豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

師麗剛，周 飛

（1.河南省洛陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 洛陽(yáng) 471002；2.河南省洛陽(yáng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽(yáng) 471000）

豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

師麗剛1，周 飛2

（1.河南省洛陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 洛陽(yáng) 471002；2.河南省洛陽(yáng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽(yáng) 471000）

根據(jù)豬肺炎支原體（Mhp）的P36基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，建立一種豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法，此方法對(duì)對(duì)照菌株顯示為陰性，對(duì)豬肺炎支原體的擴(kuò)增結(jié)果顯示為陽(yáng)性，并對(duì)此方法進(jìn)行了特異性和敏感性試驗(yàn)，結(jié)果成功建立了豬肺炎支原體特異且敏感的PCR檢測(cè)方法。采用已經(jīng)建立的PCR方法對(duì)18份疑似豬支原體肺炎（MPS）樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有9份呈現(xiàn)陽(yáng)性，占比50%。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的該P(yáng)CR檢測(cè)方法可用于豬支原體的臨床診斷，能為其以后的防控提供有力依據(jù)。

豬肺炎支原體；PCR

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）所引發(fā)[1]，引起豬的一種低死亡率、高發(fā)病率的慢性呼吸道傳染病，又稱(chēng)豬霉形體肺炎、豬氣喘病。自1965年Mare等[2]發(fā)現(xiàn)Mhp以來(lái)，無(wú)數(shù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后通過(guò)培養(yǎng)基分離獲得Mhp。盡管Mhp可在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，并且培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[3]，從而以此進(jìn)行臨床診斷意義不大。該病在臨床上主要特征是：氣喘，呼吸比較困難，腹式呼吸但體溫表現(xiàn)正常。發(fā)病時(shí)間不固定，但以冬、春寒冷季節(jié)發(fā)生較多?；疾∝i只生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率低。因此世界各國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)均受到其不同程度的影響，普遍流行于澳大利亞、歐美等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家[4]，它也是對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失的疫病之一，估計(jì)我國(guó)每年因此病造成的經(jīng)濟(jì)損失不低于百億元人民幣[5-6]。鑒于MPS對(duì)養(yǎng)豬業(yè)巨大的影響，為了減少經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)Mhp進(jìn)行早期診斷成為了當(dāng)前研究的重點(diǎn)工作之一。

眾多試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，常規(guī)的病原分離檢測(cè)方法所用時(shí)間較長(zhǎng)[7]，不利于控制疫病的發(fā)展和把握最佳的治療時(shí)間，應(yīng)用間接血凝試驗(yàn)（IHA）[8]、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、核酸探針[9]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）[10]、免疫酶試驗(yàn)（RIDEA）和免疫熒光試驗(yàn)（IF）等血清學(xué)方法診斷MPS，用ELISA方法得出的試驗(yàn)結(jié)果較為理想[11-12]，但是由于豬肺炎支原體的抗原與豬體內(nèi)的豬鼻支原體、滑液支原體、絮狀支原體等存在交叉反應(yīng)，使得應(yīng)用傳統(tǒng)的ELISA和病原分離方法很難以區(qū)分。因此，及時(shí)建立一種既準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便又特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法就顯得特別重要。伴隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其檢測(cè)方式不僅具有很高的敏感性和特異性，與此同時(shí)還克服了血清學(xué)交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)。

Mhp存在一些免疫顯性蛋白，包含粘附素P97、三個(gè)膜蛋白P74、P65和P46[13]以及黏附素P97[14]，細(xì)胞溶脂蛋白P36等。其中P36是乳酸脫氫酶蛋白（LDH）具有很高的種內(nèi)保守性，與其他支原體無(wú)穿插反應(yīng)，能誘發(fā)早期免疫反應(yīng)[15]。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)研究按照P36基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了迅速精確的PCR診斷辦法，并用該辦法檢測(cè)分析了采集的病料。

