脂蛋白(a)顆粒水平與早發(fā)性冠脈粥樣硬化的相關(guān)性分析

朱　晶　徐世驥　吳　炯　張春燕　王蓓麗　郭　瑋　潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科　上?！?00032)

脂蛋白(a)顆粒水平與早發(fā)性冠脈粥樣硬化的相關(guān)性分析

朱晶徐世驥吳炯張春燕王蓓麗郭瑋潘柏申△

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科上海200032)

【摘要】目的探討血清脂蛋白 (a)[lipoprotein (a),Lp (a)]顆粒水平與早發(fā)性冠脈粥樣硬化的相關(guān)性,研究以nmol/L為檢測單位的Lp (a)試劑的臨床應(yīng)用價值。方法檢測177名早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者和200名體檢健康者 (對照組)的血清Lp (a)顆粒水平,將檢測結(jié)果與患者冠脈粥樣硬化程度 (以Gensini積分評估)和其他血清標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果該Lp (a)試劑的檢測精密度在可接受范圍內(nèi),濃度在2.65～235.20 nmol/L的線性驗證良好。在早發(fā)性冠脈粥樣硬化組中有35.51% 的患者Lp (a)顆粒水平升高,該比例顯著高于對照組的4% (P<0.001)。Lp (a)、膽固醇 (cholesterol,CHO)、載脂蛋白B (apolipoprotein-B,APO-B),肌酐 (creatinine,CRE)、高敏C反應(yīng)蛋白 (high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)與早發(fā)性冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān) (P<0.05)。通過二元Logistic回歸分析得到,Lp (a) (OR=2.883,P=0.004)與APO-B (OR=5.440,P=0.007)是早發(fā)性冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的獨(dú)立風(fēng)險因素。結(jié)論以nmol/L為檢測單位，Lp (a)試劑的精密度和線性范圍均符合實驗室檢測性能要求,適合于臨床檢驗應(yīng)用。血清Lp (a)顆粒水平是早發(fā)性冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的獨(dú)立風(fēng)險因子,可預(yù)測早發(fā)性冠脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度。

【關(guān)鍵詞】脂蛋白(a);早發(fā)性冠脈粥樣硬化;檢測性能驗證

心血管疾病是全球范圍內(nèi)死亡率最高的疾病,其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病 (簡稱冠心病)最為常見。全球每年約720萬人死于冠心病,25%的成年人初發(fā)心臟病即被奪去生命[1]。近年來我國冠心病的發(fā)病也呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。目前認(rèn)為，男性≤55歲、女性≤65歲,至少有一支冠狀動脈主干或其主要分支內(nèi)徑狹窄≥50%即可認(rèn)定為早發(fā)性冠脈粥樣硬化[2]。應(yīng)用實驗室檢測標(biāo)志物對于輔助診斷和預(yù)測早發(fā)性冠脈粥樣硬化具有重要的意義。

大量研究證實,脂蛋白 (a)[lipoprotein (a),Lp (a)]與冠心病密切相關(guān),Lp (a)是預(yù)測冠心病的獨(dú)立風(fēng)險因素[3]。在歐洲動脈粥樣硬化學(xué)會2010年導(dǎo)則中推薦高危人群應(yīng)檢測Lp (a)。但由于Lp (a)不同亞型之間分子大小存在高度異質(zhì)性,Lp (a)檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化一直是重要課題。在國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟 (International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine,IFCC)的推動下,Lp (a)的檢測標(biāo)準(zhǔn)化工作取得了較大成績,目前已基本構(gòu)建了Lp (a)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測體系。同時為了解決Lp (a)分子大小異質(zhì)性的問題,IFCC推薦以nmol/L為檢測單位報告Lp (a)顆粒水平[4]。

目前我國臨床使用的Lp (a)檢測試劑多以mg/L為報告單位,無法反映Lp (a)分子顆粒大小的異質(zhì)性。本文首次評估了可溯源至IFCC標(biāo)準(zhǔn)的羅氏Lp (a)試劑的檢測性能,并研究了Lp (a)顆粒水平在早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者中的臨床應(yīng)用價值。

