鴨疫里默菌的分離與鑒定

王名行，張大丙（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100193）

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鴨疫里默菌的分離與鑒定

王名行，張大丙
（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100193）

鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染是危害肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要細(xì)菌性疾病，以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征性病變。其病原為RA，由Riemer等于1904年首次從病鵝中分離到［1-2］。1982年，郭玉璞等確定我國(guó)存在該病的發(fā)生和流行［3］。

RA為革蘭陰性、不運(yùn)動(dòng)且不形成芽孢的桿菌，分類(lèi)上屬黃桿菌科里默菌屬［1-2］。該菌含21個(gè)血清型［4］，各血清型之間缺乏交叉保護(hù)。在我國(guó)鴨群中，RA血清型呈多樣化分布［5］。

RA感染可發(fā)生于1～7周齡的鴨，多發(fā)生于2～3周齡鴨［4］。2014年，河北某商品鴨場(chǎng)2日齡的北京鴨發(fā)病，至5日齡時(shí)死亡20%～30%。本研究對(duì)5日齡死亡病例進(jìn)行了病原分離和鑒定，確定為RA感染所致，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1病例5只5日齡病死北京鴨用于本試驗(yàn)，于2014年10月由河北某商品鴨場(chǎng)送檢。

1.2主要試劑胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和胰蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基（TSB），購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)菌微量生化鑒定管和麥康凱瓊脂糖，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL-1 000 DNA Marker、ddH2O，購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；EasyPure?Quick Gel Extraction Kit，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；1～19型RA標(biāo)準(zhǔn)血清由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.3細(xì)菌分離剖檢病死鴨，觀察剖檢變化。無(wú)菌蘸取5只鴨的腦和肝組織，分別接種于TSA和麥康凱瓊脂糖平板，置37℃燭缸和有氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.4生化試驗(yàn)挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基（含1%胎牛血清）中，置200 r/min（37℃）振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取少量菌液接種至葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、西蒙氏枸櫞酸鹽、硝酸鹽肉湯、硫化氫、β-半乳糖苷（ONPG）和尿素酶細(xì)菌微量生化鑒定管，置37℃溫箱中培養(yǎng)，觀察并記錄結(jié)果。

1.5分子檢測(cè)取純化培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，用組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，取5 μL DNA作為模板、用文獻(xiàn)［6］報(bào)道的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系還包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL和ddH2O 3.5 μL。將PCR反應(yīng)液置94℃預(yù)變性5 min，用94℃變性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸1 min的程序運(yùn)行32個(gè)循環(huán)，置72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

電泳完成后，切下目的條帶，用EasyPure?Quick Gel Extraction Kit純化回收PCR產(chǎn)物。將目的片段連接到pGEM?-T Easy Vector，轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α。鑒定后，將陽(yáng)性克隆送中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司測(cè)序。用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列編輯，在GenBank中用BLASTn進(jìn)行同源性檢索，用ClustalW進(jìn)行序列同源性分析。

1.6血清型鑒定用玻片凝集試驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)［5］。

2　結(jié)果

2.1病理變化剖檢后，可見(jiàn)5只死亡鴨均有嚴(yán)重的纖維素性心包炎和氣囊炎，其中2只鴨的肝臟表面見(jiàn)有明顯的纖維素性滲出物。

2.2細(xì)菌分離將5只鴨的腦和肝組織接種于TSA平板，均分離到細(xì)菌，菌落為圓形突起，其表面光滑，且邊緣整齊，用斜射光觀察呈綠色，直徑為0.5～1 mm，但接種麥康凱平板，未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。取3份腦組織的細(xì)菌分離物進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。

2.3生化試驗(yàn)3株細(xì)菌均不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇，西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)和β-半乳糖苷試驗(yàn)均為陰性，尿素酶試驗(yàn)為陽(yáng)性。

2.4PCR擴(kuò)增及測(cè)序如圖1所示，從3株細(xì)菌中均擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度為665 bp的目的條帶。用擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行BLASTn檢索的結(jié)果顯示，與之同源性的序列均為RA的16S rDNA序列。ClustalW結(jié)果顯示，在665 bp的16S rDNA區(qū)，所測(cè)3株細(xì)菌與選取的6個(gè)參考菌株（f71、f81、f14、D-24046、114/ 02和112/02株）的序列同源性為100%。

