WAR-5、Fasudil治療EAE的療效比較及作用機制研究

辛延樂　李艷花　丁智斌　尉杰忠　劉春云　楊春彥　吳昊　姜維佳　肖保國　馬存根

030001 山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院(辛延樂、吳昊、馬存根)；037009 山西大同大學腦科學研究所(李艷花、丁智斌、尉杰忠、劉春云、馬存根)；030024 山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心(楊春彥、姜維佳、馬存根)；200025 復旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所(肖保國)

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WAR-5、Fasudil治療EAE的療效比較及作用機制研究

辛延樂李艷花丁智斌尉杰忠劉春云楊春彥吳昊姜維佳肖保國馬存根

030001 山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院(辛延樂、吳昊、馬存根)；037009 山西大同大學腦科學研究所(李艷花、丁智斌、尉杰忠、劉春云、馬存根)；030024 山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心(楊春彥、姜維佳、馬存根)；200025 復旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所(肖保國)

摘要:目的比較WAR-5與鹽酸法舒地爾(Fasudil)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的治療效果，并探究其作用機制。方法采用小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)免疫雌性C57BL/6小鼠建立慢性EAE模型，并隨機分為EAE對照組、WAR-5治療組和Fasudil治療組。于免疫后第3天開始，分別腹腔注射WAR-5、Fasudil及生理鹽水，比較各組小鼠體質(zhì)量變化和臨床評分。于免疫后第28天處死各組動物，制作脊髓冰凍切片進行CD4+T細胞、CD68+巨噬細胞及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(p-NF-κB/p65)染色，觀察其在脊髓中的表達。提取腦組織的蛋白用Western blot法檢測Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)Ⅱ和p-NF-κB/p65蛋白表達，并采用Griess法檢測脾細胞培養(yǎng)上清液的一氧化氮(NO)釋放水平。結果與EAE對照組(108.70±20.26、399.00±25.94)比較，WAR-5治療組(13.67±4.041、52.67±13.43)及Fasudil治療組(15.33±5.033、31.00±13.45)脊髓內(nèi)CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞數(shù)目均減少(均P<0.01)，WAR-5與Fasudil兩治療組相比，差異無統(tǒng)計學意義。與EAE對照組(1.9500±0.3976、0.5885±0.05982)比較， WAR-5組(0.6137±0.1778、0.0096±0.0015)及Fasudil組(1.1960±0.2225、0.3574±0.1496)腦內(nèi)ROCK Ⅱ、p-NF-κB/p65表達均降低，WAR-5治療組腦內(nèi)ROCK Ⅱ、p-NF-κB/p65表達亦均低于Fasudil治療組(均P<0.05)。WAR-5和Fasudil治療組上清液NO含量分別為(16.40±0.5247)μmol/L、(17.69±0.2833)μmol/L，均低于EAE對照組〔(20.07±0.6116)μmol/L；均P<0.001〕，且WAR-5治療組低于Fasudil治療組(P<0.01)。與Fasudil治療組比較，800 μg及1600 μg藥物注射后，WAR-5治療組小鼠的存活狀態(tài)明顯較好；800 μg藥物注射后，WAR-5治療組小鼠的腳趾無明顯血管擴張反應。結論WAR-5對EAE的治療效果與Fasudil相近，且其治療安全性較好，擴張血管作用較小，其作用機制可能與WAR-5抑制小鼠ROCKⅡ的表達及抑制炎性反應相關。

關鍵詞:實驗性自身免疫性腦脊髓炎；Rho激酶；一氧化氮；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

多發(fā)性硬化(maltiple sclerosis, MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的自身免疫性疾病，以少突膠質(zhì)細胞凋亡、髓鞘脫失及軸突損傷為特征，MS影響著世界上大約0.1% 的人口[1]。EAE與MS在臨床表現(xiàn)、免疫及病理等方面具有非常相似的特征，在闡明MS病理形成過程、發(fā)病機制和各種藥物治療效果上頗有價值，已被公認是目前MS理想的動物模型。目前，MS患者使用的藥物多數(shù)只能緩解癥狀，不能影響疾病的進展，特別是大多數(shù)中國患者使用糖皮質(zhì)激素治療不良反應較大。因此，研究及發(fā)現(xiàn)對MS治療有效、價格低廉而且不良反應小的藥物具有重要的現(xiàn)實意義。

