植酸酮對人宮頸癌細胞增殖的影響

高曉麗，王侃，田文艷，岳天孚

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植酸酮對人宮頸癌細胞增殖的影響

高曉麗#，王侃#，田文艷，岳天孚

【摘要】目的：研究不同濃度植物提取物植酸酮在不同作用時間對兩種宮頸癌細胞系增殖的影響。方法：以培養(yǎng)基稀釋植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號及2號至相應(yīng)濃度，采用噻唑藍（MTT）比色法檢測不同藥物濃度對宮頸癌HeLa細胞［腺癌，含人乳頭狀瘤病毒18（HPV18）基因］及Caski細胞（鱗癌，含HPV16基因）不同時間點的增殖抑制率。結(jié)果：植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號及2號試劑對HeLa及Caski細胞增殖的抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性。不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號及2號試劑對HeLa及Caski細胞增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），細胞增殖抑制率隨給藥濃度增加作用增強，濃度為5 860 mg/L、5 500 mg/L細胞增殖抑制率最高。同一給藥濃度不同作用時間對細胞增殖抑制率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：植酸酮對宮頸癌細胞系增殖具有抑制作用，可為臨床上植酸酮抗HPV治療宮頸病變及宮頸癌提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】植酸酮；宮頸腫瘤；癌；人宮頸癌細胞；乳頭狀瘤病毒科

作者單位：300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科

（J Int Obstet Gynecol，2016，43：184-186）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占女性所有惡性腫瘤的13%，僅次于乳腺癌［1］。持續(xù)性人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)［1］。國內(nèi)外學(xué)者對植物成分化合物抗HPV的藥效均進行了大量的實驗觀察，如植物Bryophyllum pinnata葉提取物［2］、黃連素［3］等，研究提示部分植物或植物提取物存在抗HPV效應(yīng)。植酸酮是一種植物提取物，前期研究發(fā)現(xiàn)，植酸酮治療高危型HPV感染合并宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）Ⅰ有顯著療效，并有效抑制宮頸癌HeLa細胞的生長［4-5］。本研究進一步在細胞水平上證實植酸酮對宮頸癌細胞系增殖的影響，以期為臨床上植酸酮抗HPV治療宮頸病變及宮頸癌提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料與試劑HeLa細胞（南開大學(xué)生命科學(xué)院劉新奇教授實驗室惠贈；腺癌，含HPV18基因）；Caski細胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所惠贈；鱗癌，含HPV16基因）；植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型（美?？?，1號及2號，天津賢博醫(yī)療科技有限公司惠贈）。HyClone RPMI 1640培養(yǎng)基、HyClone高糖改良杜氏伊格爾（DMEM/high glucose）培養(yǎng)基、HyClone 0.25%胰酶-依地酸（EDTA，北京賽默飛世爾科技有限公司）；Gibco胎牛血清（上海拜力生物科技有限公司）；噻唑藍（MTT，上海生工生物工程股份有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海生工生物工程股份有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，240i直熱式CO2培養(yǎng)箱）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，CKX41）；離心機（德國eppendorf公司）；酶標儀（美國Bio Tek公司，Synergy 4酶標儀）；微量移液器（2.5 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL，德國eppendorf公司）；各種培養(yǎng)器皿（25 cm2培養(yǎng)瓶、75 cm2培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板，美國Corning公司）。

1.2藥物濃度配置培養(yǎng)基稀釋植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號及2號至相應(yīng)濃度，充分搖勻離心過濾去除細菌及固體成分，1號配制濃度分別為5 860 mg/L（1∶1）、586 mg/L（1∶10）、117 mg/L（1∶50）、58.6 mg/L（1∶100），2號配置濃度為5 500 mg/L （1∶1）、550 mg/L（1∶10）、110 mg/L（1∶50）、55 mg/L（1∶100）。

1.3細胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期的HeLa細胞及Caski細胞，培養(yǎng)基分別為DMEM（完全高糖）培養(yǎng)基及1640培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。按細胞種類分別加入不同濃度含1號藥（58.6，117，586，5 860 mg/L）和2號藥（55，110，550，5 500 mg/L）的培養(yǎng)液，設(shè)置一個加不含藥物培養(yǎng)液的對照組和一個空白調(diào)零組，各組均設(shè)6個復(fù)孔。

