頭孢曲松鈉對(duì)大鼠液壓腦損傷后TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用*

李　萍，解東興，劉　偉，王丹宜，周洪霞

(唐山工人醫(yī)院功能檢驗(yàn)科，河北唐山 063000)

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頭孢曲松鈉對(duì)大鼠液壓腦損傷后TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用*

李萍，解東興，劉偉，王丹宜，周洪霞△

(唐山工人醫(yī)院功能檢驗(yàn)科，河北唐山 063000)

[摘要]目的觀察頭孢曲松鈉(Cef)治療對(duì)大鼠液壓沖擊腦損傷后TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。方法選用雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦損傷組、Cef治療組，每組24只。采用液壓沖擊法制備SD大鼠腦損傷模型，Cef治療組于致傷前5 d注射Cef(200 mg/kg)，連續(xù)5 d。通過(guò)干濕比重法檢測(cè)各組大鼠腦組織含水量，ELISA法檢測(cè)大鼠腦皮層TNF-α、IL-1β水平，免疫組織化學(xué)及Western blot法檢測(cè)腦皮層TLR4的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與腦損傷組比較，Cef治療組明顯減輕液壓沖擊性腦損傷的腦組織含水量(P<0.05)，降低大鼠腦皮質(zhì)組織中炎性因子TNF-α、IL-1β水平(P<0.05)，明顯下調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)量(P<0.05)。結(jié)論Cef可以通過(guò)抑制TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，改善腦水腫情況。

[關(guān)鍵詞]腦損傷；頭孢曲松鈉；腦水腫；神經(jīng)炎癥反應(yīng)

β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉(ceflriaxone，Cef)是一種臨床常用的抗生素[1]。近幾年多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)Cef除有抗菌作用外，還具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，例如在腦缺血缺氧、腦缺血再灌、細(xì)菌性腦膜炎及創(chuàng)傷性腦損傷中均顯示積極的療效[2-4]。然而，Cef對(duì)大鼠液壓沖擊腦損傷后TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。作者通過(guò)建立液壓沖擊腦損傷大鼠模型，通過(guò)ELISA、免疫組織化學(xué)及免疫印跡的方法，觀察Cef處理后大鼠腦組織含水量，TLR4蛋白及炎性因子的變化。以期探討Cef對(duì)腦損傷大鼠的腦保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料健康SD大鼠72只，雄性，普通級(jí)，體質(zhì)量280～300 g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)。兔抗大鼠的TLR4多克隆抗體和小鼠抗大鼠的β-action單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。羊抗兔及羊抗鼠的兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗均購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司。ELISA試劑盒、SABC試劑盒及DAB試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。枸櫞酸鹽緩沖液及PBS緩沖液均購(gòu)自北京中杉金橋有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備及分組將72只健康雄性的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦損傷組、Cef治療組，每組24只。各組又分為12、24、48、72 h 4個(gè)時(shí)間亞組，每個(gè)亞組6只。2%戊巴比妥(40 ms/kg)腹腔麻醉大鼠，假手術(shù)組動(dòng)物常規(guī)麻醉開(kāi)顱，但不給予液壓沖擊處理。腦損傷組、Cef治療組大鼠參照文獻(xiàn)[5]制備液壓沖擊性腦損傷動(dòng)物模型，打擊強(qiáng)度(1.50±0.20)大氣壓(1大氣壓=101.325 kPa)，造成中度腦損傷。液壓沖擊傷后大鼠立即出現(xiàn)豎毛、弓背、前肢屈曲、后肢強(qiáng)直、肌張力明顯增高及心率增快等表現(xiàn)。致傷后將大鼠放回專用鼠籠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用純凈水，恒溫20～25 ℃飼養(yǎng)。Cef治療組大鼠于致傷前5 d腹腔注射Cef(200 mg/kg)，連續(xù)注射5 d。