圖1　細(xì)菌分離株16S rDNA的PCR檢測(cè)M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：分離株；N：陰性對(duì)照

2.5血清型鑒定玻片凝集試驗(yàn)中，3株細(xì)菌僅與11型RA的標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生凝集反應(yīng)，與其余18個(gè)血清型的標(biāo)準(zhǔn)血清均無(wú)可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。

3　討論

RA、鴨大腸桿菌和鴨沙門(mén)菌感染商品肉鴨后，均可引起纖維素性心包炎、氣囊炎和肝周炎，但3種細(xì)菌的培養(yǎng)特性有所不同［1-7］。結(jié)合TSA平板和麥康凱平板的培養(yǎng)結(jié)果，可將疾病初步判斷為RA感染，排除了鴨大腸桿菌和鴨沙門(mén)菌感染的可能。在生化試驗(yàn)中，RA多表現(xiàn)出陰性結(jié)果［2-7］，本研究對(duì)3株分離株的生化鑒定結(jié)果與以往報(bào)道［1-3，8］相符。

16S rDNA是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)和鑒定的重要靶基因。在RA分類(lèi)研究中，16S rDNA分析法也已得到廣泛應(yīng)用［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，RA種內(nèi)不同菌株間16S rDNA的序列同源性為99.1%～100%［7］。本研究分離的3株細(xì)菌與6株RA參考菌株16S rDNA的序列同源性為100%，可進(jìn)一步將分離株鑒定為RA。

凝集試驗(yàn)和瓊擴(kuò)試驗(yàn)是對(duì)RA分離株進(jìn)行血清分型的主要方法［5］。本研究采用玻片凝集試驗(yàn)對(duì)RA分離株進(jìn)行了血清型鑒定，結(jié)果表明，3株RA分離株均屬血清11型。

上述結(jié)果表明，RA是導(dǎo)致5日齡雛鴨死亡的主要原因。據(jù)介紹，該養(yǎng)鴨場(chǎng)雛鴨從2日齡開(kāi)始發(fā)病，至5日齡時(shí)死亡20%～30%，至10日齡時(shí)死亡率達(dá)40%左右。由此可見(jiàn)，應(yīng)關(guān)注RA感染對(duì)1周齡內(nèi)雛鴨的危害。

參考文獻(xiàn)：

［1］Seger P，M annheim W，Vancanneyt M，et al.Riemerella anatipestifer gen.nov.comb.nov.the causitive agent of septicemia anserum exsudativa，and its phylogenetic affiliation within the Flavobacterium-Cytophaga rRNA homology group［J］. International Journal of Systematic Bacteriology，1993，43（4）：768-776.

［2］Subramaniam S，Kuhnert P，F(xiàn)rey J，et al.Phylogenetic position of Riemerella anatipestifer based on 16S rRNA gene sequences . International Journal of Systematic Bacteriology，1997，47（2）：562-565.

［3］郭玉璞，陳德威，范國(guó)雄，等.北京鴨小鴨傳染性漿膜炎的調(diào)查研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1982，13（2）107-113.

［4］Pathanasophon P，Sawada T，Tanticharoenyos T，et al.New serotypes of Riemerellaanatipestifer isolated from ducks in Thailand ［J］.Avian Pathology，1995，24（1）：195-199.

［5］張大丙，郭玉璞.我國(guó)鴨疫里氏桿菌血清型的鑒定.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，30（6）：536-542.

［6］Tsai H J，Liu Y T，Tseng C S，et al.Genetic variation of the ompA and 16S rRNA genes of Riemerellaanatipestifer［J］. Avian Pathology，2005，34（1）：55-64.

［7］曲豐發(fā)，蔡暢，鄭獻(xiàn)進(jìn)，等.利用16S rDNA建立種特異性PCR快速檢測(cè)鴨疫里默氏菌［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46（1）：13-17.

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0059- 02

收稿日期：2015-08-25

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-43）

作者簡(jiǎn)介：王名行（1989-），男，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)，E-mail：wangminghang@cau.edu.cn

通訊作者：張大丙，E-mail：zdb@cau.edu.cn