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    纖維素類可吸收止血產(chǎn)品體外降解終點(diǎn)判斷的研究

    2016-06-20 01:58:49作者梅昕馬鳳森喻炎陳海波江滔浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院杭州市3004浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院杭州市3008
    中國(guó)醫(yī)療器械雜志 2016年2期
    關(guān)鍵詞:百分率紗布醫(yī)療器械

    【作者】梅昕,馬鳳森,喻炎,陳海波,江滔 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,杭州市,3004 浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院,杭州市,3008

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    纖維素類可吸收止血產(chǎn)品體外降解終點(diǎn)判斷的研究

    【作者】梅昕1,馬鳳森1,喻炎1,陳海波2,江滔1
    1 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,杭州市,310014
    2 浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)院,杭州市,310018

    【摘要】為了準(zhǔn)確、快速、有效地判斷可溶性止血產(chǎn)品的體外完全降解時(shí)間,對(duì)GB/T 16886標(biāo)準(zhǔn)中現(xiàn)行的失重法進(jìn)行了優(yōu)化,采用透析袋結(jié)合還原糖測(cè)試法,于3%過(guò)氧化氫溶液、37 ℃、150 rpm條件下進(jìn)行降解,第3 d、6 d、8 d、10 d、14 d取出透析袋,真空干燥測(cè)失重百分率,并測(cè)定了降解過(guò)程中透析袋外的還原糖累積含量,利用SPSS 22.0軟件以Pearson Correlation Coeffi cient法對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明失重百分率與還原糖累積含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.957,說(shuō)明二者高度相關(guān),驗(yàn)證了透析袋結(jié)合還原糖測(cè)試法評(píng)價(jià)體外降解終點(diǎn)的可行性。該方法也為其他類可溶性材料體外降解終點(diǎn)的判斷提供思路。

    【關(guān) 鍵 詞】可吸收止血產(chǎn)品;相關(guān)性;完全降解時(shí)間;體外降解

    0 引言

    可吸收止血產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于臨床及日常生活中,主要包括膠原和微纖維膠原、醫(yī)用止血明膠、氰基丙烯酸類組織膠、纖維蛋白類以及多糖類止血材料等[1]。其中微纖維膠原以及膠原纖維網(wǎng)、醫(yī)用止血明膠與纖維蛋白膠類止血產(chǎn)品具有動(dòng)物源性,患者可能發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[2],潛在使用風(fēng)險(xiǎn)較高;氰基丙烯酸類組織膠在降解過(guò)程中釋放氰和甲醛等有毒物質(zhì),容易引起炎癥反應(yīng)或不利傷口愈合[3]。而多糖類止血產(chǎn)品如纖維素類可吸收止血產(chǎn)品[4]具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、生物相容性好、不良反應(yīng)少等諸多優(yōu)勢(shì),成為當(dāng)前止血材料產(chǎn)品的研究熱點(diǎn)[5]。

    纖維素類可吸收止血產(chǎn)品目前存在的主要問(wèn)題是不能在合適的時(shí)間內(nèi)完全降解并吸收[6]。通過(guò)檢索美國(guó)FDA MAUDE數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)52例速即紗(纖維素類止血產(chǎn)品)不良反應(yīng)報(bào)告進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)由于感染和不完全吸收的原因約占不良反應(yīng)事件總數(shù)的60%[7]??晌罩寡a(chǎn)品降解速度過(guò)快容易引發(fā)局部的高滲壓和炎癥等不良反應(yīng);降解速度過(guò)慢會(huì)引發(fā)排異、包裹等一系列免疫反應(yīng)[7]。因此,理想的可吸收止血產(chǎn)品應(yīng)滿足合適的完全降解吸收時(shí)間。

    當(dāng)前,可吸收止血產(chǎn)品的完全降解吸收時(shí)間主要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得,但體內(nèi)研究應(yīng)考慮動(dòng)物保護(hù)[8],此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在個(gè)體差異、成本較高、操作困難等諸多缺陷。體外試驗(yàn)方法中,GB/T 16886標(biāo)準(zhǔn)[9]中用來(lái)初步評(píng)價(jià)材料降解性能的失重法,無(wú)法直接適用于像可吸收止血產(chǎn)品這類可溶性降解材料。因此,建立快速有效地判斷可吸收止血產(chǎn)品的完全降解吸收時(shí)間的方法很有必要[10]。

    1 材料和方法

    1.1主要材料、試劑及儀器

    材料 速即紗可吸收止血紗布(15.2 cm×22.9 cm,美國(guó)強(qiáng)生公司),透析袋(美國(guó)VISKASE公司,MD34 22MM,Mw:2000)

