轉(zhuǎn)Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的獲得及鑒定

王海鵬　黃曉西　梁越洋　朱軍　張翠霞　王秀梅　貢常委　鄭愛萍　鄧其明　李雙成　王玲霞　李平　王世全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所， 四川 溫江 611130；*通訊聯(lián)系人， E-mail: sqwangscau@163.com)

轉(zhuǎn)Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的獲得及鑒定

王海鵬黃曉西梁越洋朱軍張翠霞王秀梅貢常委鄭愛萍鄧其明李雙成王玲霞李平王世全*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所， 四川 溫江 611130；*通訊聯(lián)系人， E-mail: sqwangscau@163.com)

王海鵬, 黃曉西, 梁越洋, 等. 轉(zhuǎn)Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的獲得及鑒定. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(3)： 256-264.

摘要:將編碼高效殺褐飛虱蛋白的蘇云金芽胞桿菌基因Cry30Fa1密碼子改造后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入蜀恢818(R818)，并最終獲得46個(gè)轉(zhuǎn)基因植株。通過定量PCR及Western Blot鑒定了Cry30Fa1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)，并通過分子檢測固定穩(wěn)定表達(dá)的抗性基因，并結(jié)合傳統(tǒng)育種系譜法選擇具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀株系。對(duì)選育的株系在室內(nèi)和大田環(huán)境下進(jìn)行了抗蟲性鑒定，選育的R818-Cry30Fal株系抗性明顯優(yōu)于親本材料并達(dá)到抗的水平；在單株抗蟲試驗(yàn)中，觀察到了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)褐飛虱具有致死作用。說明轉(zhuǎn)入Cry30Fa1基因使水稻產(chǎn)生了對(duì)褐飛虱抗性。培育出了具有抗褐飛虱蛋白的新型恢復(fù)系R818-Cry30Fal，為三系雜交育種提供了新的抗性材料并豐富了抗褐飛虱水稻種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞:褐飛虱； 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法； 抗蟲性； Cry30Fa1

水稻是世界三大主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)保障人類生活至關(guān)重要[1-2]。不過水稻也是蟲害最多的糧食作物之一。以稻飛虱吸取汁液的刺吸式口器的害蟲不僅直接為害，同時(shí)還傳播病毒病， 嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)。傳統(tǒng)的防治方法主要是使用各種農(nóng)藥來殺滅害蟲，不但提高了生產(chǎn)成本，增加了環(huán)境污染，破壞了生態(tài)平衡，而且褐飛虱易產(chǎn)生抗藥性，因而培育自身能夠抗蟲的水稻品種是防治害蟲最經(jīng)濟(jì)、有效的方法[3]。目前主流的培育抗蟲水稻品種方式是利用水稻本身的抗性基因通過分子標(biāo)記育種等手段培育抗蟲的水稻，但培育周期相對(duì)較長，并且隨著抗性品種種植年限的增加，其對(duì)褐飛虱抗性水平逐漸下降，即褐飛虱群體克服了含抗性基因水稻品種的抗性[4]。同時(shí)，由于受到種質(zhì)資源的限制，傳統(tǒng)抗蟲育種愈發(fā)困難。

隨著分子生物學(xué)、基因工程、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化開始成為作物育種的一種有效途徑[5]。利用基因工程手段將外源抗蟲基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入水稻，使水稻自身產(chǎn)生抗蟲蛋白從而達(dá)到防治害蟲的目的。應(yīng)用于水稻抗蟲性改良的外源基因最多的是來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringinensis，Bt)的殺蟲基因，比如被導(dǎo)入水稻的Bt抗螟蟲基因有Cry2A[6]、Cry1A(b)[7]、Cry1C*[8]等。還有一些非Bt基因被成功導(dǎo)入水稻中，通過轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素(Galanthusnivalisagglutinin，GNA)[9-10]和半夏凝集素基因(PTA)[11]等外源凝集素基因?qū)崿F(xiàn)獲取抗褐飛虱的轉(zhuǎn)基因材料，但這些非Bt基因在水稻中可能會(huì)分泌出一種對(duì)人有低毒的蛋白[12]。Bt基因?qū)?yīng)分泌的蛋白只對(duì)一種或少數(shù)的昆蟲產(chǎn)生毒害作用且不對(duì)人畜產(chǎn)生毒害作用，所以Bt基因?qū)?huì)有極大的應(yīng)用價(jià)值。Bt基因的殺蟲范圍很廣包括很多鱗、鞘、雙翅目及螨、線蟲等害蟲，同時(shí)對(duì)抗半翅目基因的研究也有進(jìn)展，比如Cry30GA1[13]、Cry54Ab1[14]、Cry54Aa1及Cry30Fa1[15]等Bt基因。

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Cry30Fa1密碼子優(yōu)化后的基因?qū)牖謴?fù)系蜀恢818，通過分子手段篩選出具有Cry30Fa1的轉(zhuǎn)基因株系，通過后代自交分離篩選獲得農(nóng)藝性狀好且去除標(biāo)記基因的純系，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量及對(duì)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行Western Blot相對(duì)定量檢測，同時(shí)選擇純系轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行苗期及抽穗期大田抗蟲鑒定。通過分子育種與傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方式，以期最終獲得安全的無選擇標(biāo)記基因抗褐飛虱水稻株系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試水稻品種及褐飛虱

