普伐他汀和CRP對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板凝血酶受體PAR-1表達(dá)的調(diào)節(jié)*

楚羅湘,周素嫻,楊　帆,覃月秋,梁志山,莫昌干,王曉迪

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西柳州 545005)

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普伐他汀和CRP對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板凝血酶受體PAR-1表達(dá)的調(diào)節(jié)*

楚羅湘,周素嫻,楊帆,覃月秋,梁志山,莫昌干,王曉迪

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西柳州 545005)

[摘要]目的探討普伐他汀對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板PAR-1表達(dá)的影響及機(jī)制。方法體外分離富血小板血漿，分別給予C反應(yīng)蛋白(CRP)、普伐他汀干預(yù)和ADP刺激進(jìn)行體外研究。試驗(yàn)分組分別為：對(duì)照組，單純ADP組，低濃度普代他汀+ADP組，高濃度普伐他汀組+ADP組，CRP組，普伐他汀+CRP聯(lián)合組。采用流式細(xì)技術(shù)檢測(cè)PAR-1和LOX-1平均熒光強(qiáng)度(MFI)。采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)檢測(cè)TXB2和F1+2水平。結(jié)果5 μmol/L ADP刺激能促使血小板PAR-1表達(dá)增加35%。50 μg/mL CRP顯著降低ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1的表達(dá)(P<0.01)。1 μmol/L、10 μmol/L普伐他汀均顯著降低ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1的表達(dá)(P<0.01)。聯(lián)合應(yīng)用CRP和普伐他汀更能降低ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1表達(dá)，較單獨(dú)使用CRP或普伐他汀降低更顯著(P<0.05)。單純ADP刺激后TXB2較基礎(chǔ)時(shí)明顯增高(P<0.01),50 μg/mL CRP、10 μmol/L普伐他汀干預(yù)后ADP刺激的TXB2分別下降為(112.68±24.48)pg/mL、(146.48±46.54)pg/mL，與單純ADP刺激比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μg/mL CRP顯著增加ADP誘導(dǎo)的F1+2水平(P<0.01)，10 μmol/L普伐他汀對(duì)ADP誘導(dǎo)F1+2的生成無(wú)明顯影響。普伐他汀呈濃度依賴性的方式降低ADP誘導(dǎo)的血小板LOX-1表達(dá)(1 μmol/L和10 μmol/L普伐他汀處理后MFI分別為：1.80±0.19和1.62±0.16),與單純ADP刺激后LOX-1表達(dá)(MFI:3.16±0.23)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50 μg/mL CRP對(duì)ADP刺激的血小板LOX-1表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論P(yáng)AR-1在ADP 誘導(dǎo)的血小板活化中起重要作用，普伐他汀和CRP通過(guò)不同機(jī)制明顯降低ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1的表達(dá)，提示在炎癥狀態(tài)下他汀仍能起著重要的抗血栓作用。

[關(guān)鍵詞]C反應(yīng)蛋白質(zhì)；血小板；普伐他??；凝血酶受體PAR-1

凝血酶是最強(qiáng)的血小板激活劑，人類血小板表達(dá)PAR-1和PAR-4兩種凝血酶受體，PAR-1是人血小板最主要的凝血酶受體，低濃度凝血酶可與PAR-1結(jié)合激血小板[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)PAR-1拮抗劑能減少心臟血栓事件發(fā)生[2]。

他汀類藥物能改善心血管疾病的臨床預(yù)后，這不僅與他汀藥物降低低密度脂蛋白膽固醇有關(guān)，還與他汀調(diào)脂以外的多效性作用有關(guān)，如改善血管舒縮功能，促進(jìn)血管再生及穩(wěn)定易損斑塊等，體內(nèi)外的研究提示他汀藥物還能減輕血栓負(fù)荷及抑制血小板活化，另外他汀的抗炎作用同樣得到證實(shí)[3]。