資 料 和 方 法

研究對象

早發(fā)性冠脈粥樣硬化組選擇2014年1月至4月入院行冠狀動脈造影術(shù)并診斷為早發(fā)冠脈粥樣硬化的患者177名,年齡25～65歲,平均年齡49.1歲,其中男性153名,女性24名。排除標(biāo)準(zhǔn): (1)肝和/或腎功能不全; (2)影響脂質(zhì)代謝的其他疾病,如甲狀腺功能減低、腎病綜合征等。經(jīng)冠狀動脈造影證實,至少有一支冠狀動脈主干或其主要分支內(nèi)徑狹窄≥50%,男性≤55歲、女性≤65歲診斷為早發(fā)冠脈粥樣硬化。

對照組選擇本院體檢健康者,經(jīng) B超、心電圖、臨床各項檢查及血糖、肝腎功能等檢驗排除肝病、腎病、冠心病、高血壓、腫瘤、糖尿病等病史和疾病,匹配疾病組年齡,入組200名,年齡26～65歲,平均年齡48.2歲,其中男性157名,女性43名。入選對象均空腹12 h后于次日清晨,經(jīng)肘靜脈采血3 mL,加入內(nèi)含惰性分離膠、促凝劑的真空采血管中,以3 500×g離心10 min,分離血清,-80 ℃保存待檢。

儀器和試劑Lp (a)2試劑盒 (681357-01,瑞士Roche公司),Lp (a)試劑盒 (471681,日本積水公司)在全自動生化分析儀 (cobas c501,瑞士Roche公司)上檢測;膽固醇 (600265,瑞士Roche公司)、肌酐 (600108,瑞士Roche公司)、血糖 (693978,瑞士Roche公司)、低密度脂蛋白膽固醇 (596ADB,日本KYOWA公司)、載脂蛋白A (18550/00001094)、載脂蛋白B (18560/00001096)、hs-CRP (60090303,德國Diasys公司)在HITACHI 7600全自動生化分析儀上檢測。

性能驗證

精密度收集臨床患者混合血清,分為Lp (a)高、中、低水平各進(jìn)行20次重復(fù)檢驗,計算批內(nèi)精密度。高、中、低水平連續(xù)檢驗20天,計算批間精密度。結(jié)果以均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù) (CV)表示,根據(jù)文獻(xiàn)[5],不精密度不大于±4%認(rèn)為可接受。

線性范圍驗證選取Lp (a)高值和低值標(biāo)本,兩者以不同比例做系列稀釋,配制成5個不同濃度的混合血清。每一混合血清重復(fù)檢測2次,取其均值為實測值。以理論值為X軸,實測值為Y軸,得到回歸方程:Y=bX+a,并計算相關(guān)系數(shù)。若b在1±0.03,a與0無顯著性差異,則認(rèn)為線性范圍可接受。

試劑間相關(guān)性驗證共收集Lp (a)濃度為2.65～235.2 nmol/L的血清標(biāo)本377例,分別使用羅氏試劑 (nmol/L)和積水試劑 (mg/L)檢測,以羅氏試劑檢測結(jié)果作為X軸,積水試劑檢測結(jié)果作為Y軸,得到回歸方程：Y=bX+a,并計算出相關(guān)系數(shù),比較兩種試劑間的相關(guān)性。

Lp (a)在早發(fā)性冠脈粥樣硬化中的臨床應(yīng)用檢測早發(fā)性冠脈粥樣硬化組與對照組人群的Lp (a)顆粒水平,比較兩者的分布差異。根據(jù)Framingham研究,將75 nmol/L作為Lp (a)判斷限[4],將早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者分為Lp (a)≤75 nmol/L組與>75 nmol/L,對兩組的臨床資料進(jìn)行比較。