    試劑 30%過(guò)氧化氫,氫氧化鈉,酒石酸鉀鈉,3, 5-二硝基水楊酸,亞硫酸鈉,純化水

    儀器 漩渦混合器(XW-80A,上海精科實(shí)業(yè)有限公司);電子微量天平(FA1604S,上海天平儀器廠);多功能酶標(biāo)儀(Spectramax M2,美國(guó)分子儀器有限公司);調(diào)溫電熱器(TC-15,上海聯(lián)營(yíng)通州市申通電熱器廠);真空干燥機(jī)(DZG-6020,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);震蕩培養(yǎng)箱(BS-S,常州國(guó)華電器有限公司);冷凍干燥機(jī)(FreeZone 6,美國(guó)LABCONCO公司)

    1.2材料的稱量與降解

    剪取相同面積的速即紗15片和透析袋20片,分為A、B、C、D、E五組,并稱重。

    透析袋經(jīng)純水煮沸10 min后取出,前15只透析袋中放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的止血紗布,并加7 mL新配3%過(guò)氧化氫浸沒(méi),排除氣泡后,夾緊透析袋[11]。后5只透析袋加7 mL新配3%過(guò)氧化氫,作為空白對(duì)照。以上材料按編號(hào)分別置于20個(gè)250 mL燒杯中,再加120 mL新配3%過(guò)氧化氫,將燒杯口密封并置于震蕩培養(yǎng)箱,設(shè)置溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速150 rpm,保持14 d。同時(shí)每隔24 h透析袋外更換100 mL新配3%過(guò)氧化氫。

    1.3失重百分率的計(jì)算

    在第3 d、6 d、8 d、10 d、14 d分別取出A、B、C、D、E組,真空干燥至恒重,計(jì)算失重百分率[12],公式如下:

    式中:

    W-失重百分率,%;

    Wo-紗布原始重量,g;

    Wt-指定時(shí)間點(diǎn)紗布干燥后的重量,g。

    1.4還原糖含量的測(cè)定

    1.4.1DNS試劑的配制

    稱取96.028 0 g酒石酸鉀鈉,溶于250 mL純化水,加熱至45oC,再加3.160 7 g 3,5-二硝基水楊酸、131 mL氫氧化鈉(2 mol/L)溶液,溶解后加2.511 0 g苯酚和2.500 3 g亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后加純化水定容至500 mL,置棕色瓶中暗處保存7 d,備用[13]。

    1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    稱取0.100 g葡萄糖,純化水定容至100 mL,分別取0、20、30、50、60、70 μL于1.5 mL離心管,再加純化水至100 μL稀釋成濃度為0、0.2、0.3、0.5、0.6、0.7 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,再各加100 μL DNS試劑,混勻后沸水浴5 min,流水浴冷卻后分別向各離心管中加入800 μL純化水,混勻后各移取200 μL溶液于96孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)A540值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4.3還原糖含量的計(jì)算

    收集E組燒杯透析袋外1~14 d的降解液,冷凍干燥48 h后加10 mL純化水溶解,取100 μL于1.5 mL離心管中,再加100 μL DNS試劑,同“1.4.2”法操作,測(cè)吸光度值。計(jì)算還原糖濃度[14]及累積含量。

    1.5統(tǒng)計(jì)分析

    使用SPSS 20.0軟件,采用Pearson Correlation Coeffi cient法對(duì)第3 d、6 d、8 d、10 d、14 d的失重百分率和還原糖累積含量?jī)山M數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析[15]。

    2 結(jié)果

    2.1失重百分率的計(jì)算

    通過(guò)稱量紗布降解前后重量,采用公式(1)計(jì)算失重百分率,第3 d、6 d、8 d、10 d、14 d的失重百分率分別為62.02±2.23%、85.94±0.33%、89.35±1.62%、93.87±0.90%、98.64±0.83%。

    失重百分率隨時(shí)間變化的曲線如圖1所示。

    圖1 失重百分率隨時(shí)間的變化(n=3)Fig.1 The relationship between the percentage of weight loss and the time(n=3)

    2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

    如方法“1.4.2”所述,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:

    Y=0.841 82x-0.004 36, r=0.998 4 (2)

    2.3還原糖累積含量

    如方法“1.4.2”所述,測(cè)得E組每天降解液中還原糖的含量,從而計(jì)算出降解液中還原糖累積含量,第3 d、6 d、8 d、10 d、14 d結(jié)果分別為16.12±1.69 mg、29.87±2.20 mg、34.92±2.40 mg、38.54±2.98 mg、45.23±0.16 mg。

