果王素對(duì)小鼠肺腺癌GP方案化療肝臟損害的防治作用*

賀兼斌，張貽秋，向　志，唐建新，鄧　湘，張　平

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬懷化市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科　418000;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南衡陽(yáng) 421001)

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果王素對(duì)小鼠肺腺癌GP方案化療肝臟損害的防治作用*

賀兼斌1，張貽秋1，向志1，唐建新1，鄧湘2，張平2

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬懷化市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科418000;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南衡陽(yáng) 421001)

[摘要]目的本研究旨在觀察果王素對(duì)肺腺癌小鼠使用GP方案化療過程中對(duì)肝臟的保護(hù)作用，并初步探討果王素護(hù)肝作用的相關(guān)機(jī)制。方法32只接種Lewis肺腺癌的C57BL/6J小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、化療組、低劑量果王素聯(lián)合化療組及高劑量果王素聯(lián)合化療組。給予相應(yīng)藥物干預(yù)，于接種后24 d處死各組小鼠，經(jīng)眼球靜脈叢取各組小鼠血液樣本2 mL，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能相關(guān)指標(biāo)，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度，測(cè)定肝勻漿中氧化及抗氧化酶活性，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)肝臟TNF-α mRNA表達(dá)。結(jié)果化療組有明顯肝功能損害，予以果王素干預(yù)后，肝功能損害減輕；化療組氧化應(yīng)激指標(biāo)升高，抗氧化酶活性降低，果王素干預(yù)后，氧化應(yīng)激指標(biāo)降低，抗氧化酶活性升高；化療組血清中炎癥因子TNF-α的濃度升高，肝臟中TNF-α表達(dá)增強(qiáng)，果王素干預(yù)后,TNF-α的表達(dá)降低。結(jié)論果王素能明顯減輕化療中肝功能損害的程度，起到護(hù)肝作用，其可能機(jī)制與清除氧自由基，抑制氧化應(yīng)激及下調(diào)TNF-α表達(dá)抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]癌,非小細(xì)胞肺；α亞麻酸；藥物療法；氧化應(yīng)激；肝損傷；炎癥反應(yīng)；果王素

肺癌是我國(guó)人群腫瘤的第1位死因，其中75%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。對(duì)于不能手術(shù)根治的中晚期患者，綜合治療中化療是重要的治療手段。目前常用抗腫瘤藥多為化學(xué)合成的細(xì)胞毒類藥物，對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞選擇性差，治療中帶來的毒副作用嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量，有的甚至不能耐受化療而中斷治療。其中，肝臟損害是化療中常見的毒副反應(yīng)，防治化療過程中的毒副反應(yīng)，提高患者對(duì)化療藥物的耐受性是一項(xiàng)重要課題。雖然目前有較多減少毒副作用的西藥用于臨床，但大多價(jià)格昂貴，有時(shí)作用欠佳，中成藥在臟器功能保護(hù)方面有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠肺腺癌模型，行GP方案化療，研究果王素(即獼猴桃果仁油脂肪酸)對(duì)小鼠肺腺癌GP方案化療肝臟損害的防治作用。

1材料與方法

1.1材料C57BL/6J小鼠32只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK11-00-0005，由南華大學(xué)腫瘤研究所提供SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境。Lewis肺腺癌(鼠源)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供；順鉑購(gòu)于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào):040605)；健擇(注射用鹽酸吉西他濱)規(guī)格0.2 g/瓶，批號(hào)：A570546A，法國(guó)禮來有限公司(LILLY FRANCE)生產(chǎn)；果王素(濃度60%)由湖南湘西老爹生物有限公司惠贈(zèng)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide，LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione-SH peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供(批號(hào)：20090311)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino tranferase，ALT)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：200509；天門冬氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase，AST)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：200509；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒為美國(guó)Bio Sources公司產(chǎn)品；MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒，即用PCR擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立按文獻(xiàn)[1]方法建立動(dòng)物腫瘤模型。