轉(zhuǎn)基因受體親本為本實(shí)驗(yàn)室培育的三系恢復(fù)系：蜀恢818(即R818)；褐飛虱為本實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)培養(yǎng)多代的稻褐飛虱。

1.1.2Bt基因及密碼子優(yōu)化改造

Cry30Fa1基因采用本實(shí)驗(yàn)室從海螺溝采集的

Bt菌BtMc28分離克隆[15]，參照周宗梁等[16]Bt基因的改造方法，將Cry30Fa1按照水稻密碼子偏好性進(jìn)行改造。修改后的基因序列見輔助性表S1(http://www.ricesci.cn/CN/articl/showSupportInfo.do？id=2597)。

1.1.3根癌農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因載體

轉(zhuǎn)基因過程中使用根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)，菌株為LBA4404。同時(shí)使用的表達(dá)載體為pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg(圖1)。

1.2方法

1.2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植株

參考李雙成等[17]的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得轉(zhuǎn)基因株系。

1.2.2轉(zhuǎn)基因植株的檢測

分別取轉(zhuǎn)基因植株分蘗盛期葉片3～5 cm，然后放入標(biāo)記的試管中，加入5 mL濃度為40 mg/L潮霉素檢測溶液，同時(shí)取轉(zhuǎn)基因植株葉片作對(duì)照，每天觀察葉片情況，5 d后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

采用CTAB法提取水稻葉片組織總DNA。根據(jù)Cry30Fa1基因編碼序列分別設(shè)計(jì)PCR引物，上下游引物序列分別為F21(5′-CGGAGATGACTGGGCAAAGGC-3′)和F22(5′-CTGGCAGGGGAAGACAAGAAG-3′ )，擴(kuò)增產(chǎn)物為957 bp。根據(jù)潮霉素抗性基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，分別為Hyg F(5′-GGCGTAATAGCGAAGAGGC-3′)和Hyg R(5′-AATGTGTGAGTAGTTCCCAGA-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物為568 bp。

1.2.3標(biāo)記基因去除及高代純系的選擇

通過對(duì)T1、T2代分離株進(jìn)行鑒定，采取PCR檢測手段和浸泡潮霉素兩種方法相結(jié)合選取含有目的基因且不含標(biāo)記基因Hyg的陽性株，連續(xù)自交授粉收種，直至收獲目的基因連續(xù)兩代不分離轉(zhuǎn)基因種子為止。

圖1載體pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg的骨架

Fig.1. Skeleton of vector pCDMAR-Cry30Fa1-Hyg.

1.2.4轉(zhuǎn)基因材料主要農(nóng)藝性狀分析

在轉(zhuǎn)基因水稻株系后代選擇不僅需要選擇去除選擇標(biāo)記基因的株系，而且需要選擇農(nóng)藝性狀較好的材料。 選擇轉(zhuǎn)基因株系103、129、131和親本蜀恢818進(jìn)行抽穗期、株高、分蘗數(shù)、穗長、結(jié)實(shí)率、千粒重等農(nóng)藝性狀分析。具體方法如下：抽穗期，當(dāng)小區(qū)主穗有50%的材料抽出5 cm時(shí)記為抽穗期；株高，從水稻地面直到最高穗頂?shù)母叨?；分蘗數(shù)，對(duì)灌漿后有超過5顆種子分蘗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；主穗長，統(tǒng)計(jì)每顆水稻主穗穗尖至穗頸的長度；結(jié)實(shí)率，統(tǒng)計(jì)主穗的有效結(jié)實(shí)率；千粒重，統(tǒng)計(jì)主穗千粒重。

1.2.5轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)量檢測

對(duì)T6代連續(xù)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因水稻葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋10倍，密封后放置在-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)，根據(jù)Cry30Fa1基因編碼序列分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，上下游引物分別為30Fa1Q1-F(5′-TCCGTATGCGTTATGCC-3′)和30Fa1Q1-R(5′-GATGAAGGTTGTCCCGATT-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物為89 bp。內(nèi)參使用水稻通用的Ubi，上下游引物分別為Ubi-F(5′-GCCCAAGAAGAAGATCAAGAAC-3′)和Ubi-R(5′-AGATAACAACGGAAGCATAAAAGTC-3′)。

選取相應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系抽穗期的劍葉提取DNA，通過對(duì)Cry30Fa1基因的調(diào)取、亞克隆及表達(dá)載體構(gòu)建、原核體系蛋白表達(dá)制備抗原、采用Western Blot檢測及最后使用Thermo Scientific NanoDrop 2000通過測量目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.6抗蟲性鑒定