1 材料和方法

1.1 菌株 豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞毒支原體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌均由洛陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離、鑒別并保存。

1.2 主要試劑與器材 動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，Ex Taq（5 U/μL）、dNTP Mixture（2.5 mmol/μL）、MgCl2（25 mM/μL）、10X PCR Buffer（Mg2+free）、DNA Marker、RNase Free dH2O等均購(gòu)自TaKaRa公司，EB染料替代染液購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司，瓊脂糖購(gòu)于Biowest公司。2 mL玻璃勻漿器研磨器購(gòu)自海門(mén)海泰實(shí)驗(yàn)器材北京銷(xiāo)售部，PCR儀購(gòu)自意大利泰克尼公司（TECHNE），Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Heal Force Development Ltd（力康發(fā)展有限公司），瓊脂糖凝膠電泳儀購(gòu)自大連捷邁科貿(mào)有限公司（Jim-X Scientific company），自動(dòng)凝膠圖像分析儀購(gòu)自沙船（天津）生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 按照Mhp的P36基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物P1：GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA，P2：GTGGACTACCAGGGTATCT。目的基因片段大小650 bp，設(shè)計(jì)的引物交由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。

1.4 PCR模板制備 病料DNA的提?。喝〔∝i肺臟0.49 g放入2 mL玻璃勻漿器中，加入500 μL PBS（pH=8）緩沖液中研磨，接下來(lái)的步驟完全遵循上海生工生物工程有限公司動(dòng)物基因組抽提試劑盒中的操作說(shuō)明進(jìn)行。DNA提取完成后置于-20℃保存待用。

1.5 PCR反應(yīng) MhpP36基因的擴(kuò)增采用的是50 μL的PCR反應(yīng)體系。包括模板DNA 5 μL，Ex Taq酶（5 μ/μL）0.25 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/μL）4 μL，10X PCR Buffer（Mg2+free）5 μL，Mgcl2（25 mM/μL）3 μL，正反引物（10 umol/L）各1 μL，加RNase Free dH2O至50 μL。將PCR反應(yīng)程序內(nèi)容順序設(shè)置為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 S，54℃退火40 S，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸5 min。在反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，制一塊1%的瓊脂凝膠。待PCR體系反應(yīng)完成后，取上述擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，后于120 V電壓下電泳，然后觀察結(jié)果。

1.6 特異性試驗(yàn) 用上述試驗(yàn)方法，分別對(duì)臨床上常見(jiàn)的傳染病病原如豬鼻支原體、雞毒支原體進(jìn)行檢測(cè)，依照上面的試驗(yàn)材料和操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳觀察結(jié)果。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將提取的DNA進(jìn)行定量，測(cè)其濃度為2.6 ng/μL，取1 μL樣本進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)蛊錆舛纫来螢?.6×10-1、2.6×10-2、2.6×10-3、2.6×10-4、2.6×10-5、2.6×10-6、2.6×10-7和2.6×10-8ng/μL。后按照已建立好的PCR擴(kuò)增條件和方法進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行PCR敏感性試驗(yàn)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 用上述已經(jīng)建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)傳支原體進(jìn)行檢測(cè)3次，用于驗(yàn)證本檢測(cè)辦法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) PCR反應(yīng)完成后經(jīng)過(guò)1%的瓊脂凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物在650 bp處有明顯可見(jiàn)的特異性DNA擴(kuò)增條帶，和之前預(yù)期的大小相符，如圖1。后對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增的序列與作為對(duì)照的豬肺炎支原體基因序列相同。

圖1 豬肺炎支原體PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Mycoplasma pneumoniae PCR amplification results

