雞包涵體肝炎病毒熒光定量PCR滴度測(cè)定方法的建立及與不同滴定方法間的比較

李昌靜，王作昭，王靜靜，劉永舉，張　毅，畢玉敏，王冬冬，陳文雅，尹燕博，（.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島6609；.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春006；.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島660；.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島6609；.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島660）

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雞包涵體肝炎病毒熒光定量PCR滴度測(cè)定方法的建立及與不同滴定方法間的比較

李昌靜1，王作昭2，王靜靜3，劉永舉4，張毅3，畢玉敏1，王冬冬1，陳文雅5，尹燕博1，5
（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；2.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266109；5.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島266101）

摘要：本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中I群禽腺病毒（FAV-Ⅰ）代表株AAU46933（CELO株）的Hexon基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，摸索了合適的擴(kuò)增條件，建立了SYBR Green I熒光定量PCR方法，并對(duì)9株雞包涵體肝炎毒株的病毒滴度進(jìn)行了測(cè)定，并與OD260法、雞胚病變法以及細(xì)胞病變法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的檢測(cè)下限為0.98×102拷貝/μL。以細(xì)胞病變法為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，雞胚病變法與細(xì)胞病變法之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.591）；熒光定量PCR法與細(xì)胞病變法測(cè)得結(jié)果之間存在線性相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r=0.965，P＜0.05）；OD260法與細(xì)胞病變法測(cè)得的結(jié)果間無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，熒光定量PCR法測(cè)定結(jié)果能夠間接反映病毒感染力，與傳統(tǒng)方法相比，該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：雞；包涵體肝炎病毒；熒光定量PCR

王作昭（1979-），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事食品科學(xué)及安全相關(guān)科研工作，E-mail：zouzhaowang@163.com

注：王作昭與李昌靜對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

雞包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis in chicken，IBH）是由Ⅰ群禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AV-Ⅰ）引起的雞的一種急性病毒性傳染病，主要侵害雛雞，多呈急性經(jīng)過(guò)。該病首次由美國(guó)Helmbold和Frazier（1963）報(bào)道，我國(guó)于1976年首先在臺(tái)灣省發(fā)現(xiàn)該病，隨后在遼寧、山東、內(nèi)蒙古等省相繼發(fā)現(xiàn)IBH流行，現(xiàn)在該病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。目前，已有很多關(guān)于雞包涵體肝炎病毒檢測(cè)方法的報(bào)道，但對(duì)于該病毒定量測(cè)定的方法卻少有報(bào)道。

本試驗(yàn)建立了雞包涵體肝炎病毒SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法，并與該病毒常用的幾種定量測(cè)定方法如OD260法、TCID50法、EID50法等進(jìn)行比較，以期對(duì)雞包涵體肝炎的生物學(xué)特性研究提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料雞包涵體肝炎分離株（09CX、09LT-11、09DD、09XT、09WF、10JL-17、10DX、10SSY、12TS）由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；SPF種胚，購(gòu)自山東省無(wú)特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng)；pMD19-FAV1-T質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

病毒核酸提取試劑盒，購(gòu)自北京全式全生物科技有限公司；FS UniversaⅠSYBR Green Master熒光定量試劑，購(gòu)自羅氏公司；病毒純化試劑盒，購(gòu)自Biomiga公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)自GIBCO公司；DNase，購(gòu)自NEB公司；Taq酶，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1雞包涵體肝炎病毒的純化雞包涵體肝炎毒株09CX、09LT-11、09DD、09XT、09WF、10JL-17、10DX、10SSY、12TS在CEK上增值，細(xì)胞反復(fù)凍融3次后收集病毒液。按照腺病毒純化試劑盒步驟和要求純化病毒，后經(jīng)磷鎢酸負(fù)染，電鏡下觀察病毒形態(tài)。

1.2.2熒光定量PCR法

1.2.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中FAV-Ⅰ代表株AAU46933（CELO株）的Hexon基因序列，應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計(jì)的Ⅰ群禽腺病毒通用引物（由上海華大公司合成）正向F：5′-ATGACTGCGCTTACTCCCGACCTG-3′反向R：5′-GCTACGACCGTCTGCCTGAATTTGT-3′引物合成后以DEPC處理水稀釋為25 nmol/mL的工作濃度。

