氯霉素對費氏弧菌0～24 h的Hormesis效應(yīng)及其機制初探

于　巖， 游瑞容,， 姚志峰， 林志芬

(1．福州大學 材料科學與工程學院，福建 福州 350108； 2．同濟大學 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

?

氯霉素對費氏弧菌0～24 h的Hormesis效應(yīng)及其機制初探

于巖1， 游瑞容1,2， 姚志峰2， 林志芬2

(1．福州大學 材料科學與工程學院，福建 福州 350108； 2．同濟大學 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

摘要：為了探究抗生素對發(fā)光菌的Hormesis效應(yīng)，選擇費氏弧菌(Vibrio fischeri, V.fischeri)為受試生物，氯霉素為研究對象，測定了0～24 h下氯霉素對V.fischeri的發(fā)光強度(Hv)及生長量(OD600)的作用，探討氯霉素對V.fischeri的低濃度促進效應(yīng)及其可能機制.結(jié)果表明，氯霉素對V.fischeri的發(fā)光強度具有明顯的促進作用，且僅出現(xiàn)在細菌生長的延滯期.根據(jù)V.fischeri的發(fā)光機制，結(jié)合Gaussian量子化學計算結(jié)果，即氯霉素的最正氫電荷為0.244，遠大于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的最正氫電荷0.135，提出氯霉素通過提供質(zhì)子促進熒光反應(yīng)，進而產(chǎn)生Hormesis效應(yīng)的可能機制.

關(guān)鍵詞：Hormesis； Vibrio fischeri； 氯霉素； 暴露時間

Hormesis效應(yīng)，即低劑量刺激效應(yīng)是一種區(qū)別于傳統(tǒng)毒理學劑量-效應(yīng)關(guān)系的特殊現(xiàn)象[1]，Southam和Ehrlich[2]在1943年研究紅雪松提取物對真菌的作用時發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，并將其定名為Hormesis現(xiàn)象.此后，越來越多與Hormesis效應(yīng)相關(guān)的文章被報道.然而，研究人員對Hormesis效應(yīng)的研究主要集中在對其現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)上，對其發(fā)生促進的研究尚且不足，因此，對Hormesis效應(yīng)的低濃度促進作用及其機制的研究顯得尤為重要.

研究表明，Hormesis的產(chǎn)生和刺激程度除了受劑量的影響以外，還與化合物在生物體中的暴露時間相關(guān).Zhang[3]研究溴化物對青?；【腍ormesis效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，溴化物的側(cè)鏈長短和暴露時間是影響Hormesis效應(yīng)的主要原因，其中暴露時間越長，Hormesis效應(yīng)越大.因此，對不同暴露時間下產(chǎn)生的Hormesis效應(yīng)研究更加有利于加深對Hormesis及其機制的認識.

費氏弧菌(Vibriofischeri,V.fischeri)作為一種典型的發(fā)光菌[4-5]，在毒性評價中具有快速，靈敏，廉價等優(yōu)點.前期研究發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素在低濃度下對V.fischeri的發(fā)光具有促進作用，并且提出該促進作用與發(fā)光菌的群體感應(yīng)相關(guān)[6-8].本文以V.fischeri為測試生物，氯霉素抗生素為研究對象，測定了氯霉素對V.fischeri的0～24 h的毒性效應(yīng)，分別以發(fā)光和OD600作為測試終點進行毒性表征，結(jié)合V.fischeri在實驗條件下的生長和發(fā)光強度曲線，分析氯霉素在不同暴露時間下對V.fischeri的毒性作用.借助Gaussian計算等手段，進一步探討了氯霉素對V.fischeri產(chǎn)生Hormesis效應(yīng)的可能機制，其相應(yīng)Hormesis效應(yīng)的測定及其機制的研究可為其在環(huán)境生態(tài)風險評價工作提供研究基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1試劑與儀器

本實驗用氯霉素，Chemical Abstracts Service(CAS)號為56-75-7，購自Sigma-Aldrich化學制品有限公司(St.Louis,MO,USA)，結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1　氯霉素的化學結(jié)構(gòu)

費氏弧菌凍干粉購自中國科學院微生物研究所，參照菌種供應(yīng)商提供的培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基.