采用目前普遍使用標(biāo)準(zhǔn)苗期集團(tuán)篩選法 (the standard seedbox screening technique， 簡稱SSST)[18]并加以改進(jìn)，同時(shí)為了更加全面客觀地了解轉(zhuǎn)基因材料苗期的抗蟲性，增加了苗期單株試管抗蟲鑒定。試驗(yàn)中水稻材料苗期和大田抗蟲性均參考劉光杰等[19]的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，選擇陰性對(duì)照為高感褐飛虱TN1和親本材料為蜀恢818，陽性對(duì)照含Bph14、Bph15基因的抗褐飛虱株系985，處理為轉(zhuǎn)Cry30Fa1材料分別為103、129、131。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中TN1死苗率達(dá)到95%左右時(shí)，統(tǒng)計(jì)其他材料死苗率或者褐飛虱死亡率。

苗期單株試管抗蟲鑒定為了易于觀察和記錄數(shù)據(jù)，采用試管固體培養(yǎng)基在人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)水稻及養(yǎng)蟲。具體方法如下：每個(gè)株系為1個(gè)處理，每個(gè)處理1株苗，15個(gè)重復(fù)，待2～3葉時(shí)接20只2～3齡稻褐飛虱，記錄褐飛虱的存活情況。為了全面評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因材料的抗蟲性，增加了集團(tuán)苗期鑒定法。具體方法如下：1個(gè)株系為1個(gè)處理，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20株材料左右，待2～3葉期時(shí)接入2～3齡褐飛虱。

為了進(jìn)一步探究轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲性，同時(shí)采用了田間抗蟲性鑒定法。均以以上材料作為處理材料，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所海南南繁基地按照每個(gè)材料40株，3次重復(fù)，采用完全隨機(jī)的方法排列，用孔徑100目的細(xì)網(wǎng)蓋住，田間正常管理但不施農(nóng)藥，待水稻長到抽穗期，用人工方法在每個(gè)小區(qū)中心位置均勻放入帶有大量褐飛虱稻樁每天觀察，從第6天開始每天統(tǒng)計(jì)各個(gè)材料死亡情況，直到TN1死苗率為95%左右時(shí)，統(tǒng)計(jì)其他材料最終存活單株數(shù)，計(jì)算各材料水稻死亡率。以全株枯萎且失綠作為水稻死亡標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2010；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)各處理之間的差異；制圖處理使用Origin 9.0完成。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因植株的獲得

經(jīng)過胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植株再生等階段，成功獲得水稻T0代轉(zhuǎn)化植株233株，如圖2所示。

2.2轉(zhuǎn)基因抗性植株T0代的檢測

2.2.1轉(zhuǎn)基因抗性植株T0代的抗潮霉素基因檢測

取轉(zhuǎn)基因T0代植株和陰性對(duì)照蜀恢818的離體葉片在潮霉素溶液中放置5 d后觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)233株轉(zhuǎn)基因T0代植株的離體葉片中有80株一直保持綠色，其余植株的葉片與陰性對(duì)照相同，逐漸褪綠，最后完全枯黃。浸泡潮霉素結(jié)果與PCR潮霉素基因檢測結(jié)果保持一致(圖3)。浸泡潮霉素結(jié)果與PCR潮霉素基因檢測結(jié)果保持一致(圖4)。

2.2.2轉(zhuǎn)基因再生植株T0代的目的基因檢測

A-成熟胚的誘導(dǎo); B-愈傷組織的繼代; C-抗性愈傷的篩選; D-抗性愈傷的分化; E-抗性植株的生根。

A, Induction of seed; B, Subculture of callus; C, Screening of resistant callus; D, Regeneration of resistance callus; E, Rooting of resistance callus.

圖2轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的整個(gè)過程

Fig. 2. Procedure of transformation of rice.

1-陰性對(duì)照； 2，3-未轉(zhuǎn)進(jìn)潮霉素基因的植株； 4-陽性對(duì)照； 5～7-轉(zhuǎn)入潮霉素基因的植株。

1， Leaves of non-transgenic rice; 2,3， Leaves of non-Hygtransgenic rice; 4， Positive control; 5,6,7， Leaves ofHygtransgenic rice.

圖3再生植株潮霉素T0代抗性檢測

Fig. 3. Response of leaves from transgenic plants T0to hygromycin solution.

對(duì)鑒定出含潮霉素基因的80個(gè)株系進(jìn)行Cry30Fa1基因特異片段的PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，有46株為陽性，共轉(zhuǎn)化率為19.7%。蜀恢818轉(zhuǎn)Cry30Fa1基因陽性植株P(guān)CR擴(kuò)增得到片段大小為957 bp，與陽性對(duì)照相同(圖5)。

2.3標(biāo)記基因的去除及純系的選擇

經(jīng)T0代收種，連續(xù)多代對(duì)各株系PCR檢測目的基因Cry30Fa1及潮霉素基因，最后在T6代150個(gè)小區(qū)中選擇出31個(gè)株系為連續(xù)兩代不分離的株系，其中帶有標(biāo)記基因株系有15個(gè)，沒有標(biāo)記基因的陽性株系16個(gè)。余下119個(gè)小區(qū)在轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)連續(xù)兩代中存在基因分離甚至全部丟失的現(xiàn)象。