1.4MTT比色法檢測藥物對腫瘤細胞生長的影響將上述細胞在不同時間點（24，48，72，96 h）分別取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液，加入100 μL新鮮培養(yǎng)液及10 μL 0.5%MTT溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄上清，避光條件下加入150 μL DMSO，低速震蕩10 min使孔底藍紫色結(jié)晶完全溶解并充分混勻。酶標儀上測定各孔490 nm波長下光密度（OD）值。實驗重復(fù)3次，按抑制率=（1－加藥組OD值/對照組OD值）× 100%，繪制2種藥物不同濃度不同時間對兩種宮頸癌細胞的藥物抑制率曲線。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用重復(fù)測量資料的方差分析進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號對HeLa細胞及Caski細胞增殖的影響不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號試劑對HeLa細胞增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F濃度=359.234，P＜0.001），作用時間相同時，細胞增殖抑制率隨給藥濃度增加作用增強，濃度為5 860 mg/L細胞增殖抑制率最高。同一給藥濃度不同作用時間對HeLa細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=625.400，P＜0.001）。給藥濃度和作用時間對HeLa細胞增殖具有交互作用（F交互= 36.097，P＜0.001）。見表1。

表1　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號試劑作用不同時間對HeLa細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

表1　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號試劑作用不同時間對HeLa細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

藥物濃度（mg/L）作用時間24 h　48 h　72 h　96 h 58.6　 -8.95±3.56　 5.67±3.88　 10.50±2.89　 18.90±3.66 117　 4.67±2.85　 8.99±2.36　 17.90±4.55　 38.90±3.90 586　 8.65±5.97　 9.86±4.27　 33.20±2.07　 44.80±4.78 5 860　 10.52±3.89　 17.91±5.71　 58.30±2.89　 65.30±4.98

不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號試劑對Caski細胞增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F濃度= 1 305.980，P＜0.001），細胞增殖抑制率隨給藥濃度增加作用增強，濃度為5 860 mg/L細胞增殖抑制率最高。同一給藥濃度不同作用時間對Caski細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=273.527，P＜0.001）。給藥濃度和作用時間對Caski細胞增殖具有交互作用（F交互=36.395，P＜0.001）。見表2。

表2　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號試劑作用不同時間對Caski細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

表2　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號試劑作用不同時間對Caski細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

藥物濃度（mg/L）作用時間24 h　48 h　72 h　96 h 58.6　 3.67±1.24　 5.78±2.35　 13.60±4.08　 28.60±3.97 117　 4.92±0.98　 10.88±1.40　 15.70±2.11　 39.30±3.21 586　 28.20±1.74　 30.50±2.19　 44.80±2.07　 49.70±3.11 5 860　 33.10±2.76　 52.10±3.31　 55.90±2.07　 48.20±3.22

2.2植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑對HeLa細胞及Caski細胞增殖的影響不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑對HeLa細胞增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F濃度=166.043，P＜0.001），細胞增殖抑制率隨給藥濃度增加作用增強，濃度為5 500 mg/L細胞增殖抑制率最高。同一給藥濃度不同作用時間對HeLa細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=912.519，P＜0.001）。給藥濃度和作用時間對HeLa細胞增殖具有交互作用（F交互=8.312，P＜0.001）。見表3。

表3　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑作用不同時間對HeLa細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

表3　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑作用不同時間對HeLa細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

藥物濃度（mg/L）作用時間24 h　48 h　72 h　96 h 55　 -3.57±0.88　 -8.98±3.12　 6.28±1.26　 29.20±4.12 110　 -5.78±1.36　 -3.98±2.87　 8.07±4.78　 38.50±3.75 550　 6.23±2.88　 9.66±3.76　 16.89±2.85　 46.80±4.89 5 500　 7.92±2.44　 11.78±3.09　 18.48±6.34　 55.88±2.67

不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑對Caski細胞增殖抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F濃度= 682.277，P＜0.001），細胞增殖抑制率隨給藥濃度增加作用增強，濃度為5 500 mg/L細胞增殖抑制率最高。同一給藥濃度不同作用時間對Caski細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=1 466.032，P＜0.001）。給藥濃度和作用時間對Caski細胞增殖具有交互作用（F交互=49.136，P＜0.001）。見表4。

3　討論

目前，宮頸癌已經(jīng)明確為感染性疾病，HPV疫苗的開發(fā)和研制為宮頸癌的防治開辟了新的科研領(lǐng)域。但是對于已經(jīng)感染HPV的患者，尚無療效確切的藥物。隨著研究的進展，中藥抗病毒的藥效、安全性得到廣泛認可，抗病毒確切的分子機制也正在不斷揭示。研究表明，HeLa細胞基因組內(nèi)包含HPV18的基因序列［6-7］。由于HPV病毒顆粒離開宿主細胞后很難存活，HeLa細胞成為了對HPV基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行研究的常見工具。宮頸癌細胞株Caski源自一位40歲的宮頸鱗癌白人患者小腸腸系膜轉(zhuǎn)移灶，據(jù)報道，其含有完整的HPV16序列，每個細胞大約600個拷貝［8-9］。因此，本研究選擇這兩種細胞為研究對象，通過含植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型的培養(yǎng)液對宮頸癌細胞的直接作用，觀察藥物對HPV感染細胞的體外增殖的影響。本研究發(fā)現(xiàn)植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型有抑制HPV基因陽性宮頸癌細胞生長的作用，初步探討了植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型抗HPV的可能。同時，由于體內(nèi)、外環(huán)境有顯著差異，植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型在體內(nèi)作用的機制是否與體外實驗相同及其更深入的分子機制尚需進一步研究。