1.2.2分組及用藥32只小鼠皮下移植處均成瘤，接種后第4天開始藥物干預(yù)，小鼠分為4組：對(duì)照組、化療組、低劑量果王素聯(lián)合化療組及高劑量果王素聯(lián)合化療組，每組8只。藥物干預(yù)如下，(1)對(duì)照組：生理鹽水每只小鼠0.4 mL/次，于5、12、19 d腹腔注射1次，蒸餾水0.3 mL/次，每日灌胃1次；(2)化療組：接種4 d后開始腹腔注射藥物，按GP方案，順鉑于接種后第5、12、19天各腹腔注射1次，劑量為3 mg/kg，體積為0.2 mL/次，吉西他濱于接種后第5、12、19天各腹腔注射1次，劑量每次為50 mg/kg，體積為0.2 mL/次；(3)低劑量果王素聯(lián)合化療組：化療方案同化療組，于接種后每天灌胃1次，劑量每次為果王素60 mg/kg，體積為0.3 mL/次；(4)高劑量果王素聯(lián)合化療組：化療方案同化療組，于接種后每天灌胃1次，劑量每次為果王素180 mg/kg，體積為0.3 mL/次。腫瘤接種24 d處死全部小鼠。

1.2.3觀察指標(biāo)及方法

1.2.3.1肝功能的測(cè)定用雅培C8000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、 AST、膽紅素(total bilirubin，TBIL)。

1.2.3.2肝組織勻漿中氧化酶及抗氧化酶活性的測(cè)定制備10% 的肝組織勻漿，GSH-Px、SOD、LPO、MDA的測(cè)定按照南京建成公司的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3.3血漿中TNF-α的測(cè)定將血清按1∶2稀釋，作為捕獲抗體，加入用兔抗小鼠TNF-α單克隆抗體(IgG)包被的微孔板中，37 ℃孵育2 h，洗板后，加入與HPR連接的兔抗小鼠TNF-α單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，加入過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺，ELISA測(cè)定450 nm吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算TNF-α濃度(ng/mL)。

1.2.3.4逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)半定量檢測(cè)TNF-αmRNA表達(dá)從GenBank查取TNF-α mRNA基因序列，以Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,TNF-α：上游5′-CCA AAG GGA TGA GAA GTT CC-3′,下游5′- CTC CAC TTG GTG GTT TGC TA-3′ 擴(kuò)增產(chǎn)物片段133 bp；內(nèi)參照三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上游5′- GCA AGT TCA ACG GCA CAG-3′,下游5′-CGC CAG TAG ACT CCA CG AC -3′，片段大小141 bp，上述引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用TRIzo1法提取肝組織總RNA，按兩步法RT-PCR試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)時(shí)序?yàn)椋?1)94 ℃預(yù)變性2 min；(2)96 ℃，15 s；(3)62 ℃，20 s；(4)70 ℃，60 s；共35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min延伸，PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶結(jié)果，以Mkerker(上海鼎國(guó)生物公司)作為標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量參照進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。用Totallab分析軟件進(jìn)行條帶掃描分析，測(cè)量電泳條帶密度，計(jì)算mRNA相對(duì)量。mRNA相對(duì)量=目標(biāo)基因掃描值/GAPDH掃描值×100。

2結(jié)果

2.1各組小鼠肝功能的測(cè)定結(jié)果化療對(duì)小鼠肝功能造成一定損害，與對(duì)照組比較，化療組肝功能指標(biāo)包括ALT、AST 和TBIL皆明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高、低劑量預(yù)果王素聯(lián)合化療組與化療組相比,ALT、AST、TBIL降低(P<0.01)，見表1。

2.2肝組織勻漿中氧化及抗氧化酶的測(cè)定結(jié)果化療使小鼠肝組織內(nèi)MDA和LPO水平急劇上升，氧化活性增加，肝功能損害加重，予以果王素干預(yù)，MDA和LPO水平呈下降趨勢(shì)，低、高劑量果王素聯(lián)合化療組MDA和LPO水平與化療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，化療亦使小鼠肝組織SOD和GSH-Px活性明顯減低，果王素能提高SOD和GSH-Px的活性，低、高劑量果王素聯(lián)合化療組SOD和GSH-Px水平與化療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，具體情況見表2。

2.3各組小鼠血漿TNF-α水平及肝TNF-αmRNA表達(dá)化療組血清中TNF-α水平明顯升高，其肝組織中TNF-αmRNA表達(dá)亦明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，予以果王素處理后血清中TNF-α水平和肝組織中TNF-α mRNA表達(dá)明顯下降，與果王素有劑量相關(guān)性，具體情況見表3、圖1。