2.4純系株系農(nóng)藝性狀分析

對(duì)T6代材料中表現(xiàn)穩(wěn)定的材料103、129、131和親本蜀恢818進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析。由表1可知，有效分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重這三個(gè)農(nóng)藝性狀中轉(zhuǎn)基因材料和親本之間沒有明顯差異，但從結(jié)實(shí)率上看轉(zhuǎn)基因材料均比親本高，材料103、129有效分蘗數(shù)和千粒重上也優(yōu)于親本蜀恢818；同時(shí)在株高和主穗長上兩個(gè)轉(zhuǎn)基因材料與親本存在顯著差異。綜上可見，轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)過人工對(duì)農(nóng)藝性狀的選擇后，仍然可以選育出和親本農(nóng)藝性狀相似甚至在某些農(nóng)藝性狀上優(yōu)于親本的轉(zhuǎn)基因材料。

M-DNA 標(biāo)記，“+”表示以質(zhì)粒pCDMAR-Cry30Fa1作為陽性對(duì)照，“-”表示以未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的蜀恢818作為陰性對(duì)照；1-40為轉(zhuǎn)入Hyg的T0代植株。

M, DNA marker; “+”, Plasmid ofpCDMAR-Cry30Fa1; “-”, Non-transgenic Shuhui 818; 1-40, T0transformants carringHyg.

圖4T0轉(zhuǎn)化植株Hyg基因的PCR檢測

Fig. 4. Confirmation of Hyg gene in T0generation by PCR.

M-DNA 標(biāo)記；“+”-質(zhì)粒pCDMAR-Cry30Fa1作為陽性對(duì)照，“-”-未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的蜀恢818作為陰性對(duì)照;1～40-轉(zhuǎn)入Cry30Fa1的T0代植株。

M, DNA marker; +， Plasmid ofpCDMAR-Cry30Fa1; -, Non-transgenic Shuhui 818; 1-40, T0transformants carringCry30Fa1.

圖5T0轉(zhuǎn)化植株Cry30Fa1基因的PCR檢測

Fig. 5. Confirmation of Cry30Fa1 gene in T0plants by PCR.

2.5Bt基因轉(zhuǎn)錄水平

取T6代中表現(xiàn)穩(wěn)定的株系103、129、131和親本蜀恢818灌漿期葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(圖6)，結(jié)果顯示Cry30Fa1基因在親本蜀恢818中沒有表達(dá)，在3份轉(zhuǎn)基因材料上均有表達(dá)，但是各株系兩兩之間表達(dá)量均存在極顯著差異，其中株系129表達(dá)量最小。

2.6Bt蛋白相對(duì)表達(dá)量

采用Western Blot檢測3份穩(wěn)定材料灌漿期葉片里Bt蛋白的相對(duì)表達(dá)量(圖7)，結(jié)果顯示103、129、131這3份轉(zhuǎn)基因材料中均有Bt蛋白表達(dá)。

表1轉(zhuǎn)基因材料的主要農(nóng)藝性狀(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)

Table 1. Major agronomic traits of transgenic materials(mean±SD,n=3).

性狀Traits蜀恢818Shuhui818株系103Line103株系129Line129株系131Line131株高Plantheight/cm115.0±0.6a99.3±2.0c113.3±2.4a105.7±0.9b有效分蘗數(shù)Effectivetillernumber7.0±1.5a8.0±2.0a7.3±0.9a6.7±0.9a主穗長Mainpaniclelength/cm21.4±0.4a22.6±0.5a24.6±0.3b23.8±0.3b結(jié)實(shí)率Seed-settingrate/%70.7±3.0a78.1±1.3a79.8±3.9a77.5±2.1a千粒重1000-grainweight/g25.4±1.2a27.0±0.6a27.6±0.2a25.0±1.3a

同一行數(shù)據(jù)后帶相同字母者表示品種間差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

Within a row, data followed by the same letters show no significant difference(P>0.05).

**在0.01水平差異顯著。

**，Significant difference at 0.01 level.

圖6Cry30Fa1在灌漿期葉片中的表達(dá)情況

Fig. 6. Expression level of Cry30Fa1 in leaf at the filling stage.

株系103與129的相對(duì)表達(dá)量之間存在極顯著差異，株系129灌漿期葉片組織里蛋白相對(duì)表達(dá)量較株系103、131低。

2.7抗蟲鑒定結(jié)果

當(dāng)感稻褐飛虱材料TN1死苗率達(dá)到95%左右時(shí)，統(tǒng)計(jì)其他處理材料死苗率(圖8，表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)集團(tuán)抗蟲鑒定中親本蜀恢818死苗率均高于其他處理材料且存在顯著性差異， 3份轉(zhuǎn)基因材料與抗稻褐飛虱材料985無顯著性差異，但這4份材料抗性級(jí)別均高達(dá)7級(jí)，屬于中感材料(MS)。在單株抗蟲鑒定時(shí)，結(jié)果表明3份轉(zhuǎn)基因材料稻褐飛虱死亡率比親本蜀恢818高且呈現(xiàn)顯著性差異。對(duì)比兩個(gè)抗蟲鑒定方法可以看出，抗稻褐飛虱材料985在集團(tuán)苗期抗性上和轉(zhuǎn)基因材料抗性差異不明顯，同時(shí)在單株鑒定時(shí)抗稻褐飛虱材料985試管中褐飛虱死亡率低于3份轉(zhuǎn)基因材料且無顯著性差異。轉(zhuǎn)基因材料可能是由于表達(dá)了具有殺蟲性的Bt蛋白，造成轉(zhuǎn)基因材料的稻褐飛虱死亡率均顯著高于親本R818。

