MRSA對(duì)巨噬細(xì)胞系RAW264.7自噬的影響

朱軍　吳本權(quán)　楊洋　朱家馨　張?zhí)焱?/p>

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)科ICU

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MRSA對(duì)巨噬細(xì)胞系RAW264.7自噬的影響

朱軍吳本權(quán)楊洋朱家馨張?zhí)焱?/p>

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)科ICU

【摘要】目的探討耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染對(duì)于巨噬細(xì)胞自噬的影響。方法以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對(duì)象，以革蘭陽(yáng)性菌MRSA感染3 h組作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立空白對(duì)照組(對(duì)照組)，另設(shè)MRSA感染0、30、60、120、150、180 min組。以MRSA感染細(xì)胞后，熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因5(ATG5)、ATG7、ATG12的表達(dá)情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1及微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達(dá)情況。結(jié)果感染MRSA 3 h后，實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞中ATG5、ATG7、ATG12的mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P均<0.01)，LC3蛋白相對(duì)表達(dá)量也比對(duì)照組增加(P<0.01)，2組間Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ATG7、ATG12 mRNA和LC3及Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均在感染MRSA 180 min組最高，ATG5 mRNA在感染MRSA 150 min組最高。結(jié)論MRSA可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，自噬基因激活存在先后順序，自噬可能為巨噬細(xì)胞吞噬胞外菌MRSA的另一種免疫滅活形式。

【關(guān)鍵詞】耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；巨噬細(xì)胞；自噬

自噬是與真核生物關(guān)系密切的基礎(chǔ)生理過程，通過細(xì)胞自我消化累積的蛋白質(zhì)細(xì)胞器等各類復(fù)雜的細(xì)胞質(zhì)成分，從而調(diào)節(jié)控制真核生物細(xì)胞內(nèi)成分的數(shù)量與質(zhì)量。現(xiàn)今，已有自噬與各種疾病的關(guān)系研究[1]。隨著近年研究的逐步深入，巨噬細(xì)胞的自噬對(duì)于清除胞內(nèi)病原體有何重要作用逐漸受到關(guān)注[2-3]。自噬的作用機(jī)制在肺部疾病中，尤其在COPD、特發(fā)性肺纖維化、肺結(jié)核等疾病中已有較透徹的研究[4]。關(guān)于自噬與肺部感染性疾病，如胞外菌感染的研究仍較少。近年，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)已成為引起醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)相關(guān)性感染的重要致病菌之一，其治療形式較為嚴(yán)峻[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以清除某些胞內(nèi)菌，如李斯特菌、沙門菌和結(jié)核分枝桿菌[6]。對(duì)于胞外菌MRSA感染細(xì)胞，巨噬細(xì)胞除吞噬外能否產(chǎn)生自噬的相關(guān)研究仍較少。本研究以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7為對(duì)象，觀察自噬在MRSA肺部感染中的作用，旨在探討MRSA感染巨噬細(xì)胞對(duì)其自噬功能的影響。

材料與方法

一、材料

1. 細(xì)胞系及菌株

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；MRSA菌株為由我院呼吸科實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的臨床菌株。

2. 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Life公司，Syber Green Mix實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Life公司。LC3多克隆兔抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Beclin1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，內(nèi)參抗體β-actin兔一抗購(gòu)于中國(guó)谷歌生物公司，辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于廣州威佳科技有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州聚研生物科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)6孔板購(gòu)于美國(guó)Corning公司。凱基全蛋白提取試劑盒及凱基BCA法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州杰特偉生物科技有限公司，蛋白質(zhì)印跡法配膠成分30%聚丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液、過硫酸銨(APS)購(gòu)于廣州威佳科技有限公司，蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 ml的透氣蓋培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)將細(xì)胞傳代，平均約2～3 d傳代1次，保持實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞狀態(tài)良好，在普通光學(xué)顯微鏡下折光度透亮，未見大量顆粒及細(xì)胞碎片。

2. 細(xì)菌培養(yǎng)

將凍存于-80℃的MRSA菌種在室溫下解凍后，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃溫箱培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定其在600 nm處吸光度(OD600) ，當(dāng) OD600=0.6，即約1×109/ml時(shí)，置于16%甘油在-80℃凍存。