表1　各組小鼠肝功能的測(cè)定結(jié)果±s)

a:P<0.01,與對(duì)照組比較，b:P<0.01,與化療組比較。

表2　肝組織勻漿中氧化酶及抗氧化酶活性的測(cè)定結(jié)果±s)

a:P<0.01,與對(duì)照組比較，b:P<0.01,與化療組比較。

表3　各組小鼠血漿TNF-α水平及肝TNF-α mRNA

a:P<0.01,與對(duì)照組比較，b:P<0.01,與化療組比較。

M：maker。1：對(duì)照組；2:高劑量果王素聯(lián)合化療組；3:低劑量果王素聯(lián)合化療組；4：化療組。

圖1肝TNF-α mRNA表達(dá)

3討論

化療是惡性腫瘤綜合治療的重要手段，目前常用抗腫瘤藥多為化學(xué)合成的細(xì)胞毒類藥物，對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞選擇性較差，治療過程中可能帶來嚴(yán)重的毒副作用影響患者的生命質(zhì)量[2]。因化療藥物大多經(jīng)肝臟代謝，藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)是化療常見的毒副反應(yīng)，順鉑和吉西他濱是肺癌化療的常用藥物，兩藥聯(lián)用為GP方案是NSCLC化療的一線方案，兩藥皆有一定的肝功能損害，聯(lián)用肝損害的風(fēng)險(xiǎn)增加[3]，甚至有些患者因難以耐受其不良反應(yīng)而中斷治療，限制了GP方案的應(yīng)用，因此在化療過程中的護(hù)肝治療成為一項(xiàng)重要課題。中國(guó)醫(yī)學(xué)在護(hù)肝治療中具有一定優(yōu)勢(shì)，本研究初步探討果王素在GP方案化療中的護(hù)肝作用及其機(jī)制。

果王素為獼猴桃果仁經(jīng)臨界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分為α-亞麻酸，其還含有一定量的維生素E及微量元素硒等[4]。研究表明果王素及其主要成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用[5-6]。其對(duì)化療藥物肝損害的保護(hù)作用鮮見報(bào)道。本研究中，化療組小鼠肝功能指標(biāo)較對(duì)照組明顯升高，說明GP方案在抗腫瘤的同時(shí)，亦具有一定的肝功能損害。給予果王素干預(yù)后，肝功能指標(biāo)明顯下降，且其下降程度與果王素的劑量呈相關(guān)性，說明果王素對(duì)化療引起的肝功能損害具有保護(hù)作用，高劑量的果王素護(hù)肝作用更明顯。目前對(duì)肝功能損害的機(jī)制研究中，氧化應(yīng)激機(jī)制已被廣泛認(rèn)可[7]，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一種普遍存在的活性氧分子，正常情況下與機(jī)體的抗氧化維持平衡，病理狀態(tài)下，如ROS數(shù)量升高或抗氧化失常，就會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)微環(huán)境處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，其中MDA是氧自由基使細(xì)胞膜中的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化的終產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞毒性作用很大，其含量能直接反映脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度，并與自由基的濃度成正相關(guān)。SOD通過促進(jìn)歧化超氧化物轉(zhuǎn)變成過氧化氫而處理氧自由基，發(fā)揮抗氧化的作用。MDA水平的升高和SOD活性的降低是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志，SOD和MDA是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。LPO為脂質(zhì)過氧化物濃度，GSH-Px催化氧化谷胱甘肽轉(zhuǎn)變成二硫化谷胱甘肽和過氧化氫，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)過氧化氫的分解，從而防止過氧化氫引起的細(xì)胞損傷，LPO和GSH-Px在氧化應(yīng)激的動(dòng)態(tài)平衡中亦起重要作用。在本研究中，化療組肝臟中氧化指標(biāo)MDA、LPO明顯升高，而抗氧化指標(biāo)SOD、GSH-Px明顯下降，說明氧化應(yīng)激在化療肝功能損害中亦為重要的機(jī)制，氧化應(yīng)激導(dǎo)致了肝功能損害。予以果王素干預(yù)后，肝功能各項(xiàng)指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，抗氧化酶升高，氧化應(yīng)激指標(biāo)下降，且與果王素的劑量呈相關(guān)性，說明果王素可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)在化療中起到保護(hù)肝臟的作用，大劑量的果王素抗氧化作用更為明顯。細(xì)胞因子是一類調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌功能的生物活性物質(zhì)，它們與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路而誘導(dǎo)產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α是一種炎性反應(yīng)細(xì)胞因子，有證據(jù)表明TNF-α參與了多種臟器損害的病理過程[8]，其可能機(jī)制為：TNF-α引起炎癥細(xì)胞的聚集、浸潤(rùn)，進(jìn)而釋放更多的炎性介質(zhì)，加重炎癥的級(jí)放大，增加炎癥損傷，進(jìn)一步加重對(duì)組織的損害。本研究中亦發(fā)現(xiàn)，在化療組小鼠血清中，TNF-α的濃度明顯升高，其肝組織中TNF-α基因表達(dá)亦明顯升高，說明TNF-α在化療肝損害中起重要作用，予以果王素干預(yù)后，能明顯降低血清TNF-α的濃度和抑制肝組織TNF-α的表達(dá)，降低肝功能損害，說明果王素能下調(diào)TNF-α的表達(dá)起到護(hù)肝作用。亦有研究表明，使用TNF-α抑制劑后，TNF-α表達(dá)下調(diào)，而臟器功能損害減輕，進(jìn)一步說明TNF-α在臟器功能損害中的作用[9]。有研究表明氧化應(yīng)激可與炎性反應(yīng)相互影響，參與臟器損傷過程，其共同的樞紐可能在于核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，局部產(chǎn)生的氧自由基可激活NF-κB轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，而炎性損傷的細(xì)胞可進(jìn)一步產(chǎn)生大量活性氧分子，加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[10]。果王素在GP方案化療過程中的護(hù)肝作用機(jī)理可能與減輕氧化應(yīng)激及抑制炎性反應(yīng)皆有一定關(guān)系。

