨床實驗室而言，需要在保證最大限度冷凍精子質(zhì)量的同時，力求實驗方法快速、簡便、有效。研究表明，液氮一步熏蒸法可顯著提高凍存精子的質(zhì)量［3］。世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）指出，室溫下正常精液標本大都在15 min內(nèi)完全液化，很少超過60 min［4］。因而推薦精液液化后應(yīng)立即進行分析，最好在30 min內(nèi)完成，不要超過1 h。而取精后至冷凍前的間隔時間沒有明確的規(guī)定，不同的生殖中心時間不同。目前未見相關(guān)文獻報道。此次研究旨在通過探索精液取出后至冷凍前的時間對精子冷凍復(fù)蘇率的影響，優(yōu)化一步熏蒸法，以規(guī)范精液標本冷凍技術(shù)操作，進一步提高凍存標本的復(fù)蘇率。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取于2015年3月在本院行精液分析患者的30例精液標本，患者年齡25～35歲（平均31歲），禁欲2～7 d，手淫法取精。精液量2～5 mL，15 min內(nèi)均完全液化。同一例精液一式3份，分別在精液取出后15、30 min及60 min后行精液凍存，即按所有樣本按孵育時間的不同分為A（15 min）、B（30 min）、C（60 min）三組，每組30例，每例標本精液量為0.5 mL。冷凍前精子濃度均≥15×106/mL，前向運動（progressive motility，PR）精子≥32%，正常形態(tài)精子≥4%。

1.2試劑與儀器 冷凍保護劑使用Quinn’s Advantage TM Sperm Freezing Medium，液氮罐為MVE XC47/11-10型，標本在液氮蒸氣中直接熏蒸降溫。精子冷凍儲存容器選用 Greiner bio-one 生產(chǎn)的1 mL低溫凍存管（REF:123278）。

1.3方法

1.3.1精子冷凍 對精液按不同時間進行凍存，逐滴把一份精子冷凍培養(yǎng)基（Quinn’s Advantage TM Sperm Freezing Medium）加進一份液化好的精液樣本。每加一滴培養(yǎng)基時要不斷混合以確保精子細胞與冷凍培養(yǎng)基能徹底平衡。混合后室溫平衡10 min。將冷凍管平放在離液氮面10～20 cm高度20～30 min，把冷凍管放在鋁架上，然后移至液氮罐保存。

1.3.2精子解凍 從液氮罐取出冷凍管，立即置于35 ℃水浴直至完全溶解。把解凍后的精子溶液倒進試管，緩慢一滴一滴地在30 s內(nèi)把3份精子沖洗培養(yǎng)基與精子溶液徹底混合以確保精子冷凍培養(yǎng)基已被稀釋。300 g離心10 min，棄去上清，加入精子沖洗培養(yǎng)基定容至0.5 mL，重懸精子后進行精液分析，主要檢測PR精子。

1.4觀察指標及評價方法 按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版進行精液常規(guī)分析及精子形態(tài)學(xué)分析，主要包括精液量、精子濃度、PR精子百分率、正常形態(tài)精子百分率及存活率等。同時比較精子冷凍復(fù)蘇率。

1.4.1精子存活率（vitality assessment of human sperm，VA） 精液標本20μL與5 g/L的伊紅Y溶液1:1混勻，并覆蓋蓋玻片，30 s后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。必須立即觀察這些玻片，活精子不著色（白色）；死細胞被染成紅色。計算精子存活率。重復(fù)計數(shù)2次，兩次結(jié)果應(yīng)滿足95%的可信區(qū)間檢驗，報告結(jié)果取平均值。

1.4.2正常形態(tài)精子百分率 精液標本涂片，使用改良巴氏法染色，油鏡下觀察，計數(shù)200個精子中正常形態(tài)精子所占比例，重復(fù)計數(shù)2次，兩次結(jié)果應(yīng)滿足95%的可信區(qū)間檢驗，結(jié)果取平均值。

1.4.3精子冷凍復(fù)蘇率 精子冷凍復(fù)蘇率=凍后PR精子百分率/凍前PR精子百分率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用（±s）表示，組間均數(shù)比較用Friedman秩和檢驗，兩兩比較用Wilcoxon法，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1冷凍前各組PR精子百分率、存活率及正常形態(tài)精子百分率的比較 A組、B組及C組PR精子百分率隨著時間的延長逐步降低，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組及C組存活率略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組正常形態(tài)精子百分率較接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　冷凍前各組PR精子百分率、存活率及正常形態(tài)精子百分率的比較（±s） %

表1　冷凍前各組PR精子百分率、存活率及正常形態(tài)精子百分率的比較（±s） %

組別　PR精子百分率　精子存活率　正常形態(tài)精子百分率A組（n=30）　46.22±14.16　 89.15±9.31　 8.0±5.5 B組（n=30）　43.32±13.53　 86.62±10.16　 7.5±5.0 C組（n=30）　38.47±12.71　 85.93±10.34　 8.0±5.5

2.2復(fù)蘇后各組PR精子百分率、冷凍復(fù)蘇率、存活率及正常形態(tài)精子百分率的比較 A組與B組復(fù)蘇后PR精子百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而A組與C組、B組與C組復(fù)蘇后PR精子百分率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A組PR精子復(fù)蘇率略高于B組，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而A組與B組PR精子復(fù)蘇率均高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組精子存活率及正常形態(tài)精子百分率之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3　討論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，給越來越多的不孕癥患者帶來福音。不孕癥夫婦中大約30%是男方因素導(dǎo)致不育而就診的，卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)是治療男性不育的有效方法［5］。張丹等［6］對比射出精液、經(jīng)皮附睪穿刺和經(jīng)皮睪丸穿刺取精子、供精行ICSI助孕的結(jié)局，認為不同來源的精子對受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及最終妊娠結(jié)局沒有影響。精子的成熟度、精子的冷凍可能并不影響最終的妊娠率。