1.2.2.2病毒核酸的提取與標(biāo)準(zhǔn)品的制備50倍稀釋病毒，按照NEB公司的DNA酶滅活步驟對(duì)裸露的DNA進(jìn)行滅活。按照北京全式全生物技術(shù)有限公司病毒核酸提取試劑盒步驟提取病毒核酸。測(cè)定pMD19-FAV1-T質(zhì)粒濃度，將質(zhì)粒從10-2開始10倍梯度稀釋至10-8作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率。

1.2.2.3熒光定量PCR按羅氏公司FS UniversaⅠSYBR Green Master試劑盒的說(shuō)明書配制25 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照組以dH2O代替。反應(yīng)條件為：50℃2 min，95℃10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 s、60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。依公式：病毒基因組拷貝數(shù)/mL（μg/mL）=（病毒核酸拷貝數(shù)/μL）× （50 μL/200 μL）×1 000 μL×稀釋度，計(jì)算每mL病毒液中病毒基因組拷貝數(shù)。

1.2.3 OD260法測(cè)定病毒顆?？倲?shù)將病毒進(jìn)行梯度稀釋，以分光光度計(jì)測(cè)260 nm吸光度值。依公式：病毒顆粒/mL=OD值×稀釋倍數(shù)×1012計(jì)算病毒顆粒總數(shù)。

1.2.4 TCID50測(cè)定

1.2.4.1原代雞胚腎細(xì)胞（CEK）的培養(yǎng)取17～20日齡的SPF雞胚，按常規(guī)方法制備原代雞胚腎細(xì)胞［1］。

1.2.4.2病毒接種將病毒梯度稀釋至10-3～10-1210個(gè)梯度，每列1個(gè)稀釋度，最后兩列作空白對(duì)照。37℃，5%CO2培養(yǎng)5 d。每天觀察細(xì)胞病變情況。記錄病變情況，按Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒滴度［3］，并以感染單位/100 μL（IFU/100 μL）表示。

1.2.5 EID50測(cè)定病毒液10倍梯度稀釋，卵黃囊接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，作5個(gè)重復(fù)［2］，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。置37℃溫箱孵育24 h剔除死胚，收獲48 h以后死胚及19日齡未死胚。將死胚和具特征性病痕的未死胚計(jì)入總數(shù)［3］。按Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒滴度，以感染單位/200 μL （IFU/200 μL）表示。

1.2.6熒光定量PCR法與普通PCR靈敏度的比較2×106拷貝/μL的pMD19-FAV1-T質(zhì)粒10倍遞減稀釋，參照文獻(xiàn)［10］中的引物、反應(yīng)體系和程序進(jìn)行常規(guī)PCR。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)4種方法測(cè)定9種雞包涵體肝炎病毒滴度的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用One-way ANOVA比較不同方法間的差異，對(duì)于有顯著差異的方法，再用線性相關(guān)分析比較其與雞胚病變法的相關(guān)性。

2　結(jié)果

2.1雞包涵體肝炎病毒純化病毒純化后，經(jīng)磷鎢酸負(fù)染，電鏡下可觀察到大量呈典型晶格狀排列的病毒粒子，圓形或六角形，無(wú)囊膜，直徑60～90 nm，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，與雞包涵體肝炎病毒特征一致，沒(méi)有觀察到其他病毒，說(shuō)明病毒純化成功。

2.2熒光定量PCR法測(cè)定病毒基因組拷貝數(shù)所有pMD19-FAV1-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均擴(kuò)增良好，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線有效范圍為：0.97×102～3.12×1011。測(cè)得樣品Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式：Ct=-3.17lgC+41.31，得出對(duì)應(yīng)病毒液中核酸拷貝數(shù)。測(cè)得9株雞包涵體肝炎病毒Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式測(cè)得病毒核酸拷貝數(shù)。依換算公式得9種病毒的滴度，見表1。