C反應(yīng)蛋白(CRP)是判斷心血管事件發(fā)生的炎癥因子，最近的研究發(fā)現(xiàn)CRP通過(guò)促發(fā)炎癥和激活凝血系統(tǒng)而加重動(dòng)脈硬化的進(jìn)展[4]。然而有研究發(fā)現(xiàn)CRP對(duì)血小板的作用與其促血栓作用并不一致。PARIS臨床研究發(fā)現(xiàn)多種他汀藥物均能降低血小板PAR-1的表達(dá)，減少血小板的活化和血栓形成[5]，然而其機(jī)制不清，在炎癥狀態(tài)下他汀藥物對(duì)血小板PAR-1表達(dá)作用如何也少見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)體外研究探討普伐他汀對(duì)血小板PAR-1的作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1試劑ADP、CRP、普伐他汀購(gòu)自 Sigma公司， PE標(biāo)記的抗PAR-1流式抗體SPAN-12購(gòu)自Beckman Coulter公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的LOX-1流式抗體購(gòu)自Hycult Biotech 公司，TXB2試劑盒購(gòu)自Cayman Chemical公司，F(xiàn)1+2購(gòu)自Behring Diagnostica公司。

1.2試驗(yàn)分組本試驗(yàn)為體外研究，試驗(yàn)分組如下：對(duì)照組，只加入PBS;單純ADP組，5 μmol/L ADP作用15 min;低濃度普伐他汀+ADP組，1 μmol/L普伐他汀干預(yù)10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min;高濃度普伐他汀+ADP組，10 μmol/L普伐他汀干預(yù)10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min;CRP組，50 μg/mL CRP作用10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min;普伐他汀+CRP聯(lián)合組，50 μg/mL CRP+10 μmol/L普伐他汀干預(yù)10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min。

1.3制備富血小板血漿富血小板血漿從健康志愿者外周血分離而來(lái)，采用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，血與抗凝劑體積比為9∶1。在室溫下以150 r/min離心20 min，采集上層富血小板血漿。剩余血液再以500 r/min離心10 min獲得貧血小板血漿。貧血小板血漿用來(lái)調(diào)整富血小板血漿中的血小板數(shù)目，試驗(yàn)過(guò)程血小板的數(shù)目調(diào)整為3×1011cell/L。試驗(yàn)方案通過(guò)了倫理學(xué)審查，參加試驗(yàn)的志愿者均獲知情同意。

1.4血小板聚集試驗(yàn)血小板聚集試驗(yàn)采用美國(guó)Chrono-Log 聚集儀，本試驗(yàn)采用的致聚集為5 μmol/L ADP，血小板聚集率通過(guò)測(cè)量透光度來(lái)確定。

1.5流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)室溫下在試驗(yàn)管內(nèi)加入100 μL血小板懸液(數(shù)量為3×1011cell/L)，給予5 μmol/L ADP刺激血小板15 min后，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板凝血酶受體PAR-1及氧化低密度脂蛋白受體LOX-1的表達(dá)。流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司的Epics-XL型。血小板洗滌后重懸于流式緩沖液中，然后各取5 μL富血小板血漿分別加入PE標(biāo)記的SPAN12抗體及FITC標(biāo)記的LOX-1抗體，在hepes緩沖液中培育10 min，最后用1%多聚甲醛固定，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用平均熒光強(qiáng)度(MFI)或陽(yáng)性百分率表示，每次計(jì)算血小板數(shù)目為50 000個(gè)。

1.6酶聯(lián)免疫分析法富血小板血漿中TXB2，凝血酶原片段F1+2的水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)。嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1ADP對(duì)血小板PAR-1表達(dá)的影響ADP是激活血小板的非常重要的激動(dòng)劑，首先檢測(cè)不同濃度ADP誘導(dǎo)血小板聚集的情況。1 μmol/L ADP僅僅誘導(dǎo)血小板發(fā)生單相聚集，而且很快發(fā)生自發(fā)性解聚，5 μmol/L ADP誘導(dǎo)的血小板聚集為雙相，10 μmol/L ADP誘導(dǎo)的血小板雙相聚集溶合在一起，表現(xiàn)為持續(xù)的聚集曲線。最大的聚集率為61%，在本研究中，選擇5 μmol/L ADP作為血小板的激動(dòng)劑，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)觀察到血小板PAR-1表達(dá),而5 μmol/L ADP刺激5 min能促使血小板PAR-1表達(dá)增加35%，見(jiàn)圖1。

**:P<0.01。

圖1ADP對(duì)血小板PAR-1表達(dá)的影響

2.2CRP對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1表達(dá)的影響富血小板血漿預(yù)先給予CRP(25 μg/mL,50 μg/mL)，干預(yù)10 min，然后加入5 μmol/L ADP，37 °C培育15 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板PAR-1表達(dá)。結(jié)果顯示CRP呈濃度依賴性的抑制ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1的表達(dá)。血小板PAR-1的MFI從3.33±0.11下降到3.06±0.15(25 μg/mL CRP),進(jìn)一步下降至 2.82±0.10(50 μg/mL CRP)。見(jiàn)圖2。