表2　復(fù)蘇后各組PR精子百分率、冷凍復(fù)蘇率、存活率及正常形態(tài)精子百分率的比較 %

目前對小鼠冷凍精子的胚胎發(fā)育和表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮精子組相比，冷凍精子的胚胎的表觀遺傳重組動態(tài)進程并沒有改變［7］。目前精子冷凍方法主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍，兩種冷凍方法之間精子活動率下降及DNA損傷無顯著差異［8］。在國內(nèi)一些人類精子庫已開展腫瘤患者的精液凍存［9］，拓寬了不孕不育的治療范圍，給越來越多不孕癥患者帶來福音。

作為輔助生殖技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)，精子凍存技術(shù)的完善對于保存男性生育力尤為重要。不同的精液標本、精子本身質(zhì)量、冷凍保護劑、冷凍方法及解凍方法對精子冷凍保存后的活力影響較大。在精子冷凍過程中，低溫損傷也同時影響了精子的活力、形態(tài)、精子DNA完整性及線粒體的功能等［10-13］，多種因素均可能影響精子冷凍復(fù)蘇率。目前關(guān)于精子活力與冷凍復(fù)蘇率之間的關(guān)系仍存在較大的爭議，Keel等［14］研究認為精子冷凍前的活力與冷凍后精子活力呈正相關(guān)，Chan等［15］認為，用冷凍前精子活力來預(yù)測冷凍復(fù)蘇率的價值是有限的。

杜金龍等［16］認為精子活力也受年齡、禁欲時間、季節(jié)、生理因素等諸多因素的影響。精子常規(guī)檢查應(yīng)標準化。精液標本取出后隨著放置時間的延長，精子活動率逐漸下降，這可能與脫水、pH值改變、滲透壓變化、溫度變化等因素相關(guān)。世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）指出，室溫下正常精液標本大都在15 min內(nèi)完全液化，很少超過60 min。因而推薦精液液化后應(yīng)立即進行分析，最好在30 min內(nèi)完成，不要超過1 h。而取精后至冷凍前的間隔時間沒有明確的規(guī)定，不同的生殖中心時間不同。目前未見相關(guān)文獻報道。此次研究旨在通過探索精液取出后至冷凍前的時間對精子冷凍復(fù)蘇率的影響，進一步提高凍存標本的復(fù)蘇率。結(jié)果顯示，取精后A組前向運動（PR）精子冷凍復(fù)蘇率略高于B組，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而A組與B組均高于C組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明取精后應(yīng)在30 min內(nèi)進行冷凍操作，精子離體后超過30 min行冷凍將顯著降低精子冷凍復(fù)蘇率。

精液從附睪中射出含有大量的死精子及精子以外的細胞成分，而離體細胞的脂類分解產(chǎn)物，能夠從細胞溢出，攜帶自由基，損傷其他細胞并包括精子［17］。精子質(zhì)膜的損傷使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可能從細胞逸出，進而擴大了脂質(zhì)過氧化作用的范圍，加重了精子氧化損傷程度。

精子的長時間孵育會導(dǎo)致精液中ROS的過量生成，不但破壞精子膜的流動性和完整性，還可導(dǎo)致DNA單鏈形成或雙鏈DNA斷裂等，并且ROS也可單獨誘導(dǎo)DNA損傷。徐鴻毅等［18］認為精子過長時間的孵育可影響IVF妊娠結(jié)局，可能由于長時間的孵育產(chǎn)生的有害物質(zhì)影響了胚胎的潛在發(fā)育。精子DNA完整性與人工授精妊娠結(jié)局密切相關(guān)，DNA完整性越好，精子質(zhì)量越好，妊娠率越高。

雖然本研究的結(jié)果顯示A組與B組PR精子復(fù)蘇率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，A組略高于B組，但為避免精子過長時間的孵育可能對胚胎的潛在發(fā)育產(chǎn)生影響，取得更好的臨床結(jié)局，精子取出后應(yīng)盡可能在15 min內(nèi)進行冷凍操作。

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The Effect of the Pre-freezing Incubation Time on the Cryosurvival of Human Sperm

CHEN Bi，ZHANG Wei，MA Tian-zhong，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：001-004

【Abstract】Objective：To investigate the effect of the time of sperm incubation pre-freezing on the cryosurvival of human sperm and to optimize the protocol of direct fumigation for the freeze-thawing of human sperm.Method：Thirty semen samples from healthy donors in March 2015 were collected as the objects，which were divided into three groups according to the difference of the incubation time pre-freezing at room temperature before the cryopreservation：15 minutes group（group A），30 minutes group（group B） and 60 minutes group（group C）.The sperm motility parameters，sperm vitality and survival rate of the semen samples before freezing and postthawed were detected by computer-assisted semen analysis.Result：The survival rate of progressive sperm motility was（55.35±13.94）% in group A and （51.55±15.94）% in group B，which were remarkably higher than （38.13±14.24）% in group C，the differences were statistically significant（P＜0.05），there was no significant difference between the group A and the group B（P＞0.05），but the group A was higher.There were no significant differences in sperm vitality among the three groups（P＞0.05）.Conclusion：The short time incubation of sperm pre-freezing can evidently improve the progressive motility of post-thaw sperm.

【Key words】Sperm； Cryopreservation； Sperm parameter； Survival rate of post-thaw sperm

*基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81300484）；廣東醫(yī)學(xué)院博士啟動基金（B2012027）；湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目（2013A1006）

通信作者：馬天仲

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.001

收稿日期：（2015-12-08） （本文編輯：劉蕾）