一株副乳房鏈球菌的分離鑒定及生物學分析

任梅滲， 王　印，*， 楊澤曉， 姚學萍， 鄔旭龍， 肖　璐

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

一株副乳房鏈球菌的分離鑒定及生物學分析

任梅滲1，2， 王印1，2，*， 楊澤曉1， 姚學萍1， 鄔旭龍1，2， 肖璐1，2

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

摘要：從四川省某大型養(yǎng)殖場病死豬肺臟分離到一株副乳房鏈球菌，觀察該菌株的生長特性、染色特性，進行生化鑒定、藥敏鑒定、毒力試驗以及16S rRNA基因序列進化樹分析。結果顯示：該分離株的16S rRNA序列與副乳房鏈球菌的同源性為99%。分離株在TSA瓊脂培養(yǎng)基上呈光滑圓形，半透明的菌落，在血瓊脂上呈β溶血；對小鼠的致病性試驗測得LD50為2.06×107 cfu·只-1；藥敏試驗表明，其對頭孢類藥物較為敏感，對喹諾酮類、四環(huán)素類以及氨基糖苷類不敏感。該研究為該菌的臨床診斷、疾病預防、選藥治療等奠定了基礎。

關鍵詞：副乳房鏈球菌；豬；16S rRNA；分離鑒定

副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis)是一種球型、運動性較低、鏈狀排列的革蘭氏陽性菌，能引起感染并表現出臨床癥狀，例如出血性敗血癥、眼球突出癥、腦膜炎，惡病質等，在短時間內死亡率超過50%；而且該菌還能引起慢性感染，導致幾周內每天都保持較低的死亡率，造成持續(xù)死亡[1]。根據以往文獻報道，副乳房鏈球菌能引起牛的乳腺炎，導致牛產品質量下降。在水產養(yǎng)殖業(yè)，也有報道該菌引起嚴重的魚類疾病，對水產行業(yè)造成重大的危害[2]。然而關于該菌的報道大多出現在國外的文獻上，尤其是在韓國和日本等地，其引起的疫情頻繁發(fā)生，嚴重地影響了當地的養(yǎng)殖行業(yè)[3-4]。Whitehead等[5]也在豬上分離到該菌，但是國內對于副乳房鏈球菌還鮮有報道。本研究從四川省某大型養(yǎng)殖場病死豬肺臟分離到1株副乳房鏈球菌，根據培養(yǎng)特性、生化鑒定、藥敏試驗，致病性試驗以及16S rRNA序列分析，確定該分離株為1株副乳房鏈球菌，這為該菌的臨床診斷、疾病預防、選藥治療等奠定了基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

病料采集自四川地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場。SPF級昆明小鼠30只，體重為18～20 g，雌雄各半，均購自成都達碩生物科技有限公司。

1.2試劑與培養(yǎng)基

TSA培養(yǎng)基、脫纖兔血培養(yǎng)基購自奧博星生物技術(北京)有限責任公司?？咕幬锼幟艏埰c細菌微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司。pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。大腸埃希菌DH5α，2×TaqPCR Master Mix、DNA 分子量標準，標準小牛血清，細菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA純化回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.3細菌分離、純化與培養(yǎng)特性

無菌接種肺臟病料于含有5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基，挑取半透明、光滑、圓形，伴有少量熒光的單個菌落進行純化。將純化的菌落接種于脫纖兔血培養(yǎng)基，觀察溶血形態(tài)。

1.4藥敏試驗

使用藥敏紙片擴散法進行測定，依據CLSI標準判定結果。

1.5生化試驗

將分離株接種于含有5%小牛血清的TSA瓊脂培養(yǎng)基上，按常規(guī)方法使用細菌微量生化反應管進行試驗，參照伯杰氏細菌鑒定手冊[6]判定并分析結果。

1.6測定副乳房鏈球菌對小鼠LD50

用少量小鼠進行預試驗以確定LD100與LD0，在兩者之間設置5個劑量梯度，分別為1×109，1×108，1×107，1×106，1×105cfu·mL-1。試驗組每組隨機取5只小鼠，每只0.2 mL進行腹腔注射，對照組5只小鼠腹腔注射等體積的無菌生理鹽水。攻毒后每6 h觀察1次，連續(xù)觀察72 h。剖檢死亡小鼠分離致死菌并進行鑒定，用Bliss法計算LD50。

1.7引物設計

參考16S rRNA通用引物序列擴增16S rRNA基因[7]。引物序列為F∶5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R∶5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.816S rRNA基因的擴增與序列分析

