非甾體類抗炎藥NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901的影響

范占彬隆堯縣醫(yī)院普外科，河北隆堯　055350

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非甾體類抗炎藥NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901的影響

范占彬
隆堯縣醫(yī)院普外科，河北隆堯055350

［摘要］目的探討環(huán)氧合酶抑制劑NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901的生物學(xué)行為的影響。方法2014年6—12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實驗室，用MTT、DNA梯度降解試驗及流式細(xì)胞儀等方法，研究NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用。結(jié)果NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901產(chǎn)生明顯的生長抑制作用，且表現(xiàn)為劑量依賴性（F=35.984，P＜0.01）；DNA梯度降解試驗、流式細(xì)胞儀分析NS398濃度依賴性地誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞株SCG7901凋亡（F= 12.414，P＜0.01），且凋亡與細(xì)胞周期受阻有關(guān)（F=21.315，P＜0.01），主要阻止在S/G2期。結(jié)論NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901具有顯著濃度依賴性的體外生長抑制、誘導(dǎo)凋亡、阻滯DNA合成作用。

［關(guān)鍵詞］環(huán)氧合酶-2；非甾體類抗炎藥NS398；胃癌細(xì)胞株SCG7901

臨床流行病學(xué)調(diào)查、大量實驗研究表明：非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）能降低消化道腫瘤的發(fā)病率，其抑癌機(jī)制包括阻斷血管生成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)，以賽來昔布為主要藥物目前研究比較熱門，但NS398作用于胃癌細(xì)胞株SCG7901今未有研究，該實驗于2014年6—12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實驗室，用MTT、DNA梯度降解試驗及流式細(xì)胞儀等方法，研究NS398對胃癌細(xì)胞株SCG7901的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用，來進(jìn)一步探討NSAIDs的抑癌機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

表1　不同濃度NS398在不同時間的Ishikawa細(xì)胞的抑制率［（±s），%］

表1　不同濃度NS398在不同時間的Ishikawa細(xì)胞的抑制率［（±s），%］

NS398（μmol/L）0 h 12 h 24 h 36 h 48 h　72 h 0（n=10）50（n=20）100（n=20）150（n=20）200（n=20）1.20±0.15 1.21±0.13 1.23±0.14 1.25±0.30 1.32±0.18 1.19±0.22 7.25±0.52 9.89±0.66 12.13±0.63 18.58±0.35 1.22±0.20 12.58±0.45 16.53±1.35 21.08±1.12 28.98±1.29 1.26±0.19 15.45±1.26 26.16±0.32 31.62±0.82 41.23±0.35 1.30±0.15 28.55±0.36 38.43±0.63 48.13±1.32 52.53±1.63 1.45±0.18 33.63±0.53 41.27±0.73 61.63±1.58 70.32±0.14

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇的NS398純品是在美國Sigma公司購買的，培養(yǎng)基RPMI1640也是在Sigma公司購買，此外，RNase、1kb DNA ladder、碘化丙啶（PI）試劑是在深圳的晶美公司購買。

1.2細(xì)胞系

SGC7901細(xì)胞株由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心提供，本實驗室常規(guī)傳代培養(yǎng)，10%胎牛血清，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，都是貼壁生長。

1.3細(xì)胞生長

曲線-MTT法通過96孔板，每個孔板進(jìn)行104到105個細(xì)胞的接種，在37℃的環(huán)境下，在CO2孵箱中，進(jìn)行12～24 h的培養(yǎng)，然后選擇濃度不同的NS398，讓其終濃度分別為0、50、100、150、200 μmol/L，來處理細(xì)胞，取不同時間，來空白對照不接種細(xì)胞和只含有0.1%二甲基亞砜（DMSD）的陰性對照組，每個濃度都設(shè)置3個復(fù)孔。在確定作用時段后，將里面的培養(yǎng)基去掉，并在每個孔中進(jìn)行MTT溶液（5 g/L）20 μL，進(jìn)一步的進(jìn)行孵育4 h，并終止培養(yǎng)。然后再培養(yǎng)上清，并將150 μL DMSO添加到每一個孔中去，震蕩10 min，然后利用酶聯(lián)免疫檢測分析儀來合理的檢測每一個孔的實際吸光度值并繪制其生長的曲線，從而增加抑制率的準(zhǔn)確性。其計算方式為：抑制率（%）=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.4DNA梯形電泳檢測細(xì)胞凋亡

按照每瓶104～105個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，取指數(shù)生長期的SGC7901單細(xì)胞懸液，將其接種在25 cm3的培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行24 h的常規(guī)培養(yǎng)，進(jìn)行實驗用培養(yǎng)液，也就是濃度不同的NS398，培養(yǎng)72 h，0.25%的胰蛋白酶消化，并根據(jù)需要手機(jī)細(xì)胞，利用酚以及氯仿抽提法來將其中的DNA提取出來，取10 μL，在1.2%的瓊脂糖凝膠下電泳檢測，在電壓100 V的情況下進(jìn)行3 h。然后分析溴乙錠染色情況，并在紫外燈環(huán)境下根據(jù)需要拍攝照片。 1.5流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡PI染色法

SGC7901和濃度不同的NS398（濃度分別為0、50、100、150、200 μmol/L）作用24 h后。0.25%胰酶被消化，可以收集并制作105個細(xì)胞單細(xì)胞懸液，將六孔板中的單細(xì)胞懸液收集起來，經(jīng)過兩側(cè)的PBS洗，進(jìn)行200 uL RNaseA（1 g/L）的加入，在37℃的情況下水浴30 min，然后將100 ug/mL染色液添加進(jìn)去，進(jìn)行30 min的避光反應(yīng)后。上機(jī)檢測。

1.6統(tǒng)計方法

運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0來處理統(tǒng)計結(jié)果。計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），MTT法檢測結(jié)果采用兩樣本Student's-t檢驗，F(xiàn)CM檢測結(jié)果采用方差分析法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

①NS398會影響SGC7901細(xì)胞的增殖和凋亡情況，濃度不同給SGC7901造成的影響時間也各不相同，并且還應(yīng)該通過吸光度來合理計算細(xì)胞的實際抑制率。結(jié)果呈現(xiàn)在表1中，在進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析后，可以發(fā)現(xiàn)，組間不同差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=35.984，P＜0.01）。

②100 umol/LNS398作用于SCG7901的過程中，隨著時間的變化，DNA的電泳圖亮度特征也會發(fā)生比較大的變化，屬于特征性凋亡梯形圖。如圖1。濃度不同的NS398在對SCG7901進(jìn)行24 h的處理之后，通過流式細(xì)胞儀檢測可以發(fā)現(xiàn)，在G2期出現(xiàn)凋亡峰，，0、50、100、150、200 umol/L各濃度的NS398處理后細(xì)胞的凋亡率（%）分別為（1.4±0.32）、（12.5±2.17）、（32.1±5.08）、（57.2± 0.83）、（76.6±3.59）。處理組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 12.414，P＜0.01）。

圖1　DNA電泳檢測細(xì)胞凋亡圖

③細(xì)胞周期分布情況，SCG7901細(xì)胞分為NS398未處理對照組以及處理組，通過濃度不同的NS398例對SCG7901進(jìn)行24 h的處理后，經(jīng)過流式細(xì)胞儀金細(xì)胞檢測，在周期中百分率比較由表2較為直觀的展示了出來。也直接表明細(xì)胞周期不同，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=21.315，P＜0.01）。

表2　不同濃度NS398組SCG7901細(xì)胞在各周期分布比例的比較［（±s），%］

表2　不同濃度NS398組SCG7901細(xì)胞在各周期分布比例的比較［（±s），%］

0（n=10）50（n=20）100（n=20）150（n=20）200（n=20）NS398（μmol/L）7.13±1.14 6.15±0.85 5.05±0.72 4.83±0.64 2.45±0.18 G0期42.17±0.56 55.35±0.45 65.82±0.36 73.62±0.53 87.16±0.42 G1期24.12±0.25 21.42±0.35 16.23±1.28 13.26±0.77 10.23±0.34 26.58±0.29 17.08±0.38 12.9±0.35 8.29±0.76 0.16±0.05 S期　G2期

3　討論

隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，對于腫瘤細(xì)胞而言，炎癥介質(zhì)前列腺素會發(fā)揮很大的作用，在PGs中，COX-2作為合成催化酶非常重要，現(xiàn)在人們已經(jīng)切實認(rèn)識到其對于腫瘤的重要性?，F(xiàn)在，很多人都已經(jīng)認(rèn)可COX-2表達(dá)和腫瘤出現(xiàn)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和對放化療本身的敏感性有著直接關(guān)系［1-2］。通過非甾體抗炎藥的使用能夠選擇性的對COX-2的表達(dá)進(jìn)行抑制，從而進(jìn)行PGs的抑制，阻礙腫瘤進(jìn)一步的生長，近年來胃癌發(fā)病率有上升趨勢，COX-2選擇性抑制劑NS398能夠很好的抑制體外培養(yǎng)的為癌細(xì)胞，希望能夠給胃癌治療更好的進(jìn)行提供新的手段［3-5］。