比較早發(fā)性冠脈粥樣硬化程度嚴(yán)重組和輕微組的臨床資料,根據(jù)Gensini積分系統(tǒng)來評價冠狀動脈造影術(shù)結(jié)果，判斷心血管疾病嚴(yán)重程度,此積分系統(tǒng)結(jié)合了冠狀動脈病變部位和狹窄程度。Gensini積分>30為阻塞嚴(yán)重,Gensini積分≤30為阻塞輕微[6]，對兩組的臨床資料進(jìn)行比較。

Lp (a)與早發(fā)性冠脈粥樣硬化程度的相關(guān)性和獨(dú)立風(fēng)險因素分析分析早發(fā)性冠脈粥樣硬化組中Lp (a) 水平與年齡、性別、Gensini積分、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白A、載脂蛋白B、肌酐、血糖、超敏CRP的線性相關(guān)程度。以Gensini積分>30作為因變量,以其他風(fēng)險因素作為自變量;進(jìn)一步以Lp (a)≤75 nmol/L組與Lp (a)>75 nmol/L組作為自變量。以二元Logistic逐步回歸法分析Lp (a)是否為Gensini積分>30的獨(dú)立風(fēng)險因素。

結(jié)果

Lp(a)試劑性能驗證

精密度驗證高、中、低水平Lp(a)混合血清不精密度結(jié)果見表1,CV水平均≤4%。

表1　不同水平Lp (a)的批內(nèi)和批間精密度

線性驗證使用Lp (a)混合血清進(jìn)行線性范圍驗證,濃度在2.65～235.2 nmol/L線性良好,實測均值與理論值的線性方程為y=1.021 4x-7.087 7 (R2=0.996 8)，基本涵蓋了廠商說明書中聲明的7～240 nmol/L線性范圍。

試劑間相關(guān)性驗證共收集Lp (a)濃度在2.65～235.2 nmol/L的血清標(biāo)本377例,分別使用羅氏試劑 (nmol/L)和積水試劑 (mg/L)檢測,比較檢測結(jié)果的相關(guān)性 (圖1),兩類試劑間存在良好的相關(guān)性,線性方程為y=3.526x+6.438 (R2=0.975)。

Lp(a)在早發(fā)性冠脈粥樣硬化中的應(yīng)用

早發(fā)性冠脈粥樣硬化組與對照組的Lp (a)顆粒水平比較早發(fā)性冠脈粥樣硬化組Lp (a)顆粒水平高于對照組,兩組均值差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001，圖2A)。以75 nmol/L作為Lp (a)判斷限,早發(fā)性冠脈粥樣硬化組中35.51%的患者Lp (a)顆粒水平升高,而這一比例在對照組中為4.00%,前者顯著高于后者 (圖2B)。

Lp (a)顆粒水平分布情況 (圖2A)：對照組中位數(shù) (四分位間距)為13.7 (28.08);早發(fā)性冠脈粥樣硬化組中位數(shù) (四分位間距)為37.0 (81.85)，兩組間Lp (a)顆粒水平分布差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)。

早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者Lp(a)≤75 nmol/L組與>75 nmol/L組的臨床資料比較將早發(fā)性冠脈粥樣硬化組分為Lp (a)≤75 nmol/L組與>75 nmol/L組,對兩組間臨床資料進(jìn)行比較 (表2)。兩組間Gensini積分、CHO水平、Apo-B水平差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)。

表2　早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者Lp (a)≤75 nmol/L組與

aData cannot be converted to normal distribution,expressed as median (quartile),and analysed byMann-WhitneyUtest.bNormal distribution data are analysed by independent-samplesttest.