當(dāng)大田感褐飛虱材料TN1死亡率在95%左右時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(圖8，表2)，抗褐飛虱株系985水稻死亡率為0%，抗性級(jí)別為0級(jí)，屬于免疫材料(Ⅰ)；親本蜀恢818水稻死亡率為64.17%，抗性級(jí)別為7級(jí)，屬于中感材料；材料131水稻死亡率16.67%，株系103水稻死亡率29.17%，抗性級(jí)別都為3級(jí)，屬于抗材料(R)；129水稻死亡率為35.5%，抗性級(jí)別為5級(jí)，屬于中抗材料，同時(shí)3份轉(zhuǎn)基因材料與親本蜀恢818在水稻存活率上存在顯著差異，且抗性水平明顯優(yōu)于親本蜀恢818。

ns-無顯著差異； **在0.01水平差異顯著。

ns，No significant difference；**，Significant difference at 0.01 level.

圖7Cry30Fa1在灌漿期葉片中的表達(dá)情況

Fig. 7. Expression of Cry30Fa1 in leaf at the filling stage.

3討論

3.1轉(zhuǎn)基因材料的獲得及選育

程海鵬等[20]研究表明，多拷貝插入基因容易造成基因沉默，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致后代的遺傳和抗性不穩(wěn)定。本研究經(jīng)過轉(zhuǎn)基因水稻連續(xù)多代的自交分離選擇了31份純系的轉(zhuǎn)基因材料，但仍有株系高代分離和丟失基因的現(xiàn)象存在，這與前人研究結(jié)果相似。有研究表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，外源基因的插入是一個(gè)隨機(jī)的過程， 有可能插入某個(gè)基因內(nèi)部而造成農(nóng)藝性狀的變化，外源基因拷貝數(shù)越高，其農(nóng)藝性狀變異越大[21]。通過對(duì)3份轉(zhuǎn)基因材料的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，我們可以看出通過連續(xù)多次的人工選育及分子標(biāo)記選擇，仍然可以獲得農(nóng)藝性狀變化不大的轉(zhuǎn)基因株系，根據(jù)前人的研究結(jié)果猜測這3份轉(zhuǎn)基因材料可能是低拷貝轉(zhuǎn)基因株系，同時(shí)接下來需要對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行分析予以驗(yàn)證。

3.2轉(zhuǎn)基因材料分子水平的表達(dá)

A-單株抗蟲性鑒定; B-苗期集團(tuán)抗蟲鑒定; C-大田抗蟲性鑒定。

A, Individual identification of pest resistance; B, Pest resistance identification in seedling group; C, Field identification of pest resistance.

圖8三種不同抗蟲鑒定方法的鑒定結(jié)果

Fig. 8. Pest resistance identification results by three different methods.

在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分析外源基因表達(dá)時(shí)，往往容易出現(xiàn)個(gè)別樣品在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平不一致的問題[22]，在轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)常影響目的基因的表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性[23]。通過對(duì)31份轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot蛋白分析，31份材料在轉(zhuǎn)錄水平均有表達(dá)，但有6份材料沒有蛋白表達(dá)，這可能由于蛋白表達(dá)量過低無法檢測到或者翻譯受阻造成蛋白未表達(dá)；同時(shí)我們對(duì)3份材料進(jìn)行重點(diǎn)分析，3份材料在基因表達(dá)量和目標(biāo)蛋白表達(dá)量上均有差異且兩者差異變化趨勢相同，可以看出基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)。

表2不同鑒定方法下水稻抗蟲性的分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3)

Table 2. Insect resistance of rice by different identification methods(mean± SD, n=3).

%

同一行數(shù)據(jù)后帶相同字母者表示品種間差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

Within a row, data followed by the same letter show no significant difference(P>0.05).