非甾體抗炎藥NS398是高選擇性COX-2抑制劑，對COX-2有較強(qiáng)的抑制作用。許多研究表明NS398可以抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、等惡性腫瘤的生長，誘導(dǎo)其凋亡［6］，畢建斌等［7］研究NS398通過前列腺素E2誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡與該研究結(jié)果類似，該研究過程中仔細(xì)觀察了濃度不同的NS398抑制COX-2后會直接影響細(xì)胞生物學(xué)特點，給其增殖以及凋亡造成很大影響。李堯等［8］用MTT方法研究NS398對唾液腺腺樣囊性癌（SACC）-83細(xì)胞抑制作用結(jié)果基本一致，該實驗研究利用MTT檢測能夠發(fā)現(xiàn)NS398的濃度不同，會通過時間以及劑量等一些依賴性的方式來對SCG7901細(xì)胞增殖造成抑制，通過研究統(tǒng)計學(xué)可以發(fā)現(xiàn)，效果最明顯的時間是在72 h，抑制率達(dá)到了70.32%。200 μmol/L 的NS398作用于SCG7901細(xì)胞后DNA電泳圖也可以發(fā)現(xiàn)其特征性梯形圖譜比較明顯。通過相關(guān)對比和研究可以發(fā)現(xiàn)，延長條帶也會更明顯，并且在72 h時，其亮度最高。通過流式細(xì)胞儀來對細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行檢查，可以發(fā)現(xiàn)，NS398的濃度在作用細(xì)胞24 h之內(nèi)時，依賴性較強(qiáng)，并且隨著作用濃度的增加，凋亡率也會有一定提高（F=12.414，P＜0.01）。所以，可以說NS398對體外的癌細(xì)胞有著明顯抑制作用，抑制時存在明顯濃度依賴和時間依賴，這與雙金全在NS398對SGC7901胃癌細(xì)胞生長及CD44V6、MMP-9基因表達(dá)的影響中基本一致。此外，將NS398作用在SCG7901細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期也會發(fā)生變化：0、50、100、150、200 umol/LNS398對SCG7901細(xì)胞處理24 h之后，主要是G1/G0期的百分率增加，而在G2/M以及S期中，百分率的降低比較明顯，并且，在G2時期，細(xì)胞分化也出現(xiàn)了停滯不前的情況，也就是其作用在細(xì)胞周期的S/G2點，NS398對SCG7901細(xì)胞周期造成的干預(yù)作用表現(xiàn)在抑制細(xì)胞DNA合成的后期；并且引起周期阻滯的效應(yīng)在24 h呈現(xiàn)劑量依賴性（F=21.315，P＜0.01）。但畢建斌等［7］研究NS398通過前列腺素E2誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡研究結(jié)果為NS398作用腎癌786-0細(xì)胞24 h后，在細(xì)胞周期G0/G1期前出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，隨著濃度升高，凋亡峰亦越來越增高。對照組及NS398在50、100、200 μmol/L時，細(xì)胞凋亡率分別（2.60±0.98）%、（6.13±2.63）%、（8.26±3.91）%、（21.88±2.62）%。實驗組與培養(yǎng)時間相同的對照組的細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這與該研究不一致，具體細(xì)節(jié)有待進(jìn)一步研究，有關(guān)COX-2與胃癌關(guān)系的研究報道很多，表現(xiàn)COX-2在胃癌中強(qiáng)表達(dá)，且與胃癌的惡性生物學(xué)特性正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而通過實驗可以發(fā)現(xiàn)，NS398能夠?qū)w外的SCG7901細(xì)胞造成抑制作用，并對其增殖造成影響，促使其凋亡，導(dǎo)致其周期停滯不前。

由此，可以說在胃癌治療中，COX-2是新靶基因，對其造成的抑制作用比較出色，并且其副反應(yīng)比較小，所以，有必要將其運用到臨床癌癥治療中去，應(yīng)用前景比較廣闊。

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Effect of Non-steroid Anti-inflammatory Drug NS398 on Gastric Cancer Line SCG7901

FAM Zhan-bin
Department of General Surgery，Longyao County Hospital，Longyao，Hebei Province，055350 China

［Abstract］Objective To discuss the effect of selective cox inhibitor NS398 on the biological behavior of gastric cancer line SCG7901. Methods The suppress proliferation and promoting apoptosis functions of NS398 on the gastric cancer line SCG7901 was researched by MTT and DNA gradient degradation testing and flow cytometry method in the laboratory of the second hospital of Hebei medical university from June 2014 to December 2014. Results NS398 had an obvious growth inhibition effect on the gastric cancer line SCG7901 and the manifestation was dose-dependent，（F=35.984，P＜0.01），and the DNA gradient degradation testing and flow cytometry analyzed that the NS398 concentration dependently induced apoptosis of gastric cancer line SCG7901，（F=12.414，P＜0.01），and apoptosis was correlated with the cell cycle arrest（F=21.315，P＜0.01）and the main arrest was in S/G2 stage. Conclusion NS398 has an obvious effect of in vitro growth inhibition，inducing apoptosis and blocking DNA synthesis in a concentration-dependent manner on gastric cancer line SCG7901.

［Key words］Cyclooxygenase-2；Non-steroid anti-inflammatory drug NS398；Gastric cancer line SCG7901

［中圖分類號］R735.2

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1674-0742（2016）04（c）-0014-04

［作者簡介］范占彬（1977-），男，河北隆堯人，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸外科方面研究。

收稿日期：（2016-01-25）