?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法的建立

張　蕾，肖　進，2，董春娜，巴利民，栗利芳，宋　芳，王　楠，周　強，齊　鵬，汪　明，2（.中牧實業(yè)股份有限公司農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點實驗室北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心，北京豐臺00070；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀0093）

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牛口蹄疫O型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法的建立

張蕾1，肖進1，2，董春娜1，巴利民1，栗利芳1，宋芳1，王楠1，周強1，齊鵬1，汪明1，2
（1.中牧實業(yè)股份有限公司農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點實驗室北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心，北京豐臺100070；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193）

摘要：根據(jù)?？谔阋逴型3個拓撲型VP1序列設計3條合成肽，以此為包被抗原建立?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法，并對該方法敏感性、特異性和重復性進行驗證。結(jié)果顯示，該方法敏感性為96.7%，特異性為99.1%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.1%～9.8%和3.5%～10.7%。與2種商品化試劑盒比較，符合率分別為93.5%和85.9%。結(jié)果表明，該方法敏感性好、特異性強、穩(wěn)定性高，可用于?？谔阋逴型抗體水平檢測。

關鍵詞：牛；口蹄疫；合成肽；ELISA

肖進（1978-），男，博士生，工程師，從事合成肽疫苗及診斷試劑研發(fā)工作，E-mail：xjpeptide@126.com

注：肖進與張蕾對本文具有同等貢獻

（1.China Animal Husbandry Industry Co.Ltd.Ministry of Agriculture Key Laboratory of veterinary biologics and drugs；Veterinary peptide vaccine design and preparation of engineering and technology center of Beijing，Beijing 100070，China；

2.College of Veterinary medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

口蹄疫（FMD）是由FMDV引起偶蹄動物的烈性傳染病，該病毒傳播途徑多、傳染性強，嚴重危害畜牧業(yè)發(fā)展及畜產(chǎn)品生產(chǎn)供應，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）在1984年將口蹄疫列為A類傳染病之首。FMDV有A、O、C、SAT I、SAT II、SAT及Asia 1七個血清型，每個型又分為若干個亞型，型及亞型間無交叉保護［1］。FMDV衣殼含有VP1、VP2、VP3和VP4共4種結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP1暴露于病毒顆粒表面，能誘導感染動物產(chǎn)生中和抗體，在分子流行病學調(diào)查、血清型分析等方面具有較重要學術價值和現(xiàn)實意義［2］。由于口蹄疫病毒近些年流行毒的突變發(fā)生頻率越來越高，而市售試劑盒僅能涵蓋較少毒株，因而已經(jīng)不能滿足對現(xiàn)有毒株的檢出率，為了克服這一缺陷，本試驗針對口蹄疫O型3個拓撲型（CATHAY、ME-SA型和SEA型），采用生物信息學方法對VP1序列進行精確分析，篩選出3條肽，制備出更新更全的包被抗原，建立了?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測方法，為進一步研發(fā)?？谔阋逴型合成肽VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測試劑盒奠定基礎。

1　材料與方法

1.1包被抗原分別為來自CATHAY、ME-SA和SEA三個拓撲型VP1結(jié)構(gòu)蛋白的表位（位于氨基酸140～160區(qū)域），由中牧實業(yè)股份有限公司研究院合成并純化。

1.2主要試劑兔抗牛IgG酶標二抗，購自Sigma公司；其他試劑，購自Amresco公司；牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗診斷試劑盒，購自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥公司（UBI）；口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所（LVRI）。

1.3血清牛口蹄疫O型陰、陽性對照血清由本公司制備；100份?？谔阋逴型病毒感染牛血清，50份牛口蹄疫O型疫苗免疫血清，100份健康牛血清（口蹄疫抗體為陰性），276份牛臨床血清由蘭州生物藥廠提供；?？谔阋邅喼?型陽性血清和?？谔阋逜型陽性血清各5份，由本公司制備。

1.4最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采取方陣滴定方法，用包被液將合成肽包被抗原分別作8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL/肽，倍比稀釋；將陽、陰性血清從1∶10、1∶20稀釋至1∶320，比較P/N值（P：陽性對照孔OD450值；N：陰性對照孔OD450值），以P/N值最大的孔所對應的抗原包被濃度和血清稀釋度為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.5最佳封閉條件的確定分別用含0.2%、1% BSA、0.5%和5%脫脂奶粉的0.01%Tween-20 PBS （0.01 mol/L，pH值7.2）作為封閉液，進行ELISA檢測，比較P/N值，以P/N值最大孔對應封閉液配方作為最佳封閉液。

1.6底物反應時間的確定分別置37℃孵育10、15 min及20 min，比較P/N值，以確定底物最佳反應時間。

1.7臨界值的確定對100份健康牛血清進行測定，根據(jù)健康動物血清樣本OD450平均值（X）加上3個標準差（SD）得出試劑盒臨界值。

1.8敏感性試驗對100份感染牛血清和50份免疫牛血清進行檢測。

1.9特異性試驗對100份健康牛血清、?？谔阋邅喼?型陽性血清、?？谔阋逜型陽性血清各5份分別進行檢測。

1.10重復性試驗用同一批次包被酶標反應板和相應試劑，分別檢測已知背景15份血清樣本，其中陰性、強陽性和弱陽性血清各5份，計算批內(nèi)變異系數(shù)。用3批包被酶標反應板和相應試劑，分別檢測已知背景15份血清樣本，計算批間變異系數(shù)。