2.2 特異性試驗(yàn) 根據(jù)上述方法，用所設(shè)計(jì)的引物P1： GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA， P2： GTGGACTACCAGGGTATCT。分別對(duì)豬肺炎支原體，豬鼻支原體，雞毒支原體、胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌進(jìn)行同條件擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖2），僅對(duì)Mhp擴(kuò)增出650 bp的特異性條帶，其余均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。以上數(shù)據(jù)證明所設(shè)計(jì)的引物具備很強(qiáng)的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn) 取DNA作10-1～10-8的倍比稀釋后，其模板DNA濃度依次為1：2.6 μg/μL；2：2.6×10-1μg/μL；3：2.6×10-2μg/μL；4：2.6× 10-3μg/μL；5：2.6×10-4μg/μL；6：2.6×10-5μg/μL；7：2.6×10-6μg/μL；8：2.6×10-7μg/ μL。按上述PCR操作方法和步驟進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果如圖3，用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，最低能從2.6×10-3μg/μL倍稀釋的模板中看到擴(kuò)增的目的基因條帶，上述數(shù)據(jù)表明使用該引物進(jìn)行PCR檢測(cè)的最低檢出量2.6×10-3μg/μL。

圖2 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 PCR specific experimental results

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按上述方法，反復(fù)操作3次，結(jié)果相同，表示所建立的辦法是準(zhǔn)確、穩(wěn)定的。

2.5 檢測(cè)方法的應(yīng)用 運(yùn)用本試驗(yàn)所建立的PCR檢測(cè)辦法對(duì)18份疑似豬肺炎支原體病料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示有9份病料顯示為陽(yáng)性，9份為陰性，陽(yáng)性檢出率達(dá)到50%。

圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 PCR sensitivity test results

3 討論與結(jié)論

最近幾年的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果顯示，大型規(guī)模豬場(chǎng)中Mhp能與多種細(xì)菌、病毒等病原共同作用，由此，引發(fā)一系列的豬呼吸道疾病綜合征，嚴(yán)重減少了豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益，妨礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。該病已成為制約豬養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一。所以，做出對(duì)MPS及早預(yù)防和正確診斷方案是全人類(lèi)當(dāng)前需迫切處理的重要任務(wù)。

縱觀國(guó)內(nèi)外這幾年畜牧業(yè)的發(fā)展歷程，有很多有關(guān)豬肺炎支原體檢測(cè)方法方面的報(bào)道，但報(bào)道病原菌檢測(cè)方法的卻很少。傳統(tǒng)的病原鑒定向來(lái)都以分離培養(yǎng)為前提，而后再根據(jù)形態(tài)、免疫學(xué)及生理生化特征作進(jìn)一步鑒定，不僅程序繁瑣，而且病原檢出率低，與疾病的訊速診斷、治療原則相違背，有弊于臨床試驗(yàn)中對(duì)該疾病的準(zhǔn)確診斷。此外豬感染豬肺炎支原體時(shí)，普遍伴隨著豬鼻支原體和絮狀支原體的感染，又因?yàn)樨i肺炎支原體比豬鼻支原體和絮狀支原體培育條件較為嚴(yán)峻，生長(zhǎng)較為遲緩，所以在分離培養(yǎng)豬肺炎支原體時(shí)常常被別的兩種支原體掩蓋，并且三者在血清學(xué)反應(yīng)上有一定交叉性，結(jié)果采用血清學(xué)方法檢測(cè)此病可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。本試驗(yàn)采用優(yōu)化條件后建立的豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法，直接從病料提取細(xì)菌DNA，不用進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，而是直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可判斷是否有豬肺炎支原體感染。試驗(yàn)通過(guò)DNA基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物，擴(kuò)增出 650 bp的特異片段，而對(duì)于常見(jiàn)的豬鼻支原體、雞毒支原體、胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌則不能擴(kuò)出特異片段，說(shuō)明該方法具有很高的特異性。對(duì)疑似豬肺炎支原體病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性檢出率達(dá)到50%，表明PCR方法較傳統(tǒng)方法有檢測(cè)速度快，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)該病做有效診斷。本試驗(yàn)建立的豬支原體肺炎PCR檢測(cè)辦法能能對(duì)該病進(jìn)行訊速診斷與流行病學(xué)調(diào)查。

[1]李瑩瑩，何穎，趙武，等.豬支原體肺炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（10）：95-100.