3. MRSA感染細(xì)胞

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞按1×106/ml的密度接種于6孔板，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液2 ml，培養(yǎng)過夜，待每孔細(xì)胞數(shù)增至2×106時(shí)開始感染，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按細(xì)菌∶細(xì)胞=10∶1將MRSA加入培養(yǎng)板中感染細(xì)胞。第一部分的實(shí)驗(yàn)分為2組：空白處理作為對(duì)照組，MRSA感染作為實(shí)驗(yàn)組。第二部分的實(shí)驗(yàn)為MRSA刺激時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)：將細(xì)胞均勻種于6孔板中，共分7組，第1組為對(duì)照組、第2組加入MRSA作用30 min、第3組加入MRSA作用60 min，組間相隔30 min，以此類推，第7組MRSA作用時(shí)間為180 min。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值作為結(jié)果。

4. ATG mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用熒光定量PCR(qPCR)法：根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)的ATG基因序列，分別設(shè)計(jì)ATG5、ATG7、ATG12特異性引物，由美國(guó)Life公司合成，引物序列見表1。收集上述各組細(xì)胞，在6孔板每孔加入1 ml Trizol提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行模板DNA第一鏈合成，然后加入10 μl Syber Green混合物，反應(yīng)體系總體積20 μl，采用ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：50℃ 2 min，95℃ 2 min預(yù)變性，95℃15 s變性，60℃1 min退火，共40個(gè)循環(huán)，95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s延伸。反應(yīng)后得到溶解曲線，記錄目的基因與內(nèi)參基因達(dá)到某一閾值的Ct值，將目的基因與內(nèi)參基因Ct值進(jìn)行比較后再與對(duì)照組比較，計(jì)算ATG mRNA相對(duì)表達(dá)量：ATGmRNA=2-ΔΔCt。

5. 自噬相關(guān)蛋白Beclin1及微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)表達(dá)水平的檢測(cè)

MRSA感染細(xì)胞后，收集細(xì)胞加入現(xiàn)配的蛋白裂解液(每孔50 μl)，用細(xì)胞刮刮取蛋白，收集混合液于4℃以12 000 r/min離心15 min，收集上清液，于562 nm波長(zhǎng)下用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，加入5倍體積蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，-80℃保存。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳法，下層12%分離膠，上層5%濃縮膠，蛋白上樣量20 μg，85 V恒壓電泳，待蛋白標(biāo)記物分出條帶后，將電壓調(diào)為110 V，當(dāng)電泳至條帶接近底端時(shí)，停止電泳，260 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據(jù)預(yù)染蛋白標(biāo)記物，剪下不同的目的蛋白于濕盒內(nèi)孵育，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次洗10 min，一抗稀釋比例LC3為1∶1 000、Beclin1為1∶2 000、β-actin為1∶2 000，4℃過夜后，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h(稀釋比例為1∶2 000) ，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 mim，ECL發(fā)光液A液、B液等體積混合后敷于蛋白膜上，于Chemi Scope化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，運(yùn)用Image J軟件分析LC3(取LC-Ⅰ條帶)及Beclin1的蛋白灰度值，作為其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1　引物序列

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、感染MRSA 對(duì)RAW264.7細(xì)胞中ATG表達(dá)的影響

感染MRSA 3 h后，實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞的ATG5、ATG7、ATG12的mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P均<0.01)，見表1。

表1　感染MRSA 3 h后RAW264.7細(xì)胞中

二、感染MRSA不同時(shí)間點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞中的ATG表達(dá)情況

感染MRSA不同時(shí)間點(diǎn)組的RAW264.7細(xì)胞中，ATG5、ATG7、ATG12 mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為36.551、41.073、19.662，P均<0.001)。其中ATG7、ATG12 mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染MRSA 180 min組最高，ATG5 mRNA相對(duì)表達(dá)量在感染MRSA 150 min組最高。180 min組的ATG7 mRNA表達(dá)水平為4.07±0.54，高于90 min組的2.08±0.01(t=9.025，P<0.001)；180 min組的ATG12 mRNA表達(dá)水平為3.54±0.46，高于90 min組的1.66±0.19(t=9.253，P<0.001)；150 min組的ATG5 mRNA表達(dá)水平為2.49±0.14，高于90 min組的1.83±0.25(t=2.650，P=0.024)，見圖1。

