鹽酸多西環(huán)素與土霉素對胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果研究

王德功，魏麗娟，楊國輝，劉 欣，吳聰明，賈國賓*

（1.河北遠征藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050041；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

鹽酸多西環(huán)素與土霉素對胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果研究

王德功1，2，魏麗娟1，2，楊國輝1，2，劉 欣1，2，吳聰明3，賈國賓1，2*

（1.河北遠征藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050041；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

為研究鹽酸多西環(huán)素、土霉素對胸膜肺炎放線桿菌的抗菌活性，本試驗采用微量肉湯稀釋法，對胸膜肺炎放線桿菌進行了體外藥敏試驗。結(jié)果顯示，鹽酸多西環(huán)素對胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，土霉素對胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，兩種藥物對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性相當(dāng)。結(jié)果表明，鹽酸多西環(huán)素和土霉素對胸膜肺炎放線桿菌具有良好體外抑菌作用。

鹽酸多西環(huán)素；土霉素；胸膜肺炎放線桿菌；體外抑菌試驗

多西環(huán)素（Doxycycline）與土霉素（Oxytetracycline）均屬于四環(huán)素類抗菌藥[1]，是臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗生素[2]。多西環(huán)素又名強力霉素、脫氧土霉素，具有抗菌活性和組織穿透力更強、生物利用度高、體內(nèi)分布廣、半衰期較長等優(yōu)點，在治療大腸桿菌病、沙門氏菌病、巴氏桿菌病及支原體感染等方面效果顯著[3]。土霉素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體、衣原體、立克次體等引起的感染有效，也可用于治療梨形蟲病、附紅細胞體病等[4]。

傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病，以急性出血和慢性纖維素性胸膜肺炎為特征，可造成患病豬死亡，在新進豬群中多呈急性爆發(fā)[5]。其發(fā)病率在10%以上，最急性型的死亡率可高達80%～100%[6]。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化的發(fā)展，傳染性胸膜肺炎已成為嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要細菌性傳染病之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失[7]。本試驗旨在通過觀察鹽酸多西環(huán)素及土霉素對胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌活性，為臨床藥物合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物 鹽酸多西環(huán)素（原料藥），含量84.50%，批號201312022，揚州聯(lián)博藥業(yè)有限公司。

土霉素（原料藥），含量 90.20%，批號：141401074，赤峰制藥股份有限公司。

1.1.2 對照藥物 鹽酸多西環(huán)素（標(biāo)準品），含量85.20%，批號130485-201202，購自中國食品藥品檢定研究院。

土霉素（對照品），含量91.30%，批號K0031208（K0031208-01），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 試驗菌株 胸膜肺炎放線桿菌，共計7株，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。這些菌株均分離自豬胸膜肺炎病例，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定保存。

1.1.4 質(zhì)控菌株 大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213，購自美國標(biāo)準菌種收藏所（ATCC）。

1.1.5 培養(yǎng)基 MH肉湯培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基（質(zhì)控菌用），批號分別為1211071和1302051；PPLO肉湯和PPLO瓊脂（測試菌用），批號分別為1211071和1302051。上述試劑購自北京市陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法 按微量肉湯稀釋法進行，測試步驟參照CLSI（2013，VET01-S2）。具體操作如下。

1.2.1 藥液配制 將鹽酸多西環(huán)素、土霉素分別用滅菌蒸餾水配制成1 280 μg/mL的貯備液，過濾除菌，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備 質(zhì)控菌株（大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213）分別用MH肉湯復(fù)活，測試菌株（胸膜肺炎放線桿菌）用PPLO肉湯（添加1%NAD和5%豬血清）復(fù)活。質(zhì)控菌株復(fù)活后接種于MH瓊脂平板，測試菌株復(fù)活后接種于PPLO瓊脂（添加1% NAD和5%豬血清）平板，37℃過夜培養(yǎng)后，分別挑取1～3個單菌落接種于MH肉湯或PPLO肉湯，置37℃孵育16～18 h。將原菌液用相應(yīng)液體培養(yǎng)基按1:1 000稀釋作為試驗菌液。