**:P<0.01,*：P<0.05。

圖2CRP對(duì)ADP刺激的血小板PAR-1表達(dá)的影響

2.3普伐他汀對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1表達(dá)的影響在室溫下預(yù)先給予1 μmol/L、10 μmol/L普伐他汀于富血小板血漿中孵育10 min，然后加入5 μmol/L ADP再共同孵育15 min，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板PAR-1的表達(dá)。結(jié)果顯示普伐他汀處理呈濃度依賴性抑制血小板PAR-1表達(dá)，1 μmol/L、10 μmol/L普伐他汀將PAR-1的MFI由單純ADP刺激的3.33±0.11分別降至 3.11±0.18和2.72±0.14。

為驗(yàn)證在CRP存在的條件下普伐他汀對(duì)血小板PAR-1表達(dá)的影響，將50 μg/mL CRP 和10 μmol/L普伐他汀同時(shí)加入富血小板血漿共同孵育10 min，然后加入5 μmol/L ADP再共同孵育15 min，結(jié)果顯示聯(lián)合CRP和普伐他汀更明顯抑制血小板PAR-1的表達(dá)(MFI為2.32±0.11)，較單獨(dú)使用CRP和普伐他汀下降得更顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4CRP和普伐他汀對(duì)血小板TXB2合成及凝血酶原片版F1+2生成的影響血小板TXA2合成酶將PGH2轉(zhuǎn)化成TXA2,由于TXA2極不穩(wěn)定，作者檢測(cè)TXA2的穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物TXB2。富血小板血漿在ADP刺激之前預(yù)先給予50 μg/mL CRP或10 μmol/L普伐他汀干預(yù)10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min，TXB2的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)富血小板血漿，單純ADP刺激使富血小板血漿表達(dá)TXB2從(88.26±23.38)pg/mL 增加至 (185.30±41.82)pg/mL，而預(yù)先給予50 μg/mL CRP使TXB2降至(112.68±24.48)pg/mL，同樣，10 μmol/L普伐他汀同樣將TXB2降至(146.48±46.54)pg/mL。

凝血酶原片段F1+2可以反映血小板凝血酶的生成，采用酶聯(lián)免疫試劑盒體測(cè)富血小板血漿F1+2的水平變化。富血小板血漿在ADP刺激之前預(yù)先給予50 μg/mL CRP或10 μmol/L普伐他汀干預(yù)10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min，單純ADP刺激使F1+2從(0.65±0.20)nmol/L 上升至(1.18±0.80)nmol/L(P<0.05)。而預(yù)先給予50 μg/mL CRP使F1+2顯著增加(P<0.05)，而10 μmol/L普伐他汀對(duì)F1+2無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表1。

*:P<0.05，**:P<0.01。

圖3普伐他汀和CRP對(duì)ADP刺激的血小板PAR-1表達(dá)的影響

表1　CRP和普伐他汀對(duì)血小板TXB2合成及凝血酶原片段F1+2生成的影響

*P<0.01,與單純ADP組比較。

**:P<0.01。

圖4普伐他汀和CRP對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板LOX-1表達(dá)的影響

2.5CRP和普伐他汀對(duì)血小板LOX-1表達(dá)的影響LOX-1是ox-LDL的特異性受體，它在動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈血栓形成中起重要作用。而且血小板活化后LOX-1在其表面大量表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)到ADP刺激后血小板LOX-1表達(dá)明顯增加，作者研究CRP和普伐他汀是否會(huì)影響ADP誘導(dǎo)的血小板LOX-1表達(dá)。富血小板血漿在ADP刺激之前預(yù)先給予50 μg/mL CRP,1 μmol/L普伐他汀或10 μmol/L普伐他汀干預(yù)10 min，再給予5 μmol/L ADP刺激15 min，結(jié)果顯示：ADP刺激后血小板LOX-1明顯增加(MFI:3.16±0.23 vs.1.56±0.11,P<0.01)。CRP對(duì)ADP刺激的血小板LOX-1表達(dá)無(wú)明顯影響，而普伐他汀呈濃度依賴性的方式降低ADP誘導(dǎo)的血小板LOX-1表達(dá)(MFI分別為：1.80±0.19、1.62±0.16,與單純ADP刺激比較，P<0.01)。見(jiàn)圖4。