表4　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑作用不同時間對Caski細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

表4　不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型2號試劑作用不同時間對Caski細胞增殖抑制率的影響（n=6，%，±s）

藥物濃度（mg/L）作用時間24 h　48 h　72 h　96 h 55　 -3.78±0.29　 -4.55±0.63　 12.10±2.33　 32.60±3.22 110　 5.77±1.10　 1.33±0.04　 15.66±2.11　 42.09±3.61 550　 8.86±2.57　 13.31±1.98　 22.46±2.11　 54.62±1.84 5 500　 11.68±1.05　 38.89±2.49　 44.52±2.15　 58.45±3.62

植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型為植酸酮婦科清洗裝置，由植物提取素植酸酮等制作而成的植物提取物和一次性助推器組成。該產(chǎn)品分為1號和2號兩種，前者主要用于清除HPV，后者主要用于治療后的養(yǎng)護以及治療作用的鞏固。植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型活性成分為植物提取素，含植酸、硅酮、黃酮等。前期實驗表明植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型用于治療高危型HPV感染合并CINⅠ有顯著療效［4］。在體外實驗中植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型1號和2號均能有效抑制宮頸癌HeLa細胞的生長［5］。目前已知植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型的作用機制包括改變HPV生存的pH值內(nèi)環(huán)境，使HPV病毒衣殼蛋白L1、L2變性壞死，從而阻斷其復(fù)制；促進宮頸表面微小創(chuàng)口愈合，阻斷HPV進入宿主細胞；誘導(dǎo)機體產(chǎn)生HPV免疫，從而防止同種亞型再次感染；促進增生的柱狀細胞凋亡，鱗狀上皮細胞恢復(fù)，CINⅠ、CINⅡ逆轉(zhuǎn)。

本研究通過觀察不同濃度植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型在不同作用時間對不同宮頸癌細胞株增殖的抑制作用，明確了其對含HPV16基因的Caski細胞株和含HPV18基因的HeLa細胞株增殖存在時間和藥物濃度依賴性的抑制作用，藥物濃度越高，作用時間越長，對腫瘤細胞抑制作用越強。關(guān)于植酸酮婦科清洗裝置Ⅱ型對不同宮頸癌細胞株是否具有相同的抑制增殖的作用及其作用機制，是否通過影響HPV E6、E7基因表達降低相應(yīng)蛋白發(fā)揮作用，尚需進一步研究探索。

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［本文編輯王昕］

Effects of Phytic Acid Ketone on the Cell Proliferation of HeLa and Caski

GAO Xiao-li，WANG Kan，TIAN Wen-yan，YUE Tian-fu. Department of Obstetrics and Gynecology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

【Abstract】Objective：To investigate the proliferation inhibitory effects of different density Phytic Acid Ketone on cervical cancer cell HeLa and Caski. Methods：Use the culture medium to dilute the type II No.1 and No.2 Phytic Acid Ketone to different density. The HeLa（adeno carcinoma，HPV18 genome integrated）and Caski（squamous carcinoma，HPV16 genome integrated）cells were treated with different concentration and time of Mefordcare. The inhibitory effects were evaluated with MTT assay. Results：The growth of HeLa and Caski was inhibited by different concentration of Mefordcare Phytic Acid Ketone，which was concentration-time dependent. The inhibitory effect on HeLa and Caski of Phytic Acid Ketone No. 1 and No. 2 varied with the concentration used，and the inhibitory rate came to the peak when concentration was about 5 860 mg/L and 5 500 mg/L. The inhibitory rate of cell proliferation was significantly different with the treating time at the same concentration（P＜0.05）. Conclusions：There were inhibitory effects from Phytic Acid Ketone on the growth of cervical cancer cell line HeLa and Caski. The result provides theoretical basis for the clinical application of Mefordcare Phytic Acid Ketone.

【Keywords】Phytic acid ketone；Cervical cancer；Cancer；Human cervical cancer cell；Human papillomavirus

通信作者：岳天孚，E-mail：yuetianfu163@163.com#共同第一作者

Corresponding author：YUE Tian-fu，E-mail：yuetianfu163@163.com

收稿日期：（2015-09-11）