1.2.3 接種培養(yǎng) 將兩種藥物貯備液分別用MH肉湯培養(yǎng)基（質(zhì)控菌用）或PPLO肉湯（測試菌用）依次倍比稀釋成 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，用微量加液器將稀釋好的藥液依次加入微孔板每排，每孔50 μL，第12孔加不含藥物的培養(yǎng)基作為陰性對照。用微量加液器將試驗菌液依次加入微孔板每排，每孔50 μL，這樣每孔內(nèi)藥物的最后濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063 μg/mL，第12孔為不含藥物的陰性對照?；靹?，將微量板置于墊有濕紗布的搪瓷方盤內(nèi)，置37℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果。

1.2.4 MIC判定 在襯有黑底板的光線下觀察，細菌生長時小孔內(nèi)培養(yǎng)液呈彌散狀渾濁或U形底部有圓形或絲網(wǎng)狀沉淀，無細菌生長孔的最低藥物濃度即為該藥物的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸多西環(huán)素和土霉素對質(zhì)控菌和測試菌的體外藥敏試驗結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)顯示，鹽酸多西環(huán)素和土霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）在質(zhì)控范圍內(nèi)（大腸桿菌0.5～2.0 μg/mL；金葡菌0.125～1.0 μg/mL），表明試驗所用試劑（培養(yǎng)基）和操作方法合乎要求，檢測數(shù)據(jù)可信。

2.2 數(shù)據(jù)可見，鹽酸多西環(huán)素原料藥對7株胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準品對7株胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍為0.063～0.5 μg/mL。鹽酸多西環(huán)素原料藥和標(biāo)準品對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性基本相當(dāng)。

2.3 數(shù)據(jù)可見，土霉素原料藥對7株胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，土霉素對照品對7株胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍為0.063～1.0 μg/mL。土霉素原料藥和對照品對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性也基本相當(dāng)。

2.4 測定數(shù)據(jù)顯示，鹽酸多西環(huán)素對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性與土霉素相當(dāng)。兩種藥物原料藥的體外抗菌活性也與它們的標(biāo)準品（或?qū)φ掌罚┫喈?dāng)。且鹽酸多西環(huán)素、土霉素對7株胸膜肺炎放線桿菌的MIC≤1 μg/mL，根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準化委員會（CLSI）的判定標(biāo)準均為敏感。

表1 鹽酸多西環(huán)素和土霉素對豬源胸膜肺炎放線桿菌的體外藥敏檢測結(jié)果Table1 In vitro susceptibility test results of doxycycline and oxytetracycline hydrochloride on porcine Actinobacillus pleuropneumoniae

3 討論

3.1 胸膜肺炎放線桿菌屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，后根據(jù)其表型和DNA雜交水平均與放線桿菌屬模式種密切相關(guān)，歸屬為巴氏桿菌科放線桿菌屬[8]，目前已報道的APP有15個血清型，15個血清型又分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[9]。由于其血清型眾多，具有地方特異性，同時各血清型之間也很難產(chǎn)生較強的交叉保護作用，疫苗免疫常常面臨交叉保護作用不強的問題，影響其防控效果，所以抗菌藥物成為控制這種病的主要手段[10]，臨床上常用先鋒霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、替米考星、四環(huán)素、氯霉素等治療該病[11]。鹽酸多西環(huán)素和土霉素作為臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗生素，對胸膜肺炎放線桿菌具有良好的體外抑菌作用，因此開發(fā)用于防治豬胸膜肺炎放線桿菌感染的鹽酸多西環(huán)素和土霉素制劑，有潛在的臨床應(yīng)用價值。

3.2 由于胸膜肺炎放線桿菌易產(chǎn)生耐藥性[12]，隨著臨床生產(chǎn)實踐中抗菌藥物大量的使用，其耐藥性也越來越嚴重。郭慶河[13]報道對新疆昌吉地區(qū)經(jīng)過檢測的9株APP進行藥物敏感性檢測，發(fā)現(xiàn)該細菌對鹽酸多西環(huán)素敏感，其敏感率分別為77.8%；楊瑞晨[14]報道對來自四川廣安、層山等地區(qū)疑似病料進行APP分離獲得9株分離株進行藥物敏感試驗研究，結(jié)果表明9株分離株均四環(huán)素耐藥；李海利等[15]報道對分離的7株APP進行藥物敏感性試驗，結(jié)果表明對四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素耐藥；本試驗中鹽酸多西環(huán)素、土霉素對胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍均為0.125～1.0 μg/mL，處于敏感狀態(tài)。但隨著鹽酸多西環(huán)素在臨床中的廣泛應(yīng)用，菌株有可能會產(chǎn)生耐藥。因此建議臨床應(yīng)加強分離菌的藥物敏感性監(jiān)測，以提高用藥針對性，保證療效。