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離株基因組。PCR擴增體系共50 μL，具體用量為2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL，RNase-free H2O 20.0 μL，上下游引物各1.5 μL，基因組模板2.0 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用DNA純化回收試劑盒進行回收，連接pMD19-T載體，轉化DH5α，將陽性克隆送交華大科技有限公司測序。測序結果經Blast比對分析，使用DNAStar將該序列與GenBank已登錄的副乳房鏈球菌16S rRNA序列進行同源性比對，構建系統(tǒng)進化樹。

2結果與分析

2.1分離株生長特性與鏡下形態(tài)

該分離株在含有5%小牛血清的TSA瓊脂培養(yǎng)基上呈光滑圓形、半透明并且折光檢驗時伴有微弱熒光的單個菌落；在顯微鏡下呈鏈狀排列的陽性球菌，有長鏈也有短鏈；在含有脫纖兔血瓊脂培養(yǎng)基上，菌落周圍形成2～3 mm界限分明、透明的溶血環(huán)，為β溶血(圖1)。

2.2藥敏試驗結果

分離株在所使用的20種抗菌藥物中，對羧芐西林、頭孢呋辛以及氯霉素呈高度敏感。對萬古霉素、頭孢曲松呈中度敏感。對其他抗菌藥物均不敏感(表1)，可見分離株對頭孢類藥物較為敏感，對喹諾酮類、四環(huán)素類以及氨基糖苷類不敏感。

圖1　副乳房鏈球菌在血瓊脂培養(yǎng)基上的生長特性Fig.1　Growth characteristic of Streptococcus parauberis on blood agar

表1藥敏試驗結果

Table 1Results of antimicrobial susceptibility tests

藥物名稱判定標準/mmRS抑菌圈直徑/mm敏感性氯霉素≤12≥1820S羧芐西林≤13≥1724S頭孢呋辛≤14≥2324S萬古霉素≤14≥1714M頭孢曲松≤13≥2118M頭孢氨芐≤14≥1812R新霉素≤12≥1710R米諾環(huán)素≤14≥1912R丁胺卡那≤14≥170R慶大霉素≤12≥150R諾氟沙星≤12≥170R青霉素≤14≥150R苯唑西林≤17≥180R四環(huán)素≤11≥150R卡那霉素≤14≥170R丙氟哌酸≤15≥210R氧氟沙星≤12≥160R復方新諾明≤24≥320R多粘菌素≤8≥120R克林霉素≤13≥210R

注: S:敏感；M:中等敏感；R:抗藥。

2.3生化特性鑒定

分離株分解葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖、水楊素；不分解衛(wèi)矛醇、鼠李糖、阿拉伯糖、七葉苷、硫化氫、枸櫞酸鹽；ONPG、半固體瓊脂、尿素為陽性反應；粘液酸、丙二酸、鳥氨酸、精氨酸、苯丙胺試驗呈陰性(表2)。參照伯杰氏細菌鑒定手冊分析，該分離株符合副乳房鏈球菌的生化特性。

表2生化試驗結果

Table 2Results of biochemical tests

生化試驗結果生化試驗結果葡萄糖+鼠李糖-水楊素+粘液酸-纖維二糖+硫化氫-麥芽糖+枸櫞酸鹽-ONPG+七葉苷-半固體瓊脂+阿拉伯糖-尿素+鳥氨酸-衛(wèi)矛醇-精氨酸-丙二酸-苯丙胺-

注: + 表示陽性；- 表示陰性。

2.4對小鼠LD50的測定

接種小鼠后6 h內，各高劑量組小鼠陸續(xù)出現精神沉郁、食欲不振、震顫的癥狀。21 h后，小鼠開始出現死亡，72 h后剩余小鼠基本臨床耐過，恢復正常。剖檢死亡小鼠可見肝臟、脾臟明顯腫大、出血、伴有惡臭。各組小鼠死亡數據為：1×109cfu·mL-1組死亡5只，1×108cfu·mL-1組死亡4只，1×107cfu·mL-1組死亡2只，其他劑量組與對照組均未出現死亡。經計算，分離株對小鼠的LD50為2.06×107cfu·只-1。

2.516S rRNA基因的擴增與序列分析

提取分離株基因組進行16S rRNA擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增產物片段約為1 500 bp(圖2)。將測序結果進行Blast對比分析，結果顯示分離株與副乳房鏈球菌的同源性為99%(分離株16S rRNA序列已上傳GenBank，登錄號為KT825567)。選取不同來源的副乳房鏈球菌與豬鏈球菌、馬鏈球菌、海豚鏈球菌的16S rRNA序列共同構建系統(tǒng)進化樹(圖3)，結果同樣顯示分離株與副乳房鏈球菌同源性最高，所以判定該分離株為副乳房鏈球菌。