所用儀器及軟件：化學發(fā)光免疫分析儀(BHP9507，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)、高壓蒸汽滅菌器、精密電子天平(BT25S，德國Sartorius公司)、電子pH計(PH510，美國OAKTON公司)、潔凈工作臺、全自動新型生化培養(yǎng)箱(ZSD-1430，上海智城分析儀器制造有限公司)、恒溫培養(yǎng)振蕩器、超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風干燥箱、混勻小精靈，Gaussian 09等.

1.2毒性測定方法

1.2.1工作菌液的配制

將斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第三代的菌種轉(zhuǎn)接入盛5 mL液體培養(yǎng)基的小錐形瓶中，在22 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，成為搖瓶菌液.取搖瓶菌液200 μL到40 mL質(zhì)量分數(shù)為2%(下同)的NaCl溶液中，維持菌群密度約為104個·mL-1，磁力攪拌40 min以調(diào)節(jié)發(fā)光菌生長基本同步，制成工作菌液.

1.2.2毒性試驗

本文取待測化合物用適量二甲基亞砜(DMSO)配制成標準溶液，Hormesis效應(yīng)的濃度范圍具有一定規(guī)律[9]，因此，實驗時用2% NaCl稀釋成對數(shù)梯度系列.本文設(shè)計濃度為7.01×10-6～2.81×10-5mol·L-1之間取等對數(shù)濃度梯度的12個濃度點，分別取80 μL至96孔板中，同時加入80 μL液體培養(yǎng)基和40 μL工作菌液，并以不加化合物的2%的NaCl溶液作為對照，每個濃度梯度點設(shè)置3個平行試樣.在混勻小精靈以1 000 r·min-1的速度震蕩30 s后，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在20 ℃下，以180 r·min-1的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng).每2 h使用多功能酶標儀讀取費氏弧菌的發(fā)光強度(Hv)和生長量(OD600).

1.3毒性數(shù)據(jù)的處理

化合物對受試生物的抑制率是表征化合物毒性的一般方法，因此，氯霉素對V.fischeri發(fā)光的毒性作用用發(fā)光抑制率表征，計算如下：

(1)

式中：IHv為以發(fā)光強度作為測試終點時的抑制率；Li為第i個測試樣的發(fā)光值；L0為對照組平均發(fā)光值.

氯霉素對V.fischeri生長的毒性作用由OD600抑制率表征，計算如下：

(2)

式中：IOD600為以O(shè)D600作為測試終點時的抑制率；Oi為第i個測試樣的OD600值；O0為對照組平均OD600值.

1.4Gaussian計算

Gaussia量子化學計算軟件是目前應(yīng)用最為廣泛的計算化學軟件之一.本文利用Gaussian 09中的freq/pm6方法計算化合物的量子化學參數(shù).

2結(jié)果與討論

2.1V.fischeri的生長曲線

V.fischeri在0～24 h內(nèi)的Hv和OD600的變化曲線如圖2所示.針對細菌的Hv生長曲線可知，V.fischeri在培養(yǎng)體系中，0～8 h處于生長延滯期，光值較低，呈下降趨勢，并在第8 h處于最低值，接著細菌培養(yǎng)漸漸進入對數(shù)生長期，光值開始急劇上升，直至16 h后，細菌進入生長平臺期，光值保持在較高水平.這一現(xiàn)象主要是因為V.fischeri發(fā)光受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[10-12]，其光強具有很強的細菌密度依賴性.結(jié)合V.fischeri的OD600生長曲線可知，0～8 h，細菌的密度較低，且上升緩慢，相應(yīng)的信號分子濃度也低，此時，V.fischeri的發(fā)光主要依靠單個細菌發(fā)光，因此V.fischeri的Hv處于一個較低并下降的趨勢，甚至不發(fā)光.8 h后，細菌生長進入對數(shù)生長期，細菌密度迅速上升，信號分子的濃度也明顯提高，當信號分子達到一定的閾值時，信號分子可啟動相應(yīng)靶基因編碼熒光素酶，從而調(diào)控發(fā)光細菌的光強，表現(xiàn)出光值明顯增大[13].處于平臺期的細菌密度大而且較穩(wěn)定，即信號分子的濃度保持在較高的范圍，因此，光值在平臺期也處于較高水平.可見，本次實驗所采用的V.fischeri在0～8 h處于細菌生長延滯期，8～16 h進入對數(shù)生長期，16～24 h處于生長平臺期.