Rho激酶/Rho相關含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)是近10年來發(fā)現(xiàn)參與細胞諸多活動的主要酶之一，已有研究表明ROCK可在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、炎性脫髓鞘和炎性變性病中異常激活，參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程。ROCK 抑制劑則可有效改善MS[2]及PD[3]動物模型的臨床癥狀，但ROCK 抑制劑臨床不良反應和毒性方面仍存在一些缺陷。因此，人們一直致力于ROCK 抑制劑類似物的合成和研究。通過對ROCK 抑制劑的結構優(yōu)化，篩選出一種新型ROCK抑制劑WAR-5。在前期的研究中，已經(jīng)證實WAR-5治療能有效推遲EAE臨床發(fā)病時間，顯著改善臨床癥狀，抑制M1型巨噬細胞CD16/32表達，增加M2型巨噬細胞CD206表達，并且能夠抑制腦和脊髓中一氧化氮合酶(iNOS)的表達水平[4]。但其與目前已經(jīng)使用的ROCK 抑制劑鹽酸法舒地爾(Fasudil)相比，其抑制ROCK的作用、治療EAE的療效以及是否存在其他相關的機制尚不明確。因此，作者在本研究中通過比較WAR-5與Fasudil治療EAE情況，期望進一步明確WAR-5的療效、作用機制及不良反應情況。

1材料和方法

1.1主要動物與試劑 8～10周齡、體質(zhì)量18～20 g、雌性C57BL/6小鼠50只，購自北京維通利華公司。小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白35-55多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55,MOG35-55)由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成；結核分枝桿菌(TB)購自BD公司；百日咳毒素(PTX)購自Alexis公司；完全福氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)購自美國Sigma公司；Western blot電泳-轉(zhuǎn)膜裝置及凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；WAR-5及Fasudil化合物由天津紅日藥業(yè)股份有限公司饋贈。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備：C57BL/6雌性小鼠實驗前在無病原菌實驗室正常喂養(yǎng)1周后，取體質(zhì)量 18～20 g者隨機分為EAE對照組、WAR-5治療組和Fasudil治療組，每組6只。MOG35-55肽段4.5 mg溶于0.9 mL生理鹽水中；5.4 mg TB溶于0.9 mL CFA，采用針管混合器將兩種溶液等體積充分混合為油包水樣乳白色混懸液，且乳劑滴入水中無分層即為合格，此即MOG35-55 CFA。乙醚麻醉小鼠后，按0.1 mL/只給予各組小鼠脊柱背側(cè)中線兩側(cè)，分4點皮下注射MOG35-55 CFA。于免疫當日和免疫48 h后，各組小鼠分別腹腔注射PTX 500 ng /(只·次)，共注射2次。

1.2.2給藥處理：將400 μg WAR-5或Fasudil(溶于200 μL生理鹽水中)。于免疫后3 d，開始分別給予兩治療組每只小鼠腹腔注射400 μg的WAR-5或Fasudil，2次/d，EAE對照組以等體積生理鹽水腹腔注射，各組均持續(xù)至免疫后第27天。臨床評分，從免疫當天開始隔日觀察，直到免疫后第28天。采用國際通用的5分評分制進行評分：無任何臨床癥狀計為0分；尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙計為1分；一側(cè)后下肢無力，被動翻身后可以恢復計為2分；雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動計為3分；雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓計為4分；瀕死狀態(tài)或死亡計為5分。癥狀介于兩個標準之間者以±0.5分計。

1.2.3免疫熒光染色觀察CD4+T細胞、CD68+細胞及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(p-NF-κB/p65)表達：三組均于免疫后第28天取脊髓，包埋劑(opti-mum cutting temperature compound，OCT)包埋后，于液氮中冷凍后制作切片，厚度為10 μm。切片經(jīng)PBS洗5 min×3次，大鼠抗小鼠CD4或CD68按1∶1000比例分別加入10 g/L BSA稀釋液中，兔抗小鼠 p-NF-κB/p65按1∶400比例加入含BSA(10 g/L)、Triton X-100(3 mL/L)的稀釋液中，分別將3種抗體的稀釋液均勻滴在不同的冰凍切片上，置于4℃冰箱孵育過夜。次日以PBS洗5 min×3次，滴加相應二抗(1∶1000)室溫孵育2 h，以PBS洗5 min，以300 nmoL/L DAPI 染細胞核5 min，PBS洗5 min×3次，500 mL/L甘油封片。熒光顯微鏡觀察陽性細胞染成紅色熒光，細胞核染為藍色，merge為兩者的合并。Image-Pro Plus 軟件對在脊髓中表達CD4+或CD68+的細胞的數(shù)目進行計數(shù)。CD4+、CD68+或p-NF-κB/p65陽性細胞均為染成紅色的細胞。