1.11比對試驗對276份臨床血清分別用本方法、UBI和LVRI試劑盒進行比對試驗。

2　結(jié)果與分析

2.1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定結(jié)果顯示（表1）抗原最佳包被濃度為0.5 μg/mL/肽，血清最佳稀釋度為1∶20。

表1　方陣滴定結(jié)果（P/N比值）

2.2最佳封閉條件的確定結(jié)果顯示（圖1）含有1%BSA、0.01%Tween-20的PBS封閉效果最好。

圖1　封閉液的確定

2.3待檢血清最佳反應時間的確定結(jié)果顯示（圖2），加入待檢血清反應60 min后，P/N值最高。

2.4臨界值的確定所測得100份健康牛血清平均OD450值（X）為0.141，標準方差（SD）值為0.041，X+3SD=0.264?！?.264判為陽性；＜0.264判為陰性。利用該Cut-off值判定這100份健康牛血清，僅有2份血清為陽性，因而確定的臨界值可靠。

2.5敏感性試驗本方法對100份感染牛血清和50份免疫血清進行檢測（見表2），其中145份血清為陽性，5份血清為陰性，敏感性為96.7%。

圖2　血清反應時間的確定

表2　試劑盒敏感性和特異性試驗結(jié)果

2.6特異性試驗本方法對100份健康牛血清檢測僅有1份為陽性，對牛亞洲1型陽性血清和牛A型陽性血清均為陰性（表3），特異性為99.1%（109/110）。

表3　試劑盒重復性試驗結(jié)果

2.7重復性試驗批內(nèi)重復性結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在2.1%～9.8%之間。批間重復性結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)在3.5%～10.7%之間，表明該試劑盒重復性較好。

2.8比對試驗對276份臨床血清進行檢測，本方法陽性檢出率為37.0%。UBI試劑盒陽性檢出率為36.2%。兩者共有258份血清檢測結(jié)果一致，符合率為93.5%。LVRI試劑盒陽性檢出率為40.2%。兩者總共有237份血清檢測結(jié)果一致，符合率為85.9%。

表4　與其他試劑盒比對試驗結(jié)果

3　討論

目前OIE公布的口蹄疫感染和疫苗免疫后抗體檢測的血清學檢測方法有3種：液相阻斷ELISA、病毒中和試驗、固相競爭ELISA。其中以病毒中和試驗最為經(jīng)典，是評價疫苗效果和檢驗其他方法的“金標準”，但操作繁瑣，且涉及活病毒，對實驗室生物安全和操作人員要求較高。液相阻斷ELISA目前是大多數(shù)國家廣泛使用的方法，然該方法需對血清作至少4個稀釋度，每塊板最多檢測20份血清，且操作繁瑣。本試驗建立的方法操作簡便適合大批量檢驗，包被抗原為合成肽，無需接觸和使用病毒，無生物安全隱患。其次合成肽是FMDV外殼蛋白VP1抗原決定簇序列，與相應抗體的結(jié)合力強，決定了本方法檢測的敏感性。并且合成肽是短肽，與其他非特異性抗體的交叉反應性較低［3］，因此該方法在高效、特異、快捷及生物安全性上實現(xiàn)了較完美的結(jié)合。試驗結(jié)果證明，該方法敏感性高、特異性好、重復性好，符合市場要求，可用于牛口蹄疫病毒O型抗體檢測，為進一步研發(fā)相應試劑盒奠定了基礎。

參考文獻：

［1］Alexandersen S，Zhang Z，Donaldson A I，et al.The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease［J］.J Comp Pathol，2003，129 （1）：1-36.

［2］Acharya R，F(xiàn)ry E，Stuart D，et al . The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution［J］. Nature，1989，337（6209）：709-716.

［3］Wang C Y，Chang T Y，Walfield A M，et al.Effective syntheticpeptide vaccine for foot and mouth disease in swine［J］. Vaccine，2002：2603 -2610.

Development of an ELISA based on synthetic peptidefor detection of cattlefoot- and- mouth diseasevirus type O VP1 antibody

ZHANG Lei1，XIAO Jin1，2，DONG Chun-na1，BA Li-min1，LI Li-fang1，SONG Fang1，WANG Nan1，ZHOU Qiang1，QI Peng1，WANG Ming1，2

Key words：cattle；FMDV；synthetic peptide；ELISA

Abstract：Three synthetic peptides of FMDV VP1 were used to detect antibody of FMDV type O.The ELISA system was optimized and the sensitivity，specificity and repeatability of this method were tested.The results showed that the sensitivity and specificity were 96.0%and 99.1%，and variations of intra-and inter-assay repeatability were 2.1%～9.8%and 3.5%～10.7%.Comparing this method with 2 test kits showed a coincidence rate of 93.5%and 85.7%.The results show that this method has high sensitivity and specificity，and is stable，which can be used to monitor VP1 antibody.

中圖分類號：S858.23

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0022- 03

收稿日期：2014-12-26

作者簡介：張蕾（1984-），女，獸醫(yī)師，博士，從事動物免疫學研究，E-mail：zhanglei1984cau@163.com

通訊作者：齊鵬，E-mail：cahic_ivd@vip.tom.com

Corresponding author：QI Peng