圖2　發(fā)光菌0～24 h Hv和OD600的變化

2.2氯霉素對V.fischeri的Hormesis效應(yīng)

氯霉素對V.fischeri在0～24 h的劑量-效應(yīng)曲線如圖3、圖4所示.從圖3可以看出，氯霉素對V.fischeri的發(fā)光在4～8 h具有Hormesis效應(yīng)中的低濃度促進作用，并且在同一時間點對發(fā)光的促進作用隨著氯霉素的濃度增加而增加.隨著暴露時間的延長，抑制開始占主導(dǎo)地位，在10～14 h，不同濃度氯霉素對V.fischeri的光值強度抑制率近100%.此后，在18～24 h，低濃度的抑制率隨著時間的延長而下降，在同一時間點下呈現(xiàn)抑制率隨氯霉素濃度的增加而增加的傳統(tǒng)S型劑量-效應(yīng)關(guān)系.

然而，氯霉素對V.fischeri的生長(OD600)在0～24 h內(nèi)并沒有觀察到促進作用。如圖4所示，在0～8 h，氯霉素對V.fischeri生長的抑制保持在較低水平，均在20%以下.隨著暴露時間的增加，氯霉素對V.fischeri生長的抑制率先增加后減小，在同一時間點下，抑制率隨氯霉素濃度的增加而增加.

結(jié)合圖2，可知0～8 h細菌處于生長延滯期，細菌密度低，數(shù)量少，信號分子濃度低，因此，光值低且處于下降趨勢.此時，氯霉素進入細胞產(chǎn)生促進發(fā)光的現(xiàn)象，而對細菌生長并沒有表現(xiàn)出明顯抑制，所以氯霉素對發(fā)光的促進作用很可能是通過促進單個細菌發(fā)光實現(xiàn)，而且，隨著氯霉素濃度的增加，這種促進作用越發(fā)明顯.然而，當細菌進入對數(shù)生長期后，細菌密度增大，細菌發(fā)光主要有群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，發(fā)光強度增加[14]，氯霉素對單個細菌發(fā)光的促進作用被掩蔽，而對細菌生長的抑制作用占主導(dǎo)，進而表現(xiàn)出對光值的抑制作用.

2.3氯霉素對V.fischeri的Hormesis機制

作為廣譜抗生素的一種，氯霉素對革蘭氏陽性、陰性細菌均有抑制作用，主要作用于原核細胞內(nèi)核糖體50s亞基，阻礙肽鏈不能向新附著的氨基酸上轉(zhuǎn)移，使肽鏈延長受到抑制，同時能特異性阻止mRNA與核糖體的結(jié)合而影響蛋白質(zhì)合成[15].

V.fischeri的發(fā)光有多種物質(zhì)參與，發(fā)光的底物是黃素核苷酸和長鏈脂肪醛并有分子氧的參與，是一個由細菌熒光酶催化的氧化反應(yīng)[16].其簡略的反應(yīng)方程如下：

FMN+RCOOH+H

2

O+Hv

(3)

式中：FMNH2為還原型黃素核苷酸；RCHO為長鏈脂肪醛;O2為氧分子；RCOOH為相應(yīng)長鏈脂肪酸；FMN為黃素單核苷酸；Hv表示發(fā)射光子.