1.2.4Western blot檢測ROCKⅡ和p-NF-κB/p65的表達：免疫后第28天處死動物，采用RIPA強裂解液提取三組腦組織的蛋白，然后用BCA法進行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，將膜置于含5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉的TBST中封閉2 h，兩張PVDF膜均剪開，上部分別滴加兔抗小鼠p-NF-κB/p65抗體(1∶1000)、小鼠抗小鼠ROCK Ⅱ抗體(1∶1000)，下部均滴加兔抗小鼠抗體β-actin(1∶10000)。4℃過夜。次日洗滌后室溫孵育HRP耦聯(lián)的二抗(1∶10000)2 h。經(jīng)TBST洗滌后，用BIO-RAD儀器進行化學發(fā)光法顯色，將所得譜帶經(jīng)Image-LAB分析，用β-actin作為內(nèi)參，計算各標本的譜帶相對值，作為兩種物質(zhì)的相對表達量。

1.2.5檢測一氧化氮(NO)釋放水平：免疫后28天提取三組脾細胞，體外培養(yǎng)48 h，Griess法檢測NO釋放水平，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，分別按100 L/孔加入至96孔酶標板，然后加入等體積的Griess液(1 g 奈酚稀醋酸和0.1 g二苯胺溶于100 mL的50 g/L磷酸中)，充分混勻后室溫靜置10 min，于540 nm處檢測各組吸光度(A)值，以亞硝酸鈉為標準品建立標準曲線，將各組所測定吸光度值結果帶入標準曲線，計算出NO濃度。

1.2.6藥物安全性評估及擴血管反應觀察： 此處所取小鼠均未經(jīng)過處理。(1)安全性評估：比較單次腹腔注射不同劑量Fasudil和WAR-5的安全性，首先取14只C57BL/6雌性小鼠隨機分為兩組，兩組分別按每只800 μg的劑量注射Fasudil或WAR-5，并拍攝視屏觀察記錄兩組小鼠活動狀態(tài)，包括運動量和精神狀態(tài)。之后另取12只C57BL/6雌性小鼠隨機分為兩組，給藥劑量增至單次1600 μg，再次觀察小鼠活動及精神狀態(tài)。(2)擴血管反應：取6只小鼠隨機分為Fasudil和WAR-5組，每組3只。每只小鼠分別腹腔注射800 μg Fasudil或WAR-5，密切觀察小鼠腳部顏色變化。若小鼠腳部變紅，評定為血管擴張，變紅越明顯則血管擴張越明顯。

1.3統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 5軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較服從正態(tài)分布的采用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布的采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組EAE癥狀嚴重程度比較 EAE組小鼠從免疫后第10天開始相繼發(fā)病，最晚于免疫后第14天發(fā)病，出現(xiàn)精神萎靡、皮毛不滑、食欲及體質(zhì)量下降、尾部及四肢肌力下降甚至消失，到第22天癥狀達高峰。WAR-5和Fasudil治療組臨床評分均低于EAE對照組(圖1)。EAE對照組小鼠免疫當天的體質(zhì)量為(18.72±0.9718)g，免疫后第12天體質(zhì)量為(19.37±1.391)g，之后體質(zhì)量明顯下降，免疫后第24天體質(zhì)量降至低谷，平均達(15.95±2.141)g，免疫后第28天體質(zhì)量平均為(16.15±2.245)g，WAR-5和Fasudil治療組小鼠體質(zhì)量則呈上升趨勢(圖1)。

2.2各組CD4+T細胞、CD68+細胞表達比較 與EAE對照組比較，WAR-5治療組及Fasudil治療組脊髓內(nèi)CD4+T、CD68+細胞的數(shù)目減少(分別P<0.01、P<0.001)；Fasudil與WAR-5兩治療組相比，差異無統(tǒng)計學意義(表1)。在EAE對照組小鼠脊髓中可見散在分布的紅染CD4+T細胞，而WAR-5和Fasudil組中則僅有少量CD4+T細胞表達(圖2)。EAE對照組小鼠的脊髓內(nèi)呈現(xiàn)大量CD68+巨噬細胞浸潤，主要集中在脊髓的前后正中裂和脊膜等血管通透性增加的部位，而在WAR-5與Fasudil治療組中，僅在脊髓正中裂附近可見少量散在分布的CD68+巨噬細胞(圖3)。