2.3熒光定量PCR法與普通PCR靈敏度的比較

從各稀釋度質(zhì)粒的常規(guī)PCR電泳結(jié)果可看出，該方法的檢測(cè)下限為2×104個(gè)拷貝（圖2）。本試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)下限為0.98×102拷貝（圖1），比常規(guī)PCR的敏感性高100倍左右。

2.4OD260法測(cè)定病毒顆?？倲?shù)將9株雞包涵體肝炎病毒做100倍或1 000倍稀釋，測(cè)定其260 nm吸光度值。按公式計(jì)算得每毫升病毒液中病毒顆粒數(shù)，見表1。

2.5TCID50測(cè)定病毒滴度觀察細(xì)胞形態(tài)變化，從接毒后48 h開始每天觀察并記錄病變孔數(shù)。按Reed-Muench法公式計(jì)算病毒滴度，換算成IFU/mL，見表1。

表1　不同方法測(cè)定雞包涵體肝炎病毒滴度結(jié)果比較

圖2　常規(guī)PCR敏感性檢測(cè)M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～6：pMD19-FAV1-T質(zhì)粒從2×106拷貝/μL 10倍遞減到10拷貝/μL

2.6EID50測(cè)定病毒滴度觀察雞胚變化，記錄不同毒株的死胚和具有雞包涵體肝炎特征性病痕的未死胚。按Reed-Muench法公式計(jì)算病毒滴度，換算成IFU/mL，見表1。

2.7不同方法測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)4種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，EID50法與TCID50法之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.591）。熒光定量PCR法和OD260法與其他2種方法統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜0.05）。應(yīng)用線性相關(guān)分析得知，熒光定量PCR與TCID50法測(cè)得結(jié)果之間有線性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.965，P＜0.05）。OD260法測(cè)得結(jié)果與其他任一種方法測(cè)得結(jié)果均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

2.8不同測(cè)定結(jié)果的實(shí)用性比較綜合上述4種方法測(cè)定的結(jié)果，我們將各種方法的實(shí)用性進(jìn)行了匯總分析，見表2。

表2　不同方法間實(shí)用性比較

3　討論

定量測(cè)定雞包涵體肝炎病毒的方法主要分為兩大類：

第一類是對(duì)病毒的顆粒數(shù)進(jìn)行物理學(xué)定量的方法，以O(shè)D260法和熒光定量PCR法為主［4］。OD260法操作簡(jiǎn)單，但所測(cè)得的結(jié)果僅反映了單位體積病毒液里總的病毒顆粒數(shù)［5］，而在所測(cè)的顆粒中，包含有缺陷病毒顆粒［6］，這些缺陷病毒顆粒大量存在，且其數(shù)量與雞包涵體肝炎病毒的結(jié)構(gòu)、病毒擴(kuò)增的操作過(guò)程等諸多因素有關(guān)，并無(wú)固定的比例，這導(dǎo)致了OD260法所測(cè)得的結(jié)果與病毒的實(shí)際感染力無(wú)明顯相關(guān)性，不能真實(shí)反映雞包涵體肝炎病毒的實(shí)際感染力，故應(yīng)用價(jià)值有限。熒光定量PCR方法是通過(guò)熒光定量的方法對(duì)模板拷貝數(shù)進(jìn)行精確的定量［7］，且提取病毒核酸之前先對(duì)病毒進(jìn)行了滅活DNA的處理，除去了裸露的DNA，故該方法所測(cè)得的病毒核酸拷貝數(shù)較精確地反映了病毒保存液中總的完整病毒顆粒數(shù)［8］。因?yàn)椴⒎撬械耐暾《绢w粒均具有感染力，所以該法所測(cè)得的結(jié)果與病毒的實(shí)際感染效力仍不盡相同。在我們實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中，熒光定量PCR法測(cè)得的病毒拷貝數(shù)顯著高于以細(xì)胞病變法為代表的測(cè)定感染性滴度的方法所測(cè)得的結(jié)果［9］。但該法所測(cè)得的病毒拷貝數(shù)與常用的細(xì)胞病變法測(cè)定的病毒有效感染顆粒數(shù)之間存在著線性關(guān)系，這在一定程度上能夠間接反映出具有感染能力的病毒顆粒的數(shù)量。