參考文獻

[1]朱模忠.獸藥手冊[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

[2]Ya jaheikki J,Keinanen R,Pellikka M,et al. Minocycline blocks nitricoxideinduced neutrotoxicity by inhibition p38 MAP kinasein rat cerebelar granuleneurons. J Proc Natl Acad Sci USA,1998,95：15769-15774.

[3]李偉，楊陽.多西環(huán)素的藥理學(xué)進展及臨床應(yīng)用概述[J].廣東畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2009（6）：3-5.

[4]盧小春.防治細菌性傳染病藥物的合理應(yīng)用[J].動物保健，2005（8）：33-34.

[5]TOBIAS T J,KLINKENBERG D,BOUMA A,et al.A cohort study on Actinobacillus pleuropneumoniae colonisation in suckling piglets[J]. Prev Vet Med,2014,114（3/4）:223-230.

[6]吳家強，李世平.豬接觸傳染性胸膜肺炎研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)，2002，34（10）：36-39.

[7]鄒麗，周雪，徐登峰.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌鑒定與耐藥性試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2014，50（2）：41-42.

[8]康帥，殷中瓊，賈仁勇，等.烏梅等20種中藥對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35（3）：13-17.

[9]李海利，朗利敏，徐引弟，等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型PCR程序優(yōu)化及分子鑒定[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015（1）：33-39.

[10]唐萬勇，劉潔，侯博，等.氟苯尼考單用及聯(lián)用對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果[J].中國豬業(yè)，2015（11）：85-88.

[11]唐文山，李昕.豬傳染性胸膜肺炎研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2008，29（2）：98-102.

[12]張朝陽，劉二龍.豬傳染性胸膜肺炎研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（3）：36-39.

[13]郭慶河.新疆昌吉地區(qū)部分規(guī)?；i場致斷奶仔豬呼吸道綜合征（PRDC）三種主要病原菌的分離鑒定及防治[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[14]楊瑞晨.胸膜肺炎防線桿菌四川分離株的生物學(xué)特性研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[15]李海利，郎利敏，徐引弟，等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離與鑒定及藥敏試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（19）：179-181.

Studies on the Antibacterial Activity of Doxycycline Hydrochloride and Oxytetracycline against Actinobacillus Pleuropneumoniae in vitro

Wang Degong1,2,Wei Lijuan1,2,Yang Guohui1,2,Liu Xin1,2,Wu Congming3,Jia Guobin1,2*
（1.Hebei Yuanzheng Pharmaceutical Co.,Ltd,Hebei Shijiazhuang 050041; 2.Hebei provincial veterinary Engineering Technology Research Center,Hebei Shijiazhuang 050041; 3.China Agricultural University,Beijing 100193）

In order to study the antibacterial activity of doxycycline hydrochloride and oxytetracycline against Actinobacillus pleuropneumoniae,This experiment adopts the broth microdilution method of Actinobacillus pleuropneumoniae by drug sensitivity test in vitro.The results showed that the MIC of doxycycline hydrochloride against Actinobacillus pleuropneumoniae was 0.125～1.0 μg/mL,the MIC of oxytetracycline against Actinobacillus pleuropneumoniae was 0.125～1.0 μg/mL. The antimicrobial activity in vitro of the two drugs were equivalent against Actinobacillus pleuropneumoniae.The results show that doxycycline hydrochloride and oxytetracycline has good antibacterial activity against Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro.

Doxycycline Hydrochloride;Oxytetracycline;Actinobacillus pleuropneumoniae;Antibacterial experiment in vitro

S855.12

：B

：1672-9692(2016)09-0016-04

2016-06-11

王德功（1981-），男，工程師，大學(xué)本科，學(xué)士，研究方向：藥劑學(xué)及畜禽疾病。

賈國賓（1964-）男，大學(xué)本科，學(xué)士，高級工程師，研究方向：藥劑學(xué)及畜禽疾病。

石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃課題項目（131200083A）。