早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者Gensini積分≤30組與>30組的臨床資料比較根據(jù)Gensini積分將早發(fā)性冠脈粥樣硬化組分為Gensini積分≤30組 (硬化程度輕微)與>30組 (硬化程度嚴(yán)重),比較兩組間臨床資料 (表3)。兩組間Lp (a)顆粒水平及Lp (a)升高百分比的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001,圖3)。

Lp (a)顆粒水平分布情況 (圖3A):Gensini積分≤30組的中位數(shù) (四分位間距)為20.4 (46.7);Gensini積分>30組的中位數(shù) (四分位間距)為59.1 (95.83)，兩組間Lp (a)顆粒水平差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)。

以75 nmol/L作為Lp (a)判斷限,Gensini積分>30組中有43.33% Lp (a)顆粒水平升高,Gensini積分≤30中有17.24% Lp (a)顆粒水平升高,Gensini積分>30組中陽性百分比顯著高于Gensini積分≤30 (圖3B)。

Lp (a)與早發(fā)性冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的相關(guān)性及Lp (a)是否為其獨(dú)立影響因素分析早發(fā)性冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度與各種危險因素的相關(guān)程度(表3),其中將Lp (a)為75 nmol/L作為判斷限分為兩組。結(jié)果顯示Lp (a),CHO,APO-B,CRE,hs-CRP與冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)性 (P<0.05)。為了進(jìn)一步排除混合因素的影響,通過二元逐步回歸分析10種風(fēng)險因素與冠脈粥樣硬化分組相關(guān)情況,以P<0.05進(jìn)入、P>0.1剔出模型,結(jié)果顯示Lp (a) (OR=2.883,95% CI:1.400～5.939,P=0.004)與APO-B (OR=5.440,95% CI:1.574～18.804,P=0.007)是冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的獨(dú)立風(fēng)險因素。

表3　早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者Gensini積分≤30組

aData cannot be converted to normal distribution,expressed as median (quartile) and analysed byMann-WhitneyUtest.bNormal distribution data,analysed by independent-samplesttest.

討論

Lp (a)無法精確檢測質(zhì)量的主要難度在于其結(jié)構(gòu),Lp (a)中Apo (a)分子具有的高度多態(tài)性,Apo (a)環(huán)餅區(qū)域K4的第2段中的重復(fù)差異從3～40個拷貝不等,這使得Apo (a)的相對分子質(zhì)量從187 000到662 000,直接導(dǎo)致不同型Lp (a)大小存在巨大差異[7]。以mg/L為檢測單位報告Lp (a)質(zhì)量，評估心血管風(fēng)險中會存在過高或過低評估[8]，比如不同待測樣本可能得到相同的分子總質(zhì)量結(jié)果,但由于Lp (a)分子大小的異質(zhì)性,Lp (a)微粒的總數(shù)量可能會存在較大的差異。研究發(fā)現(xiàn)Lp (a)的絕對分子數(shù)量水平對心血管疾病的風(fēng)險預(yù)測能力遠(yuǎn)高于Lp (a)顆粒大小情況[9]。使用nmol/L為檢測單位報告的Lp (a)微粒的總數(shù)量更能準(zhǔn)確地預(yù)測心血管疾病的風(fēng)險情況。IFCC推薦以nmol/L報告Lp (a)顆粒水平,不推薦以mg/L報告,因為以nmol/L報告更利于不同方法測定的Lp (a)和不同研究中Lp (a)的可比性[4]。

以nmol/L為單位報告Lp (a)必須滿足兩個條件:Lp (a)檢測抗體避免受到Apo (a)多態(tài)性的影響,Lp (a)校準(zhǔn)品可溯源至IFCC參考物質(zhì)。本研究中使用羅氏Tina-quant?Lp (a)二代試劑檢測抗體,可識別每一分子的apo (a),并且可溯源至IFCC參考物質(zhì)SRM2B (nmol/L)。該試劑遵照歐洲動脈粥樣硬化學(xué)會 (EAS)指南,采用nmol/L報告單位,性能驗證結(jié)果顯示良好的重復(fù)性及線性。并且與積水試劑 (mg/L)進(jìn)行方法學(xué)比對,結(jié)果顯示兩者相關(guān)性良好。