3討論

血小板凝血酶受體PAR-1對(duì)于ADP誘導(dǎo)血小板聚集和活化非常重要[6]。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，ADP刺激能增加血小板表面PAR-1表達(dá)35%左右，而且是在ADP刺激5 min后就能產(chǎn)生這種變化，這提示血小板表面的PAR-1增加不是通過(guò)翻譯和合成來(lái)的，因?yàn)檫@通常需要幾小時(shí)至十幾小時(shí)。這提示PAR-1在血小板表面的增加只是貯存在細(xì)胞內(nèi)的抗原轉(zhuǎn)到表面而被流式細(xì)胞儀檢測(cè)到，ADP刺激能促進(jìn)位于血小板內(nèi)部的PAR-1受體向細(xì)胞膜表面表達(dá)。

大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，CRP不僅是判斷心血管疾病預(yù)后的炎癥標(biāo)志物，同時(shí)它也是動(dòng)脈血栓事件的重要調(diào)節(jié)因子[7]。Danenberg等[8]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRP轉(zhuǎn)基因鼠在血管損傷時(shí)股動(dòng)脈完全閉塞發(fā)生率明顯增高，這提示CRP參與了動(dòng)脈血栓形成。CRP在炎癥狀態(tài)下參與宿主反應(yīng)的調(diào)節(jié)，CRP能抑制T淋巴細(xì)胞活性和血小板的活化[9]，但能激活補(bǔ)體系統(tǒng)和加強(qiáng)凝血功能[10-11]；在本研究中觀察到CRP不僅能減少ADP刺激的血小板聚集，而且能減少ADP刺激的血小板PAR-1的表達(dá)，這提示炎癥狀態(tài)可能抑制血小板PAR-1的表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。因此CRP促進(jìn)血栓形成并不是通過(guò)影響血小板PAR-1的表達(dá)，而可能是通過(guò)影響凝血功能起作用。已有報(bào)道證實(shí)，CRP直接作用于組織纖溶酶原系統(tǒng)和影響血管細(xì)胞組織因子的活性等增強(qiáng)凝血功能[13-14]。CRP下調(diào)血小板PAR-1的機(jī)制不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)，CRP能降低TXB2的表達(dá)，而TXB2是TXA2較穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，TXA2在ADP誘導(dǎo)血小板第二次聚集反應(yīng)至關(guān)重要。還有一些研究發(fā)現(xiàn)CRP干擾前列腺素生成和代謝，而這些均與花生四烯酸水解有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CRP能與磷脂結(jié)合起到穩(wěn)定細(xì)胞膜[15]，防止組織損傷的作用，這可能是其抑制血栓素的形成的機(jī)制，從而在CRP下調(diào)ADP刺激血小板PAR-1表達(dá)中起一定的作用。另一方面，證實(shí)CRP能增加凝血酶原片段F1+2表達(dá)，這提示CRP能促使凝血酶形成，而生成的凝血酶將與血小板表面的PAR-1結(jié)合并水解其N端從而激活受體，而PAR-1一旦裂解激活，PAR-1會(huì)失去再與凝血酶結(jié)合的能力，也不能被PAR-1抗體識(shí)別而檢測(cè)。