3.3轉(zhuǎn)基因材料抗蟲性鑒定

目前水稻品種抗性篩選中最常用的為標(biāo)準(zhǔn)苗期集團(tuán)篩選法，該法僅能反應(yīng)出水稻品種幼苗階段的抗性水平，可能使得一些具有成株期抗性的品種得不到利用[24]，且水稻生產(chǎn)過程中苗期飛虱數(shù)量極少，通常要到成株期才能表現(xiàn)出大量飛虱的侵害，大田抗性鑒定因其與水稻生產(chǎn)安全緊密相關(guān)而越來越受到重視[25]；同時(shí)，汪秀峰等[26]研究表明，不同生育期Bt蛋白的表達(dá)量不同，在水稻生長旺盛的時(shí)期表達(dá)量相對(duì)較高，故這個(gè)時(shí)候檢測的準(zhǔn)確性更高。本研究采用3種不同抗蟲性鑒定方法的目的在于探究轉(zhuǎn)基因水稻株系真實(shí)的抗蟲性。研究表明，通過單株試管鑒定法說明轉(zhuǎn)基因株系有一定的殺稻褐飛虱效果。雖然標(biāo)準(zhǔn)苗期集團(tuán)篩選法結(jié)果顯示苗期材料均不抗褐飛虱，但轉(zhuǎn)基因材料的死苗率較親本材料出現(xiàn)了明顯改善；田間水稻抗蟲性鑒定結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因材料129達(dá)到中抗水平，材料103和131達(dá)到了抗的水平。以上結(jié)論表明水稻成株期與苗期的抗性存在不同的情況，這與前人的研究結(jié)果有相似的地方，說明水稻抗性鑒定需要苗期和大田相結(jié)合。

單株鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因材料存在一定殺蟲效果，但是殺蟲效果并沒有達(dá)到較高的水平。以上現(xiàn)象我們推測可能是由于在水稻苗期Bt蛋白表達(dá)有限或者苗期水稻生命力弱而不足以抵抗褐飛虱侵害；同時(shí)在單株抗蟲鑒定中出現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因材料中褐飛虱死亡情況，分析可能是由于褐飛虱比較弱小掉落在固體培養(yǎng)基上不能移動(dòng)造成饑餓致死或者可能由于前期死亡的水稻單株里褐飛虱不能長期取食以致死亡。這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

于志晶等[26]的研究表明，Bt蛋白含量與其抗蟲性表現(xiàn)基本成正比。束春娥等[27]的研究表明，殘蟲量達(dá)到防治指標(biāo)時(shí)， 必須及時(shí)輔以化學(xué)防治。本研究通過對(duì)田間抗蟲結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期抗蟲性有所差異，分析原因有可能是這3份轉(zhuǎn)基因材料Bt蛋白表達(dá)量較少，造成殺蟲效果欠佳；當(dāng)然也有可能是由于加蓋透氣網(wǎng)在褐飛虱危害后期蟲口壓力過大，未及時(shí)輔以化學(xué)防治以致出現(xiàn)抗蟲數(shù)據(jù)偏差。

為了獲得轉(zhuǎn)基因抗稻褐飛虱的優(yōu)良恢復(fù)系材料，我們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入抗稻褐飛虱Bt基因并對(duì)基因進(jìn)行分子水平檢測，同時(shí)也采取了兩種苗期抗蟲性鑒定和田間抗蟲性鑒定。綜上所述，本研究已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了一個(gè)新的抗蟲基因(Cry30Fa1基因)的優(yōu)化及成功轉(zhuǎn)化，篩選出了多個(gè)具有抗蟲性的轉(zhuǎn)基因純合株系，為以后培育更多的抗稻褐飛虱水稻創(chuàng)造了新的材料。

謝辭：特別感謝中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱禎實(shí)驗(yàn)室提供pCDMAR-Hyg載體；感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所王鋒實(shí)驗(yàn)室提供轉(zhuǎn)基因技術(shù)幫助。

在線輔助信息：表S1放在中國水稻科學(xué)網(wǎng)站，網(wǎng)址為(http://www.ricesci.cn/CN/articl/showSupportInfo.do？id=2597)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dinh H D, Cuong N D, Tai N D, et al. Analysis of rice pest constraints based on survey data at Tan Phu Thanh village, Cantho Province.Omonrice， 2001, 9: 102 -106.

[2]Settle W H, Ariawan H, Astuti E T, et al. Managing tropical rice pests through conservation of generalist natural enemies and alternative prey.Ecology，1996, 77(7): 1975-1988.

[3]楊瑞芳, 白建江, 樸鐘澤, 等. 轉(zhuǎn)cry1Ac1基因抗蟲水稻的培育. 分子植物育種, 2014, 12(6): 1103-1111.

Yang R F, Bai J J, Piao Z Z, et al. Development of insect-resistant transgenic rice withcry1Ac1 gene.MolPlantBreeding, 2014, 12(6): 1103-1111.(in Chinese with English abstract)

[4]胡巍, 李艷芳, 胡侃, 等. 分子標(biāo)記輔助選擇抗褐飛虱基因改良桂農(nóng)占的BPH抗性. 分子植物育種, 2015, 13(5): 951-960.

Hu W, Li Y F, Hu K, et al. Improving BPH-resistance of rice cultivar Guinongzhan by marker-assisted selection for BPH-resistant genes.MolPlantBreeding, 2015, 13(5): 951-960.

[5]Swaminathan M S. The Hindu Survey of Indian Agriculture. The Hindu Group of Publications, 1999: 9-16.

[6]吳振映, 柳絮, 王文英, 等. 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)cry2A抗蟲基因水稻的研究. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(5): 1-37.

