大鼠飲水獎(jiǎng)賞條件反射的建立及其習(xí)得規(guī)律

張 鑫，吳廣延，侯蓓蓓，劉文賢，余 茜

(1.四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)，重慶 400038；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院康復(fù)科，四川 成都 610072)

大鼠飲水獎(jiǎng)賞條件反射的建立及其習(xí)得規(guī)律

張 鑫1，吳廣延2，侯蓓蓓1，劉文賢1，余 茜3

(1.四川醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)，重慶 400038；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院康復(fù)科，四川 成都 610072)

目的 以自由活動(dòng)的大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立飲水獎(jiǎng)賞條件反射，分析其建立和消退特征。方法 20只成年雄性大鼠，分為配對(duì)組和非配對(duì)組各10只，配對(duì)組給予以聲音作為條件刺激，固定的間隔時(shí)間后給予水滴作為獎(jiǎng)賞性非條件刺激進(jìn)行飲水條件反射訓(xùn)練，非配對(duì)組同樣以聲音作為條件刺激，但給予一個(gè)隨機(jī)的時(shí)間間隔后的水滴作為非條件反射進(jìn)行訓(xùn)練，利用紅外發(fā)射及接收裝置探查大鼠的飲水反應(yīng)，通過生理記錄儀記錄相關(guān)行為，比較兩組飲水反應(yīng)習(xí)得率和潛伏期。結(jié)果 配對(duì)組大鼠能夠習(xí)得飲水獎(jiǎng)賞條件反射，7天訓(xùn)練后習(xí)得率維持在60%以上的高水平；反應(yīng)潛伏期隨訓(xùn)練時(shí)間增加而縮短；消退實(shí)驗(yàn)中大鼠的習(xí)得率迅速下降并維持在10%以下的低水平。非配對(duì)組不能習(xí)得飲水獎(jiǎng)賞條件反射，習(xí)得率維持在20%以內(nèi)的低水平。結(jié)論 自由活動(dòng)的大鼠能建立獎(jiǎng)賞飲水條件反射，習(xí)得后也能迅速消退。

飲水反射；大鼠；習(xí)得率；潛伏期

學(xué)習(xí)記憶是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一項(xiàng)重要的高級(jí)生命活動(dòng)，作為一種最簡單的學(xué)習(xí)記憶行為，經(jīng)典條件反射包括恐懼性條件反射、眨眼條件反射等已被廣泛地應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶研究中，并且極大的推動(dòng)了我們對(duì)學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)機(jī)制的了解。相關(guān)研究表明，不同的條件反射類型涉及到的神經(jīng)機(jī)制并不一致，其中經(jīng)典條件反射的中樞主要涉及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)，例如恐懼性條件反射屬于情緒性學(xué)習(xí)，其中樞位于杏仁核，而眨眼條件反射屬于運(yùn)動(dòng)性學(xué)習(xí)，其中樞位于小腦。而獎(jiǎng)賞性條件反射行為需要覺察功能的參與，涉及更為復(fù)雜的神經(jīng)機(jī)制，相關(guān)領(lǐng)域目前對(duì)其了解甚少。飲水條件反射是一種涉及獎(jiǎng)賞行為的條件反射，Petr等應(yīng)用飲水條件反射模型研究聽覺皮層和丘腦對(duì)聲音刺激行為的調(diào)節(jié)[1]，Heath等應(yīng)用該行為研究了大腦皮層對(duì)學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的調(diào)控[2]，但類似研究采用固定動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練，且國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域尚未有應(yīng)用該模型的研究報(bào)道。本研究通過配對(duì)呈現(xiàn)條件刺激(CS)與獎(jiǎng)賞性非條件刺激(US)，成功建立了大鼠飲水獎(jiǎng)賞條件反射，為我們后續(xù)研究條件反射的神經(jīng)機(jī)制提供了有效模型，現(xiàn)將大鼠飲水獎(jiǎng)賞條件反射訓(xùn)練裝置和訓(xùn)練結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SD大鼠20只，雄性，體重約250～300 g，聽力靈敏、嗅覺正常，無明顯耳鼻疾病，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)行單籠飼養(yǎng)，飲食自由，飼養(yǎng)溫度在25 ℃左右，保持環(huán)境干燥通風(fēng)。該實(shí)驗(yàn)于每日9：00～15：00進(jìn)行。大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為配對(duì)組和假配對(duì)組各10只，兩組月齡、體重等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 飲水自動(dòng)訓(xùn)練裝置和訓(xùn)練模式示意圖 a：大鼠在密閉隔音暗箱內(nèi)接受飲水獎(jiǎng)賞條件反射行為訓(xùn)練的模式圖。b：刺激間隔為1500 ms飲水獎(jiǎng)賞條件反射行為訓(xùn)練模式的CS、US的記錄曲線。c：紅外發(fā)射及接收裝置模式圖