他汀類藥物具有防止血栓形成等血管保護(hù)作用，而且不依賴于其調(diào)脂作用。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，證實(shí)普伐他汀體外干預(yù)能抑制ADP誘導(dǎo)血小板PAR-1的表達(dá)，這與臨床研究中報(bào)道的各種他汀均能降低血小板PAR-1的活性和表達(dá)水平相一致[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)普伐他汀能下調(diào)ADP依賴的血栓素形成，同樣在臨床研究中使用他汀也有類似的作用。有研究報(bào)道辛伐他汀和普伐他汀能直接與血小板作用，抑制GPIIb-IIIa 受體表達(dá)，進(jìn)而能抑制血栓素的形成[16]。由于PAR-1在ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和活化中起重要作用，作者推測(cè)普伐他汀對(duì)血栓素的作用與抑制血小板PAR-1有關(guān)。他汀類藥物通過(guò)阻斷ROS形成和減少NAD+/NADH 比例起著抗氧化作用[17]。LOX-1是ox-LDL特異性受體，一般認(rèn)為在氧化應(yīng)激狀態(tài)下LOX-1會(huì)上調(diào)，LOX-1在動(dòng)脈硬化形成、進(jìn)展及血栓形成中均起重要作用。研究表明阻斷LOX-1能抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集[18]，這提示氧化應(yīng)激在ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和活化中同樣存在。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)ADP能誘導(dǎo)血小板LOX-1表達(dá)，與P-選擇素類似，LOX-1表達(dá)與血小板活化程度一致，普伐他汀能下調(diào)ADP誘導(dǎo)的血小板LOX-1表達(dá)，這可能是其抑制血小板PAR-1表達(dá)的一個(gè)重要機(jī)制。由于CRP對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板LOX-1表達(dá)無(wú)明顯影響，而在CRP和普伐他汀均存在的情況下，ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1表達(dá)下降更明顯，這提示CRP 和普伐他汀抑制ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1表達(dá)有不同的機(jī)制。

總之，PAR-1在ADP 誘導(dǎo)的血小板活化中起重要作用，普伐他汀和CRP通過(guò)不同機(jī)制明顯降低ADP誘導(dǎo)的血小板PAR-1的表達(dá)，提示在炎癥狀態(tài)下他汀仍能起著重要的抗血栓作用，這為臨床使用他汀類藥物減少缺血事件提供了理論依據(jù)。

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Modulation of PAR-1 expression by pravastatin and C reactive protein in vitro blood platelets*

Chu Luoxiang,Zhou Suxian,Yang Fan,Qin Yueqiu,Liang Zhishan,Mo Changgan,Wang Xiaodi

(Department of Cardiology,the Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou,Guangxi 545005,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the modulation of protease-activated receptor-1 (PAR-1) expression by pravastatin and C reactive protein(CRP) in vitro blood platelets.MethodsPlatelet-rich plasma (PRP) was isolated from peripheral blood,PRP were treated with CRP,pravastatin and ADP stimulation in vitro study.Experimental groups:blank control group,simple ADP stimulated group,low concentration of pravastatin+ADP group,high concentration pravastatin group+ADP group,CRP group,pravastatin+CRP united group.PAR-1 and LOX-1 expression on platelets were detected by flow cytometry,the result were shown by mean fluorescence intensity (MFI).TXB2 and F1+2 levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsThe 5 μmol/L ADP stimulation significantly increased PAR-1 expression on platelets by 35%.The 50 μg/mL CRP significantly reduced platelet PAR-1 expression induced by ADP(P<0.01).1,10 μmol/L pravastatin significantly reduced platelet PAR-1 expression induced by ADP(P<0.01).Platelet PAR-1 expression induced by ADP was further reduction by combination treatment of CRP,which were significantly reduced compared with treatment of CRP or pravastatin alone(P<0.05).Simple ADP stimulation significantly increased TXB2 level(P<0.01).50 μg/mL CRP and 10 μmol/L pravastatin respectively reduced TXB2 level treated by ADP to (112.68±24.48)pg/mL and (146.48±46.54)pg/mL.Both were reduced significantly compared with ADP stimulation alone(P<0.01).The 50 μg/mL CRP significantly increased level of prothrombin fragment 1+2 induced by ADP(P<0.01),10 μmol/L pravastatin,in contrast,did not influence F1+2 level.Pravastatin reduced platelet LOX-1 expression induced by ADP in a concentration dependent manner,MFI of LOX-1 on platelets treated by 1 μmol/L and 10 μmol/L pravastatin were 1.80±0.19 and 1.62±0.16 respectively,both were reduced significantly compared with that treated by ADP alone(MFI:3.16±0.23),P<0.01.The 50 μg/mL CRP had no significant effect on the expression of LOX-1 stimulated by ADP.ConclusionPAR-1 served as a critical mechanism to relay the platelet activation process induced by ADP.CRP and pravastatin reduced PAR-1 expression in platelet induced by ADP in different way.It is suggested that statins can still play an important role in the antithrombotic effect in the inflammatory state.

[Key words]C-reactive protein;platelet；pravastatin;protease-activated receptor-1

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.006

* 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160030)。

作者簡(jiǎn)介：楚羅湘(1968-)，主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病基礎(chǔ)和臨床研究。

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1459-04

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-01-07)