植物染色體制片方法的改進(jìn)

肖春林（兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆　五家渠　831300）

植物染色體制片方法的改進(jìn)

肖春林
（兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠831300）

摘要：以普通小麥（2n = 6x = 42）為材料，對(duì)其種子進(jìn)行發(fā)根，取其根尖分生區(qū)進(jìn)行酶解法染色體制片。對(duì)比常規(guī)壓片和去壁低滲火焰干燥法制片技術(shù)，酶解法制片技術(shù)易獲得更好的分裂相，分布更加均勻的染色體片，更有利于后期的原位雜交進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：小麥；根尖分生區(qū)；染色體制片

植物染色體制片技術(shù)是植物細(xì)胞遺傳學(xué)、染色體工程、植物細(xì)胞生物學(xué)、植物細(xì)胞分類學(xué)和物種生物學(xué)等眾多學(xué)科的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)[1]。對(duì)于染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)、遺傳行為及細(xì)胞變異等遺傳學(xué)現(xiàn)象的分析，可以大大提高作物育種工作的效率和質(zhì)量。因此，改善并提高染色體制片技術(shù)顯得尤為重要。目前常用的染色體制片技術(shù)有2種，即普通壓片技術(shù)和去壁低滲火焰干燥技術(shù)。前者雖然操作簡(jiǎn)單實(shí)用，但是需要制片者取材時(shí)間適宜，壓片力量適中，對(duì)操作者的熟練程度要求較高；且處理一些細(xì)胞壁堅(jiān)硬、難以軟化的材料時(shí)，也不易獲得良好的制片[2-3]。后者相比前者，需要的制片經(jīng)驗(yàn)較少，且制片效果較好，但操作過程涉及酒精燈，需要火焰干燥和蓋玻片壓片，對(duì)染色體造成部分影響。酶解法在兩者技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)部分實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行了改善，不僅可以得到分散良好的有絲分裂中期分裂相，而且還縮短了酶解的時(shí)間,提高了制片的效率，從而獲得更好的染色體制片，為細(xì)胞學(xué)觀察及相關(guān)的原位雜交（GISH）實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1材料來源

市場(chǎng)購(gòu)買的普通小麥種子。

1.2材料制備

1.2.1冷處理

將普通小麥種子置于裝有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，小麥腹溝朝下貼在濾紙上，于4℃冰箱冷處理24h。

1.2.2發(fā)根、剪根

冷處理的種子放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以上，待根尖長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)剪下。

1.2.3預(yù)處理

濕潤(rùn)根尖裝于2mLEP管中，笑氣處理2h左右。

1.2.4固定、保存

預(yù)處理的根尖用90%冰醋酸浸泡3～5 min后轉(zhuǎn)入70%酒精中，4℃冰箱保存。

1.2.5清洗

用鑷子取出固定根尖，蒸餾水反復(fù)漂洗3次，清洗干凈后用絲巾擦盡根尖水珠。

1.2.6配制酶液

將提前配好的纖維素酶0.02 g與果膠酶0.01 g溶于1 mL檸檬酸鈉緩沖液（滅菌）中，每20 μL分裝于EP管中。

1.2.7酶解

剪取根尖分生區(qū)（乳白色）2mm左右，紙巾擦干其上水分，置于20 μL酶液EP管中，37℃水浴1h左右。

1.2.8漂洗、脫水

吸干EP管中酶液，加入50 μL蒸餾水，反復(fù)漂洗3次；吸盡EP管中蒸餾水，加100%C2H5OH脫水2次。

1.2.9滴片、照相

每一根尖加20 μL冰醋酸，用20 μL白色槍頭搗碎根尖1 min，吸取10 μL溶液滴于載玻片上，加蓋玻片，相差顯微鏡下觀察照相。

1.3.0永久封片

液氮冷凍后用刀片將蓋玻片和載玻片分離，分別干燥后用“指甲油”進(jìn)行封片處理。

2　結(jié)果與討論

按照酶解法制得的小麥根尖染色體片（未染色）如圖1，染色體形態(tài)比清晰，且分布比較均勻，都為42條。但需要注意的是，用此方法制片若纖維素酶與果膠酶的比例濃度不夠，在顯微鏡下觀察時(shí)，會(huì)出現(xiàn)染色體重疊、分散不均勻或細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)仍存在的現(xiàn)象，影響染色體的觀察。

圖1　普通小麥根尖分生區(qū)染色體圖（2n = 6x = 42）

相比常規(guī)染色體制片方法，酶解法優(yōu)點(diǎn)在于：（1）預(yù)處理中（笑氣處理）相比傳統(tǒng)的冰水混合物需處理24 h以上，該方法僅為2 h左右，大大縮短了處理時(shí)間；（2）對(duì)常規(guī)壓片法中碰到細(xì)胞壁等堅(jiān)硬無法軟化的材料，酶解法利用纖維素酶和果膠酶可以溶解細(xì)胞壁、部分細(xì)胞質(zhì)及兩者之間的果膠物質(zhì)，充分軟化分散細(xì)胞，使染色體分布均勻；（3）避免了常規(guī)制片法中的手指壓片及解剖針敲擊來分散染色體并使之處于同一平面上的操作經(jīng)驗(yàn)和力度問題；（4）整個(gè)操作過程中僅酶液濃度的酶解時(shí)間需要精確掌控，其他操作較規(guī)范，易把握。

參考文獻(xiàn)

[1]李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：63-66.

[2]王幼平.植物染色體制片方法的改進(jìn)[J].生物學(xué)通報(bào)，2007，42 （10）：55.

[3]蒿若超，武美燕.一種植物染色體制片改良方法[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，8（2）：236-238.

收稿日期：2016—01—11