圖1　感染MRSA不同時(shí)間點(diǎn)后

三、 感染MRSA對(duì)RAW264.7細(xì)胞中LC3及Beclin1蛋白表達(dá)的影響

感染MRSA 3 h后，RAW264.7細(xì)胞中LC3蛋白相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組為48 523±12 692、對(duì)照組為7 450±1 550，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.692，P<0.001)； Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組為13 765±2 267、對(duì)照組為12 522±3 347，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.533，P=0.619)，見圖2。

四、感染MRSA不同時(shí)間點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞中LC3及Belin1蛋白的表達(dá)情況

感染MRSA不同時(shí)間點(diǎn)組的RAW264.7細(xì)胞中，LC3及Belin1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為5.235、3.938，P均<0.05)。LC3、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均在感染MRSA 180 min組最高。其中LC3蛋白相對(duì)表達(dá)量在180 min組為57 010±3 978，在60 min組為45 383±6 273，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.210，P=0.009)。Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量在180 min組為86 440±5 024、60 min組為70 685±2 776，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.273，P<0.001)，見圖3。

圖2　感染MRSA后RAW264.7細(xì)胞中LC3及Beclin1的表達(dá)情況

A：蛋白免疫印跡法結(jié)果；B：定量分析結(jié)果

圖3　感染MRSA不同時(shí)間點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞中LC3及Belin1蛋白的表達(dá)情況

A：蛋白免疫印跡法結(jié)果；B：定量分析結(jié)果

討論

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)重要組成部分，在外來(lái)病原體入侵機(jī)體時(shí)，可以通過吞噬等非特異性免疫作用來(lái)殺傷病原體，并且可以通過抗原提呈誘導(dǎo)特異性免疫進(jìn)一步殺死病原體。肺部感染性疾病中，巨噬細(xì)胞對(duì)于肺部的宿主防御功能必不可少，其能夠監(jiān)視暴露的氣道，調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫[7]。

自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)回收利用細(xì)胞質(zhì)成分的一種降解機(jī)制。自噬過程包括將長(zhǎng)壽命蛋白及胞內(nèi)較大體積的細(xì)胞器成分隔離進(jìn)入雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，然后再運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解，降解后的成分重新用來(lái)供應(yīng)細(xì)胞能量及合成大分子的需要。因此，自噬被視為胞內(nèi)回收機(jī)制[8]。最早對(duì)于自噬分子機(jī)制的研究從酵母菌開始，隨后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自噬基因出現(xiàn)于高等真核生物，表明自噬是一種進(jìn)化高度保守的過程。在酵母菌中，自噬主要涉及適應(yīng)饑餓，在多細(xì)胞生物體內(nèi)，該途徑涉及多條通路，例如程序性細(xì)胞死亡、胞內(nèi)破損細(xì)胞器及沉積蛋白質(zhì)的清除等[9]。從整體上而言，自噬與多種病理生理過程相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性病變、感染等[10]。隨著研究的逐步深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)自噬與疾病的治療相關(guān)，已有研究證明自噬與腫瘤治療相關(guān)，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性[11]。與哺乳動(dòng)物自噬相關(guān)的基因統(tǒng)一命名為ATG。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬泡形成過程中，由ATG3、ATG5、ATG7、ATG10、ATG12和LC3參與組成的2條泛素樣蛋白加工修飾通路，在自噬過程起著至關(guān)重要的作用。LC3是酵母ATG8的類似物，當(dāng)LC3前體形成后，首先加工成胞漿可溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基，然后LC3-I被ATG7活化,轉(zhuǎn)移并被修飾成膜結(jié)合形式LC3-Ⅱ[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中LC3-Ⅰ較LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增多，考慮是否由于自噬屬于動(dòng)態(tài)過程，LC3-Ⅱ已逐漸被溶酶體降解，故取LC3-Ⅰ條帶作定量分析。