綜上所述，果王素能明顯減輕化療中肝功能損害的程度，起到護(hù)肝作用，其可能機(jī)制為清除氧自由基，抑制氧化應(yīng)激及下調(diào)TNF-α表達(dá)抑制炎性反應(yīng)，果王素在抑

制肝臟損害的病理過程中更為具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究，但果王素在作為化療中護(hù)肝的藥物，無疑具有潛在的前景。

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Effect of kiwi essence for prevention and treatment of liver injury caused by GP chemotherapy in mice with lung adenocarcinoma*

HeJianbin1，ZhangYiqiu1，XiangZhi1，TangJianxin1，DengXiang2，ZhangPing2

(1.DepartmentofRespiration，theFirstPeople′sHospitalofHuaihua,HunanUniversityofMedicine,Huaihua,Hunan418000,China;2.DepartmentofRespiration，theFirstAfiliatedHospitalofNanhuaUniversity，Hengyang，Hunan421001，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the liver protective effect of kiwi essence in the mice with lung adenocarcinoma during using GP chemotherapeutic regimen,and to explore its related mechanism.MethodsThirty-two C57BL/6J mice bearing Lexis lung adenocarcinoma were randomly divided into 4 groups: control group,chemotherapy group,low dose kiwi essence combined chemotherapy group and high dose kiwi essence combined chemotherapy group.The mice in each group were given the corresponding medication intervention and sacrificed on 24 d after inoculation for taking 2 mL of blood sample by eye venous lexus.The automatic biochemical analyzer was used to detect the live function related indicators,the enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the tumor necrosis factor-α(TNF-α) level,the oxidase and antioxidase activities in liver homogenates were measured and the liver TNF-α mRNA expression was detected by using RT-PCR.ResultsThe chemotherapy group had significant liver damage,which was alleviated after giving the kiwi essence intervention;the oxidation stress indicators in the chemotherapy group were elevated and the antioxidase activity was decreased,after kiwi essence intervention,the oxidation stress indicators were decreased,while antioxidase activity was increased;the serum inflammation factor TNF-α concentration in the chemotherapy group was elevated,the TNF-α expression in liver was enhanced,after kiwi essence intervention,the TNF-α expression was decreased.ConclusionKiwi essence could significantly reduce the degree of liver damage in chemotherapy and plays the liver-protecting effect.Its possible mechanism might be associated with scavenging the oxygen free radicals,inhibiting oxidative stress,down-regulating TNF-α expression and inhibiting the inflammatory reactions.

[Key words]carcinoma,non-small-cell lung；alpha-linolenic acid；drug therapy；oxidative stress；liver injury；inflammation；kiwi essence

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.007

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(2013C735)；湖南省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項(xiàng)目(201281)。

作者簡(jiǎn)介：賀兼斌(1971-)，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事呼吸內(nèi)科基礎(chǔ)與臨床研究。

[中圖分類號(hào)]R734.2：R284.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)06-0740-03

(收稿日期：2015-07-20修回日期：2015-10-16)