圖1各組小鼠臨床評分(A)與體質(zhì)量(B)變化比較

表 1　三組小鼠各項指標比較

注：與EAE對照組比較， *P<0.5，**P<0.01；與Fasudil治療組相比，#P<0.05

注：下排圖所示為上排中對應圖綠框部分的放大

圖2各組脊髓CD4+T細胞表達比較(免疫熒光染色)

注：下排圖所示為上排中對應圖綠框部分的放大

圖3各組脊髓CD68+巨噬細胞表達比較(免疫熒光染色)

圖4各組小鼠腦內(nèi)ROCK Ⅱ表達比較(Western blot)

2.3各組ROCK Ⅱ表達比較 具體結果見圖4、表1。與EAE對照組比較， WAR-5組及Fasudil組腦內(nèi)ROCK Ⅱ表達均降低(分別P<0.01、P<0.05)，WAR-5組腦內(nèi)ROCK Ⅱ表達亦低于Fasudil治療組(P<0.05)。

2.4各組p-NF-κB/p65表達比較 與EAE對照組比較，WAR-5治療組及Fasudil治療組小鼠腦內(nèi)p-NF-κB/p65表達均明顯減少(均P<0.05)；而且與Fasudil治療組比較，WAR-5治療組小鼠腦內(nèi)p-NF-κB/p65表達亦減低(P<0.05，表1、圖5)。免疫熒光染色結果顯示，EAE對照組可見在脊髓內(nèi)散在分布的p-NF-κB/p65染色陽性細胞(其與核合并后呈紫色)，WAR-5 和Fasudil治療組則幾乎未見p-NF-κB/p65表達(圖6)。

2.5各組NO釋放水平比較 脾細胞培養(yǎng)48 h時，三組間上清液NO含量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=71.13，P<0.0001)。WAR-5治療組和Fasudil治療組上清液NO含量〔分別為(16.40±0.5247)μmol/L、(17.69±0.2833) μmol/ L〕均低于EAE對照組〔(20.07±0.6116)μmol/L，均P<0.001〕，且WAR-5治療組上清液NO含量低于Fasudil治療組(P<0.01)。

圖5各組腦組織內(nèi)p-NF-κB/p65表達比較(Western blot)

2.6各組安全性及血管擴張情況比較

2.6.1安全性比較：腹腔注射劑量800 μg/只時， Fasudil治療組在給藥后1 h內(nèi)活動明顯減少，精神狀態(tài)極差，而WAR-5治療組活動沒有受到明顯影響。于1、10、20、30 s四個時間點觀察，F(xiàn)asudil治療組小鼠均蜷縮在一起，雙后肢都緊貼地面，基本沒有活動；而WAR-5治療組小鼠則活動良好，在限定區(qū)域內(nèi)迅速移動，四個時間點小鼠的位置都在變換。劑量為1600 μg/只時，F(xiàn)asudil治療組4 h內(nèi)小鼠死亡2只(33%)，其余存活小鼠精神狀態(tài)差，蜷縮在一起；WAR-5治療組動物沒有死亡，且活動良好。

Fasudil：200倍及DAPI和merge的圖均為對應的100倍圖中綠色框內(nèi)部分的局部放大

圖6各組脊髓p-NF- κB/p65表達比較(免疫熒光染色)

圖7WAR-5治療組及Fasudil治療組給藥后不同時間血管擴張情況比較

2.6.2擴血管作用比較：在注射后30 min和60 min時，F(xiàn)asudil治療組3只小鼠的腳趾均明顯變紅，擴血管作用顯著，而WAR-5治療組小鼠的腳趾無明顯變化(圖7)。