近幾年，關(guān)于自噬與感染性疾病的研究逐漸增多[14]。金黃色葡萄球菌是可以引起人體從表皮感染至嚴(yán)重血源性感染等侵襲性感染的胞外菌，其感染率和患者病死率極高[15]。其中MRSA感染更為當(dāng)前臨床治療的難題。雖然經(jīng)典的研究證實(shí)，金黃色葡萄球菌是胞外菌，但其可逃避吞噬細(xì)胞的殺傷作用而存活于多種吞噬細(xì)胞中。更為嚴(yán)重的是，有研究顯示其可存活于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、甚至中性粒細(xì)胞中[16]。β-內(nèi)酰胺類和糖肽類抗菌藥均難以進(jìn)入上述免疫細(xì)胞，故治療失敗率高。因此，研究自噬對(duì)于胞內(nèi)生存的MRSA有何作用及其與吞噬的關(guān)系，對(duì)闡明胞外病原體滅活及其免疫逃避機(jī)制均有重要意義。

已有研究表明，在肺泡上皮細(xì)胞A549受到結(jié)核分枝桿菌、A型鏈球菌和銅綠假單胞菌感染時(shí)，自噬可以清除病原體，對(duì)機(jī)體起到清除病原體的保護(hù)作用[17]。另外，自噬對(duì)于結(jié)核分枝桿菌亦具有殺傷作用[18]。目前，對(duì)金黃色葡萄球菌入侵單核細(xì)胞系MEF及Hela 細(xì)胞系產(chǎn)生自噬已有相關(guān)研究[19]。本研究主要觀察MRSA感染巨噬細(xì)胞對(duì)自噬的影響，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞在感染MRSA后，ATG5、ATG7、ATG12 mRNA及LC3蛋白相對(duì)表達(dá)升高，從基因水平及蛋白質(zhì)水平證明感染MRSA可以激活巨噬細(xì)胞自噬，參與自噬過程的相關(guān)基因表達(dá)水平達(dá)峰時(shí)間不完全一致，表明自噬是一動(dòng)態(tài)過程，基因激活存在先后順序。但對(duì)于該類自噬的具體信號(hào)通路機(jī)制仍然未明，其是否與革蘭陰性菌內(nèi)毒素成分脂多糖誘導(dǎo)自噬過程類似，還是通過MRSA表面細(xì)胞壁某種成分誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬，對(duì)此仍需要進(jìn)一步研究[20]。另外， MRSA是否能夠逃避自噬，自噬能否起到免疫作用，對(duì)肺炎預(yù)后有何影響，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究[21]。

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Effect of MRSA on the autophagy of RAW264.7 macrophage cell line

ZhuJun,WuBenquan,YangYang,ZhuJiaqxin,ZhangTiantuo.

DepartmentofRespiratory，ICU，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,WuBenquan,E-mail:zswbq@163.com

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) infection upon the autophagy of macrophages. MethodsMouse monocyte-macrophage cell line RAW264.7 was used. In the experimental groups, RAW264.7 cells were infected with Gram-positive MRSA for different time points including 0, 30, 60, 90, 120, 150 and 180 min. In the control group, the cells were left untreated. After MRSA infection, the expression of ATG5, ATG7 and ATG12 was measured by fluorescence quantitative PCR, and the expression levels of autophagy-related protein (Beclin1) and microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) were measured by Western blot. ResultsAt 3 h after MRSA infection, the expression levels of ATG5, ATG7 and ATG12 mRNA in the experimental group were significantly higher compared with those in the control group (all P<0.01). The relative expression of LC3 in the experimental group was considerably higher than that in the control group (P<0.01), where the relative expression of Beclin1 did not significantly differ between two groups (P>0.05). The relative expression levels of ATG7, ATG12 mRNA, LC3 and Beclin1 proteins peaked at 180 min following MRSA infection, and the level of ATG5 mRNA achieved the peak at 150 min after MRSA infection. ConclusionsMRSA could induce autophagy in macrophages. The autophagy genes were activated in a certain sequence. Autophagy probably acted as an alternative immune process of phagocytosis of MRSA by macrophages.

【Key words】Methicillin-resistant staphylococcus aureus; Macrophage; Autophagy

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.008

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81170004)

(收稿日期：2015-11-22)(本文編輯：林燕薇)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，吳本權(quán)，E-mail:zswbq@163.com