圖3　0～24 h以發(fā)光作為測試終點劑量效應(yīng)曲線

已有研究指出[17-19]，污染物能夠影響細胞內(nèi)的熒光素酶催化上述反應(yīng)，對發(fā)光菌的生長起到抑制作用.該反應(yīng)的氧化產(chǎn)物FMN能夠結(jié)合NADH提供的H而被還原重新生成FMNH2(如圖5所示)，使發(fā)光反應(yīng)能夠持續(xù)進行.通過Gaussian計算，NADH中提供的H的電荷為0.135，而氯霉素中的最正氫電荷的數(shù)值為0.244(圖5)，由于最正氫電荷越大，越容易失去，這表明氯霉素具有比NADH更容易為FMN提供用于發(fā)光所需質(zhì)子的潛力.因此，可以推測當反應(yīng)體系中加入氯霉素時，氯霉素能夠起到類似于NADH的還原作用，將FMN還原成FMNH2(圖5)，從而提高FMNH2的合成效率，進而促進細菌發(fā)光，并且氯霉素濃度越大，所提供的氫越多，促進作用越明顯.此后，隨著暴露時間的延長，細菌密度的增加，光值增大，氯霉素的對發(fā)光的促進作用被掩蔽，而對細菌的抑制作用被凸顯，其通過作用于核糖體50s亞基，從而起到抑制細菌生長，進而抑制發(fā)光.因此，氯霉素對V.fischeri的發(fā)光強度的作用表現(xiàn)為僅在生長延滯期具有Hormesis效應(yīng)中的促進作用，具體作用機制如圖5所示.抗生素Hormesis時間效應(yīng)及其機制的研究，一方面，為臨床抗生素的正確用藥提供更為合理的理論指導(dǎo)，另一方面，也為抗生素的生態(tài)風險評估提供了新的實踐依據(jù).

圖4　0～24 h以O(shè)D600作為測試終點的劑量效應(yīng)曲線

圖5　氯霉素對V.fischeri的Hormesis效應(yīng)機制圖

3結(jié)論

(1) 本文研究了氯霉素對V.fischeri的Hormesis效應(yīng)，結(jié)果表明Hormesis效應(yīng)隨著暴露時間的延長而變化.其中，氯霉素暴露后2～8 h細菌光值顯示出明顯的低濃度促進作用，促進作用均超過100%.結(jié)合細菌生長曲線推斷Hormesis的產(chǎn)生與其生長階段有關(guān).

(2) Gaussian計算結(jié)果顯示，氯霉素的最正氫電荷為0.244，NADH中的最正氫電荷為0.135，遠小于氯霉素中的最正氫電荷，表明氯霉素比NADH更容易提供H，促進V.fischeri的熒光反應(yīng)，因此當氯霉素提供的H相對較多時，便出現(xiàn)了Hormesis的促進現(xiàn)象.

參考文獻:

[1]Calabrese E J. Hormesis: a revolution in toxicology, risk assessment and medicine[J]. Embo Reports，2004，5(1)：37.

[2]Southam C M, Ehrlich J. Decay resistance and physical characteristics of wood[J]. Journal of Forestry，1943，41：666.

[3]Zhang J. The time-dependent hormetic effects of 1-alkyl-3-methylimidazolium chloride and their mixtures on vibrio qinghaiensis sp. -Q67[J]. Journal of Hazardous Materials，2013，259(6)：70.

[4]黃正, 王家玲. 發(fā)光細菌的生理特性及其在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境科學，1995，16(3)：87.

HUANG Zheng, WANG Jialing. Physiological characteristics of luminescent bacteria and its application in environmental monitoring[J]. Environmental Science，1995，16(3)：87.

[5]陳繼紅, 王富生, 舒易強, 等. 發(fā)光細菌法在水質(zhì)綜合毒性在線檢測中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境工程學報，2013，7(10)：4144.

CHEN Jihong, WANG Fusheng, SHU Yiqiang,etal. Application of luminous bacteria method in online test for comprehensive toxicity of water quality[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering，2013，7(10)：4144.

[6]Zou X, Lin Z, Deng Z,etal. The joint effects of sulfonamides and their potentiator on photobacterium phosphoreum: differences between the acute and chronic mixture toxicity mechanisms[J]. Chemosphere，2011，86(1)：30.

[7]安情情, 姚志峰, 顧宇菲, 等. 磺胺類抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對發(fā)光菌的聯(lián)合毒性及其機制初探[J]. 環(huán)境化學，2014，33(12)：2068.

AN Qingqing, YAO Zhifeng, GU Yufei,etal. A novel probe of joint effects and mechanisms: binary toxicity of sulfa antibiotics and quorum sensing inhibitors to vibrio fischeri[J]. Environmental Chemistry，2014，33(12)：2068.

[8]Deng Z, Lin Z, Zou X,etal. Model of hormesis and its toxicity mechanism based on quorum sensing: a case study on the toxicity of sulfonamides to photobacterium phosphoreum[J]. Environmental Science & Technology，2012，46(14)：7746.