3討論

現(xiàn)有研究提示Rho/ROCK信號通路參與EAE/MS的免疫病理過程，在血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞、炎性細胞遷移[5]、免疫細胞活化、脫髓鞘及膠質(zhì)細胞反應等方面發(fā)揮著重要作用[6]。Takeda等指出ROCK抑制劑可減少炎性細胞包括T細胞的跨內(nèi)皮細胞遷徙、聚集。此外，當Rho/ROCK信號通路被激活后，啟動磷酸化及去磷酸化效應，BBB受到破壞，大量致敏的CD4+T細胞可通過受損的BBB進入CNS。當CD4+T進入CNS，小膠質(zhì)細胞被激活后，大量巨噬細胞進入CNS，使免疫炎性反應進一步放大導致神經(jīng)元損害。作者課題組前期研究[7]表明，F(xiàn)asudil通過直接干擾ROCKⅡ的活性從而阻斷Rho/ROCK的通路，減少炎性細胞浸潤，改善臨床評分。與Fasudil相比，WAR-5可更有效抑制ROCKⅡ的表達，且WAR-5治療組小鼠CNS內(nèi)CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞的浸潤減少，推測WAR-5可通過抑制Rho/ROCK通路，減少炎性細胞跨內(nèi)皮細胞的遷徙，減少BBB的通透性，從而減輕炎性細胞的中樞浸潤，減輕炎性反應，改善EAE小鼠的癥狀。

NF-κB通路是參與炎性反應調(diào)控的重要信號系統(tǒng)，在EAE免疫調(diào)節(jié)和炎性反應發(fā)展中具有重要意義[8]，能調(diào)控多種細胞因子、生長因子、黏附分子和某些急性期蛋白的表達。EAE動物模型的基因表達分析顯示，EAE對照組NF-κB表達增加，減少NF-κB表達的藥物可以用于防治EAE[9]。侯紹蔚等[10]的研究表明Fasudil可抑制EAE小鼠CNS內(nèi)NF-κB的表達，從而減輕CNS的炎性病理損傷，改善EAE小鼠的臨床癥狀。李艷花等[11]發(fā)現(xiàn)Fasudil 可顯著降低星形膠質(zhì)細胞 p-NF-κB/p65的表達，抑制星形膠質(zhì)細胞中NF-κB的活性能促使星形膠質(zhì)細胞的功能由神經(jīng)損傷轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)保護，減少膠質(zhì)細胞增生及炎性因子的產(chǎn)生。本研究中，與Fasudil比較，WAR-5可更有效抑制腦內(nèi)p-NF-κB/p65蛋白及脊髓p-NF-κB/p65的表達。因此，WAR-5必然顯示很強的抗炎效果。

在MS/EAE發(fā)病過程中，CNS的iNOS表達量顯著增高，iNOS表達后持續(xù)產(chǎn)生NO。前期研究[12, 4]表明Fasudil及WAR-5均可抑制EAE小鼠iNOS的表達，本研究中進一步測定NO的水平，結果表明Fasudil與WAR-5均可有效減少NO的釋放，而WAR-5作用更加顯著。已有研究證實NO 參與MS/EAE的發(fā)病[13-14]。NO能擴張血管，破壞BBB，炎性細胞容易由此進入腦實質(zhì)，造成腦實質(zhì)損害。此外，NO能通過干預少突膠質(zhì)細胞的能量代謝、破壞其DNA鏈以及釋放谷氨酸等方式，導致少突膠質(zhì)細胞壞死或凋亡，進而導致脫髓鞘發(fā)生。因此，減少NO的分泌可以阻止EAE病情的發(fā)展。

Fasudil通過抑制小鼠體內(nèi)的炎性反應治療EAE，但是Fasudil治療同時還有迅速顯著的擴血管作用，會造成明顯的血壓波動，這限制了其治療EAE的長期使用。本次研究發(fā)現(xiàn)，在注射高濃度Fasudil后，小鼠迅速出現(xiàn)顯著血管擴張，腳部明顯變紅，而注射WAR-5的小鼠無明顯變化，表明WAR-5的擴血管作用較小。此外，本研究還顯示，在給予相同劑量藥物情況下，F(xiàn)asudil治療組小鼠出現(xiàn)明顯的癥狀，甚至死亡，而WAR-5治療組活動均未受到明顯影響，表明WAR-5的治療安全窗明顯大于Fasudil。

本研究顯示，WAR-5與Fasudil治療作用相近，對EAE有較好的療效。其機制可能為：(1)WAR-5通過抑制小鼠體內(nèi)的表達，抑制炎性反應，促進軸突再生；(2)WAR-5通過減少CD4+T和CD68+巨噬細胞的中樞浸潤；(3)通過抑制NF-κB表達，減輕CNS炎性病理損傷；(4)通過抑制NO產(chǎn)生，減少血管擴張，降低外周炎性細胞浸潤。