Wu Z Y, Liu X, Wang W Y, et al. Development of japonica rice with insect-resistant geneCry2A* byagrobacterium-mediated transformation.ShandongAgricSci，2011(5): 1-37.(in Chinese with English abstract)

[7]祁永斌, 葉勝海, 陸艷婷, 等. 轉(zhuǎn)Cry1A(b)基因抗蟲水稻的獲得及鑒定. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 19(4): 264-267.

Qi Y B, Ye H S, Lu Y T, et al. Development and identification of insect resistant transgenic rice withCry1A(b) gene.ActaAgricZhejiang， 2007, 19(4): 264-267.(in Chinese with English abstract)

[8]于志晶, 劉麗, 李淑芳, 等. 轉(zhuǎn)Cry1C*基因抗蟲水稻的培育. 分子植物育種, 2011, 9(6): 702-708.

Yu Z J, Liu L, Li S F, et al. Development of transgenic insect-resistant japonica rice withCry1C* gene.MolPlantBreeding， 2011, 9(6): 702-708.(in Chinese with English abstract)

[9]Rao K V, Rathore K S, Hodges T K, et al. Expression of snowdrop lectin( GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper.PlantJ, 1998, 15(4): 469-477.

[10]左示敏, 張平, 祝樹德, 等. 水稻轉(zhuǎn)GNA基因后代對(duì)褐飛虱的抗性研究. 作物學(xué)報(bào), 2004, 30(4): 371-375.

Zuo S M, Zhang P, Zhu S D, et al. Resistance to brown plant hopper in progenies of GNA transgenic rice.ActaAgronSin，2004, 30(4): 371-375.(in Chinese with English abstract)

[11]鄒良平, 起登鳳, 李平, 等. 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PTA基因?qū)胨镜难芯? 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2005, 18(3): 229-233.

Zuo L P, Qi D F, Li P, et al. Studies on transformation of the pinellia tenata agglutinin (pta) gene into rice mediated by agrobacterium.SouthwestChinaJAgricSci，2005, 18(3): 229-233.(in Chinese with English abstract)

[12]康俊梅, 熊恒碩, 楊青川, 等. 植物抗蟲轉(zhuǎn)基因工程研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2008, 1: 14-19.

Kang J M, Xiong H S, Yang Q C, et al. Progress on genetic engineering of plant for insect resistance.BiotechnolBull，2008, 1: 14-19.(in Chinese with English abstract)

[13]Zhu J, Zheng A P, Wang S Q, et al. Characterization and expression ofcry4Cb1 andcry30Ga1 fromBacillusthuringiensisstrain HS18-1.JInvertPathol，2009, 103(3): 200-202.

[14]Guan P, Dai X J, Zhu J, et al. Characterization of thecry54Ab1 operon ofBacillusthuringiensissubsp.sichuansisstrain MC28.BiocontSciTechnol，2014, 24(1): 80-89.

[15]Tan F R, Zhu J, Tang J, et al. Cloning and characterization of two novel crystal protein genes,cry54Ab1 andCry30Fa1, fromBacillusthuringiensisStrain BtMC28.CurrMicrobiol，2009, 58(6): 654-659.

[16]周宗梁, 林智敏, 耿麗麗, 等. 水稻中cry1Ah1基因密碼子優(yōu)化方案的比較. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(10):1184-1194.

Zhou Z L, Lin Z M, Geng L L, et al. Comparison of codon optimizations ofcry1Ah1 gene in rice.ChinJBiotechnol，2012, 28(10):1184-1194.(in Chinese with English abstract)

[17]李雙成, 王世全, 尹福強(qiáng), 等. 提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻效率的因素. 中國水稻科學(xué), 2005, 19(3): 231-237.

Li S C, Wang S Q, Yin F Q, et al. Some factors affectingagrobacterium-mediated transformation frequency in rice.ChinJRiceSci，2005, 19(3): 231-237.(in Chinese with English abstract)

[18]Heinrichs E A, Medrano E G, Rapusas H R. Genetic evaluation for insect resistance in rice. Manila: IRRI，1985, 72-177.

[19]劉光杰, 付志紅, 沈君輝, 等. 水稻品種對(duì)稻飛虱抗性鑒定方法的比較研究. 中國水稻科學(xué), 2002, 16(1): 52-56.

Liu G J, Fu Z H, Shen Q H, et al. Comparative study on evaluation methods for resistance to rice planthoppers (Homoptera: Delphacidae) in rice.ChinJRiceSci，2002, 16(1): 52-56.(in Chinese with English abstract)

[20]程海鵬, 朱睦元, 金偉, 等. 植物轉(zhuǎn)基因沉默研究進(jìn)展. 生物工程進(jìn)展, 2001, 21 (6): 47-49.

Cheng H P, Zhu M Y, Jin W, et al. Advances of researches on the plant transgene silencing.ProgBiotechnol，2001, 21(6): 47-49.(in Chinese with English abstract)

[21]唐微. 轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)對(duì)農(nóng)藝性狀的影響. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(32):13991-13992.