1.2 方法 所有大鼠于實(shí)驗(yàn)開始前48小時(shí)進(jìn)行限制飲水，即僅于每日16：00時(shí)給予5分鐘的自由飲水，以保持基本飲水需求并制造次日訓(xùn)練過程的饑渴感，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。飲水條件反射訓(xùn)練前3日，每天將大鼠放入訓(xùn)練箱內(nèi)自由活動(dòng)1小時(shí)，不給予任何CS及US，以適應(yīng)訓(xùn)練環(huán)境。條件訓(xùn)練在密閉隔音暗箱(30 cm×43 cm×35 cm)中進(jìn)行，環(huán)境聲級(jí)為45 dB左右，以2000 Hz、90 dB、500 ms的純音作為CS，以飲水條件反射自動(dòng)訓(xùn)練裝置瞬時(shí)性給予的水滴作為US，每次約20 μl。通過本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的紅外發(fā)射及接收裝置探察大鼠飲水舌尖對(duì)發(fā)光二極管光路的阻斷效應(yīng)，通過接收二極管將該效應(yīng)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，作為大鼠的飲水反應(yīng)活動(dòng)(圖1a)。通過RM6240生理記錄儀(圖1b)對(duì)該信號(hào)進(jìn)行記錄，并同步記錄每次訓(xùn)練過程中的聲音和水滴標(biāo)記。

配對(duì)組的訓(xùn)練分為適應(yīng)期3天、配對(duì)期10天和消退期5天；假配對(duì)組則為適應(yīng)期3天、假配對(duì)試驗(yàn)10天和消退期5天。訓(xùn)練次數(shù)均為100次/天。適應(yīng)訓(xùn)練是指僅給予CS而不給予US的訓(xùn)練模式，旨在盡量減小因CS而引起的驚嚇反應(yīng)，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。假配對(duì)訓(xùn)練是指系統(tǒng)通過隨機(jī)的方式呈現(xiàn)CS和US，二者間的呈現(xiàn)間隔2～10 s變化，目的在于使CS與US之間的關(guān)聯(lián)性降到最小。配對(duì)訓(xùn)練是指在CS結(jié)束后1500 ms呈現(xiàn)一個(gè)固定的US，每次配對(duì)訓(xùn)練間隔40～50 s(圖1c)；在消退期，僅給予大鼠CS而并不給予任何US。在CS結(jié)束后1500 ms內(nèi)，大鼠在聽見聲音后做出飲水動(dòng)作稱為一次條件性飲水反應(yīng)，大鼠的飲水習(xí)得率(CR%)=一天訓(xùn)練總條件性飲水反應(yīng)次數(shù)/100×100%，飲水潛伏期為CS起點(diǎn)與條件性飲水反應(yīng)開始時(shí)刻之間的時(shí)間間隔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析、拆分單因素方差分析，以及LSD posthoct檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 條件化飲水反射訓(xùn)練中的參數(shù)變化 配對(duì)組大鼠可以習(xí)得條件化飲水反射，其CR%高于假配對(duì)組，潛伏期低于假配配對(duì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。配對(duì)組訓(xùn)練期第一天CR%為(5.3±4.97)%，且隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而增加，第七天為(60.7±11.15)%，明顯高于第一天(P< 0.05)，之后維持在60%以上高水平。配對(duì)組第一天潛伏期為(1094.73±605.1)ms，且隨訓(xùn)練時(shí)間的增加而下降，于第七天下降至(479.63±275.92)ms，明顯低于第一天，后維持在400 ms以下。而在假配對(duì)組，大鼠未能習(xí)得條件化飲水反射，且習(xí)得率始終保持在較低水平(< 30%)。