綜上可見，與Fasudil治療作用相近，WAR-5可有效改善EAE小鼠的癥狀，其機制可能是通過多條途徑減輕EAE小鼠體內(nèi)的炎性反應。此外，本研究還顯示W(wǎng)AR-5擴血管作用小且治療安全窗大。因此，有必要對WAR-5化合物進行深入研究，以便為今后臨床使用其治療MS以及其他神經(jīng)變性疾病提供實驗依據(jù)。

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(本文編輯：鄒晨雙)

The therapeutic effect comparision and mechanism exploration of WAR-5 and Fasudil in EAE mice

XINYanle,LIYanhua,DINGZhibin,YUJiezhong,LIUChunyun,YANGChunyan,WUHao,JIANGWeijia,XIAOBaoguo,MACungen*.

*TheFirstClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;InstituteofBrainScience,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China; “2011”CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China

ABSTRACT:ObjectiveTo compare the therapeutic effect of WAR-5 and Fasudil in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and explore the possible mechanisms. MethodsFemale C57BL/6 mice were immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55 (MOG35-55) to establish chronic EAE model. Mice were randomly divided into three groups: the WAR-5 treatment group, the Fasudil treatment group and the EAE control group. WAR-5, Fasudil or normal saline were intraperitoneally injected from day 3 post-immunization (p.i) to day 27 p.i. The body mass changes and clinical scores of mice were compared among the three groups.On day 28, p.i. animals were sacrificed and spinal cords frozen sections were prepared. Immunohistochemistry staining method was adopted in CD4+ T cell, CD68+ macrophage and p-NF-κB/p65. Their expression in the spinal cord was observed. Protein from brains were extracted and ROCKⅡ and p-NF-κB/p65 were detected by Western blot. Nitric oxide (NO) release levels in supernatants of spleen cell cultures were detected by Griess method. ResultsCompared with the EAE control group(108.70±20.26、399.00±25.94), CD4+T cell and CD68+ macrophage number in spinal cord decreased in the WAR-5 treatment group(13.67±4.041、52.67±13.43) and the Fasudil treatment group(15.33±5.033、31.00±13.45, P<0.01, respectively). There was no significant difference between the WAR-5 treatment group and the Fasudil treatment group. Compared with the EAE control group(1.9500±0.3976、0.5885±0.05982), expression of ROCK Ⅱ、p-NF-κB/p65 in brains decreased in the WAR-5 treatment group(0.6137±0.1778、0.0096±0.0015)and the Fasudil treatment group(1.1960±0.2225、0.3574±0.1496). Expression of ROCK Ⅱ、p-NF-κB/p65 in brains of the WAR-5 treatment group was lower than that of the Fasudil treatment group(P<0.05, respectively). Supernatant NO contents in the WAR-5 treatment group〔(16.40±0.5247)μmol/L〕 and the Fasudil treatment group〔(17.69±0.2833)μmol/L〕 were lower than that of the EAE control group〔(20.07±0.6116)μmol/L, P<0.001, respectively〕 and supernatant NO content in the WAR-5 treatment group was lower than that of the Fasudil treatment group(P<0.01). Compared with the Fasudil treatment group, survival state of the mice in the WAR-5 treatment group was obviously better after 800 μg and 1600 μg drug injection. Vasodilator effect was not obvious after 800 μg drug injection in the WAR-5 treatment group. ConclusionsWAR-5 treatment has similar therapeutic effect with Fasudil. WAR-5 can significantly suppress the inflammatory reaction in EAE and its mechanism may be related to downregulating the expression of ROCKⅡ. In addition, WAR-5 with greater safety has a relatively weaker vasodilator effect than Fasudil.

Key words:experimental autoimmune encephalomyelitis；Rho kinase；NO；NF-κB

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.02.004

基金項目：國家自然科學基金2012年面上項目(81272163)；山西省國際科技合作項目(2013081058)；山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)；山西中醫(yī)學院“2011”培育計劃項目(2011PY-1)；山西省自然科學基金項目(2008011082-1)

通訊作者：馬存根，Email：macungen2001@163.com

中圖分類號：R744.5+1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2963 (2016)02-0093-07

Corresponding author:MA Cungen, Email: macungen2001@163.com

(收稿日期：2015-07-17)