Tang W. Effects of trans gene copy number on agronomic characters of transformed plants.JAnhuiAgricSci，2008, 36(32): 13991-13992.(in Chinese with English abstract)

[22]Hiwasa-Tanase K, Nyarubona M, Hirai T, et al. High-level accumulation of recombinant miraculin protein in transgenic tomatoes expressing a synthetic miraculin gene with optimized codon usage terminated by the native miraculin terminator.PlantCellRep， 2011, 30(1): 113-124.

[23]王育花, 趙森, 陳芬, 等. 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)的研究. 生命科學(xué)研究, 2007, 11(4): 301-305.

Wang Y H, Zhao S, Chen F, et al. Estimation of the copy number of exogenous gene in transgenic rice by real-time fluorescence quantitative PCR.LifeSciRes, 2007, 11(4): 301-305.(in Chinese with English abstract)

[24]陳峰, 傅強(qiáng), 羅舉, 等. 苗期抗性不同的水稻品種成株期對(duì)褐飛虱的抗性. 中國水稻科學(xué), 2009, 23(2): 201-206.

Chen F, Fu Q, Luo J, et al. Adult stage resistances to brown planthopper,Nilaparvatalugensof rice varieties with different seedling resistances.ChinJRiceSci， 2009, 23(2): 201-206.(in Chinese with English abstract)

[25]胡杰, 楊長舉, 張慶路, 等. 基因聚合改良雜交稻組合的稻飛虱田間抗性表現(xiàn). 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2011, 48(5): 1341-1347.

Hu J, Yang C J, Zhang Q L, et al. Resistance of pyramided rice hybrids to brown planthoppers.ChinJApplEntomol，2011, 48(5): 1341-1347.(in Chinese with English abstract)

[26]汪秀峰, 葉芬, 李莉, 等. 轉(zhuǎn)基因水稻恢復(fù)性及其F1代Bt蛋白的時(shí)空表達(dá)分析. 分子植物育種, 2014, 12(6): 1077-1081.

Wang X F, Ye F, Li L, et al. Temporal and spatial expression of Bt toxin in transgenic restorer line and its F1hybrids.MolPlantBreeding， 2014, 12(6): 1077-1081.(in Chinese with English abstract)

[27]于志晶, 蔡勤安, 林秀峰, 等. 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻中 Bt 蛋白表達(dá)量的研究. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(6): 3251-3252.

Yu Z J, Cai Q A, Lin X F, et al. Expression of Bt protein in transgenic insect-resistant rice.JAnhuiAgricSci，2012, 40(6): 3251-3252.(in Chinese with English abstract)

[28]束春娥, 孫以文, 孫洪武. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉承受棉鈴蟲風(fēng)險(xiǎn)壓力研究初報(bào). 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000(4): 38-41.

Su C E, Sun Y W, Sun H W. Primary report on studying transgenic insect resistant cotton under risk pressure fromHelicoverpaarmigera.JiangsuAgricSci，2000(4): 38-41.(in Chinese with English abstract)

Development and Identification of Insect Resistant Transgenic Rice withCry30Fa1 Gene

WANG Hai-peng， HUANG Xiao-xi， LIANG Yue-yang, ZHU Jun, ZHANG Cui-xia, WANG Xiu-mei, GONG Chang-wei, ZHENG Ai-ping, DENG Qi-ming, LI Shuang-cheng， WANG Ling-xia, LI Ping， WANG Shi-quan*

(RiceResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China;*Corresponding author, E-mail: sqwangscau@163.com)

WANG Haipeng, HUANG Xiaoxi, LIANG Yueyang, et al. Development and identification of insect resistant transgenic rice withCry30Fa1 gene. Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 256-264.

Abstract:Modified Cry30Fa1, a Bacillus thuringiensis (Bt) gene encoding a high-efficiency insecticidal protein to the brown planthopper(BPH),was introduced into Shuhui 818(R818) by Agrobacterium-mediated genetic transformation and 46 transgene lines were obtained. We confirmed the valid transformation by RT-qRCR and Western blot at transcriptional level and translational level, and fixed the stable expression Cry30Fa1 in homozygosis. The classical pedigree breeding methods were also used to select the important agronomic traits in transgenic lines. Furthermore, we evaluated the resistance to BPH of different lines in growth chamber and field, and found that the R818-Cry30Fal displayed higher resistance than untransformed R818 in seedling stage. We also observed the reduced population of BPH feeding the transgenic lines, suggesting that the transformed Cry30Fa1 enhanced resistibility to BPH in rice. We cultivated new BT protein transgenic rice restorer line R818-Cry30Fal, which may provide new BPH resistance material to three line hybrid rice breeding and enrich BPH resistance germplasm resources in rice.

Key words:brown planthopper; Agrobacterium-mediated method; insect resistance; Cry30Fa1

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5190

收稿日期:2015-12-25； 修改稿收到日期: 2016-01-15。

基金項(xiàng)目:國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2011ZX08001001)。

中圖分類號(hào):Q786;S435.112+.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-7216(2016)03-0256-09

中國水稻科學(xué)(Chin J Rice Sci),2016,30(3):256-264

http://www.ricesci.cn