圖2 兩組大鼠訓(xùn)練期條件化飲水的參數(shù)變化 a：CR%；b：潛伏期

2.2 消退期參數(shù)變化 消退期中，配對(duì)組大鼠的CR%和潛伏期有明顯的時(shí)間效應(yīng)。第一天CR%為(61.2±9.704)%，并隨消退訓(xùn)練時(shí)間增加而逐步遞減，至第3天為(9.9±3.84)%，明顯低于第一天，并維持在10%以內(nèi)低水平；第一天潛伏期為(323.39±144.05)ms，并隨訓(xùn)練時(shí)間的增加而增長，至第三天為(907.87±265.39)ms，并始終維持在1000 ms以上的高水平。非配對(duì)組大鼠的CR%和潛伏期無明顯的時(shí)間效應(yīng)(P> 0.05)。見圖3。

圖3 兩組消退期CR%隨訓(xùn)練時(shí)間的變化

3 討論

作為經(jīng)典式條件反射行為，眨眼條件反射、恐懼條件反射都是常用的聯(lián)合型學(xué)習(xí)記憶模型，聯(lián)合學(xué)習(xí)指?jìng)€(gè)體對(duì)不同時(shí)間發(fā)生的事件進(jìn)行聯(lián)系并從行為上表達(dá)出來。眨眼反射是一種聯(lián)合性運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)，其基本神經(jīng)環(huán)路集中在腦干和小腦環(huán)路[3～5]，并且具有同側(cè)小腦依賴性[6]，但是眨眼反射行為模型容易受到自發(fā)眨眼和驚嚇眨眼的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。恐懼性條件反射屬于情緒性學(xué)習(xí)，分為線索式和場(chǎng)景式兩類，但其中樞都位于杏仁核[7～9]。作為操作式條件反射行為，條件化飲水反射的建立在國外已有報(bào)道，它作為一種實(shí)用的復(fù)合聯(lián)想型學(xué)習(xí)行為模型在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但多是利用固定動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練[2]，對(duì)于采用自由活動(dòng)動(dòng)物建立條件化飲水反射及其行為習(xí)得規(guī)律未見具體研究報(bào)道。

本文結(jié)果提示自由活動(dòng)大鼠在配對(duì)給予CS與US的第七日可習(xí)得條件化飲水反射，但在CS與US間隔時(shí)間隨機(jī)的假配對(duì)實(shí)驗(yàn)中自由活動(dòng)大鼠卻無法習(xí)得該行為，提示配對(duì)組大鼠的飲水反應(yīng)是一種聯(lián)合性學(xué)習(xí)。Santiago Jaramillo以固定的大鼠訓(xùn)練其飲水條件反射，發(fā)現(xiàn)在聲音頻率為14 kHz時(shí)，其CR%為50%，在聲音頻率為31 kHz時(shí)，其CR%為84%[10]，提示高頻率聲音有利于大鼠飲水反射的習(xí)得，在本研究中采用的聲音頻率為2000 Hz，大鼠CR%最高可達(dá)67.4%，且平均維持在60%左右，可見條件化飲水反射的習(xí)得過程對(duì)于CS的需求有很寬的頻閾。本研究中CR%低于文獻(xiàn)報(bào)道的80%～90%，除了CS頻率較低的原因之外，也有可能與自由活動(dòng)的大鼠在聽到聲音CS后，有時(shí)沒有足夠時(shí)間到達(dá)給水口有關(guān)，因CS-US有效總間隔僅為2000 ms，實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠有時(shí)接觸到給水口已經(jīng)在US呈現(xiàn)后。因此，適當(dāng)延長CS-US應(yīng)該可以提高CR%，另外Teresa E以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立飲水條件反射研究研究吞咽功能，其CR%可達(dá)80%[11]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。