    還原糖累積含量隨時(shí)間變化的曲線如圖2所示。

    圖2 還原糖累積含量(n=3)Fig.2 Cumulative content of reducing sugar(n=3)

    2.4失重百分率與還原糖累積含量的相關(guān)性分析結(jié)果

    對(duì)失重百分率和還原糖累積含量進(jìn)行Pearson Correlation Coefficient分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關(guān)系數(shù)為0.957,在α=0.01水平(雙側(cè))顯著相關(guān)。

    3 討論

    (1) 本研究對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中的失重法進(jìn)行了優(yōu)化,首次采用透析袋與失重法結(jié)合的方法,失重百分率的RSD值均<5%,表明該方法的精密度良好。本課題組前期對(duì)另一生物技術(shù)有限公司出品的手術(shù)止血紗(纖維素類止血產(chǎn)品)采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了體外降解研究,其失重百分率的RSD值均<5%,說(shuō)明該方法可以適用于纖維素類可吸收止血產(chǎn)品體外降解終點(diǎn)的判斷。該方法從理論上具備了用于其他類可溶性材料(如:殼聚糖類可吸收止血產(chǎn)品[16])體外降解終點(diǎn)判斷的可行性,尚需對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。

    (2) 通過(guò)對(duì)還原糖累積含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,可以看出還原糖的累積增加量明顯小于紗布失去的質(zhì)量,說(shuō)明在紗布發(fā)生降解過(guò)程中,從透析袋中擴(kuò)散出去的小分子物質(zhì)可能部分是還原糖。降解產(chǎn)物復(fù)雜多樣,其種類和含量還需進(jìn)一步研究。

    (3) 本研究通過(guò)對(duì)失重百分率與還原糖累積含量進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)為0.957,結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)具有高度相關(guān)性。透析袋內(nèi)高分子材料在雙氧水的氧化作用以及水解作用下,分子鏈斷裂形成小分子物質(zhì)而從透析袋中滲透出去,使透析袋內(nèi)的紗布質(zhì)量減少。從圖1可以看出在第10 d透析袋內(nèi)紗布的失重百分率已經(jīng)趨于穩(wěn)定,同樣從圖2也可以看出透析袋外還原糖累積含量在第10 d時(shí)也趨于穩(wěn)定,說(shuō)明第10 d紗布基本降解結(jié)束,第14 d達(dá)到降解終點(diǎn)。對(duì)于體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性,還需進(jìn)一步研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

    4 結(jié)論

    本研究?jī)?yōu)化了失重法,較原有方法相比,該方法精密度良好,準(zhǔn)確度高,應(yīng)用范圍更加廣泛,可以用來(lái)準(zhǔn)確地判斷纖維素類可吸收止血產(chǎn)品體外降解終點(diǎn)。該方法對(duì)其他可溶性材料體外降解研究也有借鑒意義。

    參考文獻(xiàn)

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    Research of Determining Complete Degradation Time in Vitro Based on Cellulose Absorbable Hemostatic Products

    【W(wǎng)riters】MEI Xin1, MA Fengsen1, YU Yan1, CHEN Haibo2, JIANG Tao1
    1 College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, 310014
    2 Zhejiang Institute for the Control of Medical Device, Hangzhou, 310000

    【Abstract】To develop a method for determining complete degradation time of soluble hemostatic products in vitro with accuracy, high speed and effectiveness, the current weight loss method originated from GB/T 16886 serial standards was optimized by using dialysis bag combined with assay of reducing sugar. The degradation was carried out with 3% hydrogen peroxide solution, at 37 ℃, 150 rpm. The dialysis bags were taken out in the 3rd, 6th, 8th, 10th and 14th day, vacuum drying followed by percentage of weight loss testing. Cumulative content of reducing sugar in degradation solution out of dialysis bag was determined simultaneously. The correlation analysis was performed by SPSS 22.0 equipped with Pearson Correlation Coeffi cient. The correlation coeffi cient between percentage of weight loss and cumulative content of reducing sugar was 0.957, which illustrated high correlation with each other. Hence dialysis bag combined with assay of reducing sugar is capable of evaluating the degradation endpoint of soluble hemostatic products in vitro. The method also provides a way for the evaluation of degradation of other degradable biomaterials in vitro.

    【Key words】absorbable hemostatic products, correlation, complete degradation time, degradation in vitro

    【中圖分類號(hào)】R318.08

    【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

    doi:10.3969/j.issn.1671-7104.2016.02.015

    文章編號(hào):1671-7104(2016)02-0125-03

    收稿日期:2015-12-08

    作者簡(jiǎn)介:梅昕,E-mail: messi_power@126.com

    通信作者:馬鳳森,教授,E-mail: merrigen@126.com

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