[2]Mare C J,Switzer W P.New species:Mycoplasma hyopneumoniae,a causative agent of viruspigpneumonia[J].VetMedSmallAnimClin, 1965,60:841-846.

[3]畢丁仁，王桂枝.動(dòng)物霉形體及研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：9.

[4]張旭，白方方，武昱孜，等.PCR技術(shù)檢測(cè)豬支原體肺炎的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2012（5）：54-60.

[5]華利忠，邵國(guó)青，周勇岐.以疫苗免疫為核心的豬氣喘病控制與凈化技術(shù)[J].中國(guó)獸藥雜志，2012，46（7）：50-53.

[6]楊莉，楊茂生，吳位珩，等.豬氣喘病的研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011（6）：7-9.

[7]孔令增，劉艷芬，劉鈾.廣東豬肺炎支原體的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（10）：1016-1020.

[8]張順鳳.間接血凝試驗(yàn)及豬氣喘病檢測(cè)[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，1996，26（1）：5-7

[9]李桂蘭，張映，邵國(guó)青.豬肺炎支原體斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，32（6）：536-539.

[10]劉茂軍，靳岷，杜改梅，等.檢測(cè)豬肺炎支原體抗體間接ELISA方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（5）：437-441.

[11]Armstrong C H,Freeman M J,Sands-Freeman l,et al.Comparison of zhe enzyme-linked immunosorbent assay and the indirect hemagglutinationandcomplementfixationtestsfor detecting antibodies to Mycoplasma hyopneumoniae[J].Can J Comp Med,1983,47(4):464-470.

[12]Bereiter M,Young T F,Joo H S,et al.Evaluation of the ELISA and comparison to the complement fixation test and radial immmunodiffusion enzyme assay for detection of antibodies agsinst Mycoplasma hyopneumoniae in swineserum[J].Vet Microbiol,1990,25(2-3):177-192.

[13]Futo S,Seto Y,Okada M,et al.Recombinant 46-kilodalton surface antigen(P46)of Mycoplasma hyopneumoniae expressed in Escherichia coli can be used for early specific diagnosis of mycoplasmal pneumonia of swine by enzyme-linked immunosorbent assay[J].Journalofclinical microbiology,1995,33(3): 680-683.

[14]Okada M,Asai T,Futo S,et al.Serological diagnosis of enzootic pneumonia of swine by adouble-sandwichenzyme-linkedimmunosorbent assay using a monoclonal antibody and recombinant antigen(P36)of Mycoplasma hyopneumoniae[J].Vet Microbiolo,2005,105(3-4):251-259.

[15]遲靈芝，徐斌，遲學(xué)芝.豬肺炎支原體P36基因的突變及序列分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（16）：15-18.

Establishment and application of PCR detection method of mycoplasma pneumonia in pigs

Shi Ligang1,Zhou Fei2
(1.Luoyang animal disease prevention and control center,Henan Luoyang 471000; 2.Luoyang animal health supervision,Henan Luoyang 471000）

Based on the nucleotide sequence of Mycoplasma hyopneumoniae(Mhp)of the P36 gene,a pair of primers were designed.PCR detection method for the control strain was negative for Mhp amplification was positive,and the method was specific and sensitive test was successfully established for hyopneumoniae.18 parts suspected swine mycoplasma pneumonia(MPS)for testing and found that nine were positive,accounting for 50%.Experimental results show that the PCR method can be used for clinical diagnosis of MPS,which may provide a strong basis for the future prevention.

Mycoplasmal pneumonia of swine;PCR

S858.282

：B

：1672-9692(2016)09-0011-05

2016-07-25

師麗剛（1980-），男，山西省長(zhǎng)治人，獸醫(yī)師，畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)專(zhuān)業(yè)，主要從事獸醫(yī)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷工作。