1: 16S rRNA 擴增目的條帶； M: DNA Marker DL2000。圖2　16S rRNA PCR擴增結果Fig.2　The result of 16S rRNA by PCR

圖3　系統(tǒng)進化樹Fig.3　Image of phylogenetic tree

3討論

副乳房鏈球菌是一種革蘭氏陽性球菌，運動性低，呈鏈狀排列，能引起出血性敗血癥、惡病質、腦膜炎等疾病。國內對于該菌還鮮有報道，國外的報道主要集中在水產行業(yè)、養(yǎng)牛業(yè)與食品行業(yè)。1996年Domenech等[8]于西班牙首次認定副乳房鏈球菌是一種魚類的重要病原菌；2006年Koort等[9]發(fā)現該菌也能引起食品行業(yè)肉制品的污染。在韓國和日本，該菌是一個主要的致病菌并且對當地水產行業(yè)造成了巨大的損失[10-12]。2013年Haines等[13]在北美野生長須鯨中也發(fā)現了副乳房鏈球菌。本研究從病豬分離到致病菌，通過試驗鑒定該分離株為副乳房鏈球菌，這在國內還未見報道。

對于副乳房鏈球菌致病機制的研究報道還比較少。溶血素作為一種被認知的細菌致病因子，其廣泛地存在于革蘭氏陽性與陰性細菌中，能溶解紅細胞，在由細菌引起的疾病感染過程中起到重要的作用。本研究所分離的副乳房鏈球菌在血瓊脂平板上呈現β溶血，然而以往對該菌的報道多為α溶血或者不溶血[14]，這或許與該分離株對小鼠有較高致病性有關。分析其溶血情況變化的原因可能有幾點：第1種可能是由于該溶血素基因發(fā)生了突變，導致氨基酸序列變化，從而導致表達出的溶血特性發(fā)生變化；第2種可能是由于不同菌株之間溶血素的基因出現水平轉移[15]，從而產生變化。

由于國內對副乳房鏈球菌還缺乏相關報道。本研究分離的1株副乳房鏈球菌對小鼠有較強的致病性，在抗生素用藥方面也表現出一定的耐藥性，并且其溶血情況發(fā)生了變化。結合國外的流行現狀，該菌應當引起國內的廣泛關注以及重視，應加強對于該菌的防治和管控，重視臨床診斷與治療。本研究通過對副乳房鏈球菌進行分離鑒定，也為該菌的防治和管控的相關研究提供了材料，并為臨床診斷和用藥治療提供了科學依據。對于該菌致病機制、耐藥機制等各方面的研究以及相關疫苗的研發(fā)有待進一步的深入研究。

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(責任編輯盧福莊)

Isolation， identification and biological characteristics analysis ofStreptococcusparauberis

REN Mei-shen1，2， WANG Yin1，2，*， YANG Ze-xiao1， YAO Xue-ping1， WU Xu-long1，2， XIAO Lu1，2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

Abstract:One strain of Streptococcus parauberis was isolated from a large scale pig farm in Sichuan Province. In this study， gram staining， culture characteristics， biochemical tests， antibiotic sensitivity tests， and 16S rRNA gene sequence analysis were used to identify the strain characteristics and resistance to drugs. The results of the 16S rRNA sequencing of the isolated strain showed 99% homology with Streptococcus parauberis. The colonies of the isolated strain on TSA agar appeared to be smooth， circular and translucent and had β-hemolysis on blood agar. The LD50of isolated strain to mice was 2.06×107 cfu per mouse. The antibiotic sensitivity experiment showed that it was sensitive to cephalosporin antibiotics but insensitive to quinolone， tetracycline and aminoglycoside antibiotics. This study laid a foundation in clinical diagnosis， disease prevention and drug treatment for associate streptococcus disease.

Key words:Streptococcus parauberis; swine; 16S rRNA; isolation and identification

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.08

收稿日期：2015-10-07

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD12B04)

作者簡介：任梅滲(1991—)，男，重慶人，碩士研究生，從事動物傳染病病原分子生物學研究。E-mail： edisonplb@126.com

*通信作者，王印， E-mail：yaanwangyin@tom.com

中圖分類號：S852.61+1

文獻標志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0758-05

浙江農業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 758-762

http://www.zjnyxb.cn

任梅滲，王印，楊澤曉，等. 一株副乳房鏈球菌的分離鑒定及生物學分析[J].浙江農業(yè)學報，2016，28(5): 758-762.