大鼠條件化飲水反射行為的習(xí)得非常迅速，在第七天的訓(xùn)練后基本可達(dá)到60%以上水平，潛伏期也降至500 ms內(nèi)，而且消退也同樣迅速，在第三天迅速降至10%以內(nèi)，與眨眼條件反射習(xí)得和消退所需的時(shí)間相似，但是明顯長于恐懼性條件反射。對(duì)于不同的聯(lián)合性學(xué)習(xí)類型的習(xí)得和消退所需的時(shí)間差異及其神經(jīng)機(jī)制是值得深入探討的問題。

就技術(shù)細(xì)節(jié)而言，該模型建立的主要難點(diǎn)在于獎(jiǎng)賞性US的量的控制。當(dāng)水量過小時(shí)，動(dòng)物對(duì)CS與US的敏感性降低，有時(shí)對(duì)二者產(chǎn)生不易產(chǎn)生聯(lián)系；當(dāng)水量過大時(shí)，動(dòng)物有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非觸發(fā)式飲水，即不通過給水噴頭獲取飲用水，轉(zhuǎn)而利用水滴直接滴落在口腔的“接飲”式飲水。不管是水量過小還是過大，都將影響到行為訓(xùn)練的進(jìn)展和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，所以如何將水流量控制在最佳水平是該模型成功的關(guān)鍵。

條件化飲水獎(jiǎng)賞反射行為涉及復(fù)雜的神經(jīng)機(jī)制，該模型的建立為探討操作式條件反射以及復(fù)雜學(xué)習(xí)記憶行為的中樞機(jī)制打下了基礎(chǔ)。由于該行為涉及高級(jí)覺察功能，未來應(yīng)針對(duì)前額葉、海馬等腦區(qū)對(duì)于該行為的影響及其中樞通路機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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The establishment of rat’s drinking water reward conditioned reflex and its acquisition characteristics

ZHANG Xin1，WU Guang-yan2，HOU Bei-bei1，LIU Wen-xian1，YU Qian3

(1.Sichuan Medical University，Luzhou 646000，China；2.Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；3.Rehabilitation Department，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

YUQian

Objective To establish the drinking water reward conditioned reflex on freely moving rats for analyzing its establishment and fading characteristics.Methods Twenty adult male rats were divided into paired group and non-paired group，10 in each group.The paired group was treated with voice as conditioned stimulus and given the water droplets as reward unconditioned stimulus in a fixed time interval.The non-paired group was also treated with voice as conditioned stimulus and given the water droplets as reward unconditioned stimulus in a random time interval.Their drinking reaction was detected through an infrared transmitter and receiver.The acquisition and incubation period of drinking reaction was surveyed by using multi-channel recorder.The acquisition rate and incubation time were compared between the two groups.Results Acquisition of conditioned reflex during drinking reward was founded in the paired group and maintained a high level with more than 60% acquisition rate after 7 days training.With increasing of training time，the response latency period was reduced.In fade test，acquisition rate dropped rapidly and keep a low level under 10%.Acquisition of conditioned reflex during drinking reward was not founded in the non-paired group and maintained a low level of within 20% acquisition rate.Conclusion The drinking water reward conditioned reflex can be built on freely moving rats and it will disappear after they complete the acquisition.

Drinking water reflection； Rat； Acquisition rate； Incubation

四川省科技廳科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2014JY0032)

余 茜

R338.61

A

1672-6170(2016)02-0057-04

2015-12-24；

2016-01-08)