第二類是反應(yīng)病毒實(shí)際感染力的方法。細(xì)胞病變法是測(cè)定雞包涵體肝炎病毒滴度的傳統(tǒng)方法。雞胚病變法和細(xì)胞病變法測(cè)定的均為感染性滴度，二者單位的意義是一致的。兩種方法測(cè)定結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異。而在實(shí)際操作的過(guò)程中，細(xì)胞病變法因主要依靠顯微鏡下觀察細(xì)胞感染雞包涵體肝炎病毒后的形態(tài)學(xué)上的改變，作為判定病變的依據(jù)，故造成了該法測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較差［5］，加之是原代細(xì)胞接毒，耗時(shí)較長(zhǎng)（24～26 d），影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。雞胚病變法主要通過(guò)記錄死胚數(shù)和觀察未死胚胚體和肝臟的特征性病痕，作為判定感染的依據(jù)，相對(duì)于細(xì)胞病變法，它的判定結(jié)果更準(zhǔn)確。

熒光定量PCR除了可較精確地測(cè)定完整病毒顆粒的數(shù)量外，還可以作為檢測(cè)雞包涵體肝炎病毒的一種手段。與常規(guī)PCR相比，前者敏感性更高，是后者的100倍，且全過(guò)程僅需2 h，大大縮短了檢測(cè)病毒的時(shí)間。

從表2可以看出，熒光定量PCR法和雞胚病變法所測(cè)得的結(jié)果均較為準(zhǔn)確，可重復(fù)性好，樣本處理簡(jiǎn)單。但雞胚病變法耗時(shí)較長(zhǎng)（19 d）、成本高，而熒光定量PCR方法速度更快，更敏感。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定樣本中雞包涵體肝炎病毒顆粒的數(shù)量，與其他常用的幾種方法相比，具有更敏感、速度更快、耗時(shí)更短等優(yōu)點(diǎn)。除此之外，本方法還可以用于臨床樣本中雞包涵體肝炎病毒的檢測(cè)，與常規(guī)PCR相比，該方法更敏感、速度更快。

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Development of a real- time PCR method for determination of chicken inclusion body hepatitis virus titer and comparativeanalysis between different methods

LI Chang-jing1，WANG Zuo-zhao2，WANG Jing-jing3，LIU Yong-ju4，ZHANG Yi3，BI Yu-min1，WANG Dong-dong1，CHEN Wen-ya5，YIN Yan-bo1，5
（1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Military science and technology college of jilin university，changchun 130062，China；3.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266001，China；4.College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；5.Qingdao Oland-Better Biological Engineering company，Qingdao 266001，China）

Abstract：To establish a simple and convenient method for determination of chicken inclusion body hepatitis virus，the realtime PCR was developed with a pair of universal primers referencing Hexon gene of the CELO strain，and the amplifying condition was groped.Nine chicken inclusion body hepatitis virus strains were titrated by both the established real-time PCR method，and other three determination methods（optical absorbance，mbryonated infectious dose，and cytopathic effect）.Our results showed that the detection limit of this method was 0.98×102copies/μL.There was no statistical differences（P=0.591）between embryonated infectious dose and cytopathic effect.However，linear relations existed，between the determination results of real-time PCR and cytopathic effect（coefficient of association r=0.965，P＜0.05）.These results indicate that the determination using real-time PCR method can reflect the virus infectivity indirectly，has the advantage of simple operation，timesaving，and low cost compared with traditional method，and has a high application value.

Key words：Chicken；inclusion body hepatitis virus；real-time PCR

中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0044- 03

收稿日期：2014-08-14

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2010CM014）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-13-011-03）

作者簡(jiǎn)介：李昌靜（1987-），女，碩士，主要從事獸醫(yī)病理學(xué)及其分子生物學(xué)研究，E-mail：lichangjing2007_@126.com

通訊作者：尹燕博，E-mail：yanboyin2011@163.com

Corresponding author：YIN Yan-bo