冠心病是一類與年齡密切相關(guān)的疾病,高齡是冠心病的重要危險因素。早發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者發(fā)病早,社會危害更大。高齡冠心病的危險因素主要是膽固醇、糖尿病等,早發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危險因素與之存在差異,目前普遍認(rèn)為其更傾向于遺傳背景。本研究比較了Lp (a)水平在早發(fā)性冠脈粥樣硬化組與對照組中的差異,疾病組中Lp (a)顆粒水平明顯升高。以75 nmol/L作為Lp (a)的判斷限,疾病組中Lp (a)顆粒水平升高的比例遠(yuǎn)高于對照組。進(jìn)一步分析冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度與Lp (a)的關(guān)系,根據(jù)冠狀動脈造影Gensini積分系統(tǒng)評估冠狀動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度,比較Lp (a)等10種風(fēng)險因素與冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度間的關(guān)系,結(jié)果顯示阻塞程度嚴(yán)重組的LP (a)、CHO、Apo-B、CREA、hs-CRP水平和男性比例高于阻塞程度輕微組。為了進(jìn)一步排除混合因素的影響,本研究通過二元逐步回歸分析10種風(fēng)險因素與冠脈粥樣硬化分組相關(guān)情況,結(jié)果顯示Lp (a) (OR=2.883,P=0.004)與Apo-B (OR=5.440,P=0.007)是冠脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的獨(dú)立風(fēng)險因素,在Lp (a)>75 nmol/L的患者中,冠脈粥樣硬化的情況更嚴(yán)重。本研究結(jié)果證明Lp (a)可以用于預(yù)測早發(fā)性冠脈粥樣硬化患者的嚴(yán)重程度,為臨床觀察和治療早發(fā)性冠心病患者提供指導(dǎo)。

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The correlation analysis between lipoprotein (a) levels and early coronary atherosclerosis

ZHU Jing, XU Shi-ji, WU Jiong, ZHANG Chun-yan, WANG Bei-li, GUO Wei, PAN Bai-shen△

(DepartmentofClinicalMedicine,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the relationship between serum lipoprotein (a)[Lp (a)] level and early coronary atherosclerosis,and to validate the clinical application when using nmol/L as the unit of Lp (a).MethodsSerum Lp (a) level were dected in 177 patients with early coronary atherosclerosis who underwent angiography and 200 healthy individuals (the control group).The correlation was analyzed between Lp (a) level and the severity of coronary artery disease,and between Lp (a) level and other biomarkers using Gensini Integrals.ResultsThe detection imprecision of Lp (a) reagent's was in the acceptable range,and it was linear in the studied range of 2.65-235.20 nmol/L.The proportion of elevated serum Lp (a) level was significantly higher in the atherosclerosis group (35.51%) compared with the control group (4%) (P<0.001).Spearman’s correlation analysis indicated that serum Lp (a),cholesterol (CHO),apolipoprotein-B (APO-B),creatinine (CRE),and high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) levels were positive correlated with the severity of early coronary atherosclerosis (P<0.05).Binary Logistic regression analysis demonstrated that serum Lp (a) and APO-B levels were significantly independently associated with the severity of coronary atherosclerosis (OR=2.883,P=0.004 and OR=5.440,P=0.007,respectively).ConclusionsLp (a) reagent is reliable for laboratory test in precision and linear studies.When using nmol/L as the unit,Lp (a) is an independent risk factor for early coronary atherosclerosis,and could predict its severity.

【Key words】lipoprotein (a);early coronary atherosclerosis;performance evaluation

【中圖分類號】R543.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.004

(收稿日期:2015-10-13;編輯:王蔚)

國家自然科學(xué)基金面上項目 (81572064);“十二五”國家科技支撐計劃課題 (2012BAI37B01);上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)項目 (2015ZB0201)

△Corresponding authorE-mail:pan.baishen@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81572064),the National Science & Technology Pillar Program during the 12thFive-year Plan Period (2012BAI37B01) and the Key Developing Disciplines of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2015ZB0201).