[9]Calabrese E J. Critical review hormesis: why it is important to toxicology and toxicologists[J]. Environmental Toxicology and Chemistry，2008，27(7)：1451.

[10]Christopher M W, Bonnie L B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，2005，21(5)：319.

[11]Qin N, Callahan S M, Dunlap P V,etal. Analysis of LuxR regulon gene expression during quorum sensing in vibrio fischeri[J]. Journal of Bacteriology，2007，189(11)：4127.

[12]Kurvet I, Ivask A, Bondarenko O,etal. LuxCDABE-transformed constitutively bioluminescent escherichia coli for toxicity screening: comparison with naturally luminous vibrio fischeri[J]. Sensors，2011，11(8)：7865.

[13]Nealson K H, Platt T, Hastings J W. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system[J]. Journal of Bacteriology，1970，104(1)：313.

[14]Miyashiro T, Ruby E G. Shedding light on bioluminescence regulation in vibrio fischeri[J]. Molecular Microbiology，2012，84(5)：795.

[15]呂順, 錢鑫萍, 范遠景, 等. 氯霉素細胞毒性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(20)：8472.

LV Shun, QIAN Xinping, FAN Yuanjing,etal. Experiment on cytotoxicity detection of chloramphenicol[J]. Journal of Anhui Agriculture Science，2008，36(20)：8472.

[16]Haggerty C, Jablonski E, Stave L,etal. Continuous monitoring of reactions that produce NADH and NADPH using immobilized luciferase and oxidoreductases from beneckea harveyi[J]. Anal Biochem，1978，88(1)：162.

[17]王晶. 細菌熒光素酶-NADH：FMN氧化還原酶體系與IMS聯(lián)用進行水產(chǎn)品致病菌的快速檢測[D]. 青島：中國海洋大學，2009.

WANG Jin. Rapid detection of pathogenic bacteria in fishery products by IMS combined with luciferase-NADH: FMN oxidoreductase system[D]. Qingdao：Ocean University of China，2009.

[18]Meighen E A, Li Z. The turnover of bacterial luciferase is limited by a slow decomposition of the ternary enzyme-product complex of luciferase, FMN, and fatty acid[J]. The Journal of Biological Chemistry，1994，269(9)：6640.

[19]吳泳標, 張國霞, 許玫英, 等. 發(fā)光細菌在水環(huán)境生物毒性檢測中應(yīng)用的研究進展[J]. 微生物學通報，2010，12(8)：1222.

WU Yongbiao, ZHANG Guoxia, XU Meiying,etal. Advance in the application of luminescent bacteria on inspecting ecotoxicity in water[J]. Microbiology China，2010，12(8)：1222.

Chloramphenicol Hormesis Effects About Time-Dependent and Mechanism onVibriofischeri

YU Yan1, YOU Ruirong1,2, YAO Zhifeng2, LIN Zhifen2

(1. College of Materials Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China; 2. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Research, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Abstract：In order to reveal the Hormesis effect of antibiotics on bacterial, the adverse effects of chloramphenicol on the luminescence and cell proliferation (0 to 24 h) of Vibrio fischeri (V.fischeri) were investigated. It was found that an obvious stimulation effect at the low concentration would occur on the luminescence intensity at the lag phase of V.fischeri under the action of chloramphenicol. A possible mechanism hypothesis of the stimulation effect was then proposed, based on the light emitting mechanisms and the quantum chemical parameters calculated by Gaussian 09. It was supposed that because of a higher value of the most positive charge of the H atoms of chloramphenicol than NADH, chloramphenicol could act as proton donors to provide protons which were essential for the light emitting process, instead of NADH, and stimulated the light emitting of the bacteria.

Key words：Hormesis; Vibrio fishcheri; chloramphenicol; time-dependent

收稿日期：2015-10-23

基金項目：同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室自主研究項目(PCRRY11003)；國家自然科學基金(51472050，201177092，21377096, 21577105)；同濟大學英才(攀登)計劃(0400219287)

中圖分類號：X502

文獻標志碼：A

第一作者： 于巖(1972—)，女，教授，博士生導(dǎo)師，工學博士，主要研究方向為生態(tài)環(huán)境材料.E-mail: yuyan@fzu.edu.cn