1.2.2腦組織含水量測(cè)定腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，采用干濕質(zhì)量法測(cè)定腦組織含水量。去除腦干和小腦，取等量腦組織以濾紙吸去表面液體，置于電子分析天平稱腦組織濕質(zhì)量，放于110 ℃恒溫干燥箱內(nèi)，烘烤48 h至恒重，稱得干質(zhì)量后，按Elliot公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量/濕質(zhì)量)×100 %

1.2.3ELISA法檢測(cè)取出血腫周圍腦組織加入生理鹽水制成10%組織勻漿，低溫3 000 r/min離心20 min，留取取上清液，嚴(yán)格按照大鼠的ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。用全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀測(cè)定其吸光度值，波長(zhǎng)設(shè)為450 nm，分別計(jì)算TNF-α或IL-1β水平。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)10%水合氯醛麻醉大鼠后，灌流固定，斷頭剝離腦組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h。腦組織常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。后續(xù)步驟嚴(yán)格按SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.5Western blot法檢測(cè)大鼠斷頭取腦后立即在冰上分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。低溫充分裂解勻漿后離心，留取上清液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。等體積上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，干轉(zhuǎn)發(fā)將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，BSA封閉2 h。滴加兔抗大鼠的TLR4多克隆抗體(1∶500)，小鼠抗大鼠的β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃冰箱過(guò)夜。次日洗滌后滴加羊抗兔及羊抗小鼠二抗室溫孵育2 h。ECL對(duì)條帶進(jìn)行顯色曝光，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

2結(jié)果

2.13組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量比較假手術(shù)組大鼠腦組織有基礎(chǔ)含水量，與假手術(shù)組比較，腦損傷組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量明顯增加，各時(shí)間點(diǎn)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與腦損傷組比較，Cef治療組大鼠腦組織含水量顯著減少，各時(shí)間點(diǎn)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表 1。

2.23組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大腦皮層TNF-α及IL-1β水平比較與假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)比較，腦損傷組大鼠大腦皮層組織中TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)，于12 h開(kāi)始升高，24 h達(dá)高峰，48～72 h降低，且仍高于假手術(shù)組水平。與腦損傷組各時(shí)間點(diǎn)比較，Cef治療組大鼠皮層TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表 2、3。

表1　3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與腦損傷組比較。

表2　3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)皮層TNF-α水平

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與腦損傷組比較。

表3　3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)皮層IL-1β水平

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較；b：P<0.05，與腦損傷組比較。

2.3TLR4蛋白的分布及定位選擇各組24 h大鼠的石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果提示，假手術(shù)組大鼠大腦皮層TLR4蛋白呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)；腦損傷組大鼠皮層組織胞質(zhì)及胞核中可見(jiàn)大量的陽(yáng)性顆粒表達(dá)；Cef治療組大鼠大腦皮層組織TLR4的陽(yáng)性表達(dá)顆粒減少，免疫反應(yīng)性減弱，見(jiàn)圖1。

A：假手術(shù)組；B：腦損傷組；C：Cef治療組。

圖1各組大鼠TLR4的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

2.4TLR4蛋白的表達(dá)量假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠皮層TLR4蛋白僅有微量的表達(dá)。與假手術(shù)組比較，腦損傷組大鼠TLR4的蛋白表達(dá)量在12 h開(kāi)始升高(P<0.05)，至24 h表達(dá)達(dá)到峰值(P<0.05)，而后逐漸下降，但傷后72 h仍明顯高于假手術(shù)組水平(P<0.05)。與腦損傷組相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)比較，Cef治療組大鼠TLR4的蛋白表達(dá)量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4　3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)皮層TLR4蛋白表達(dá)量

a：P<0.05：與假手術(shù)組比較；b：P<0.05：與腦損傷組比較。

3討論

β-內(nèi)酰胺類抗生素是第三代頭孢類抗生素，可有效地透過(guò)血-腦屏障進(jìn)入腦和脊髓中發(fā)揮藥效。其中Cef經(jīng)多數(shù)研究證實(shí)除了具有抗菌作用外還具有新的功能，應(yīng)用后可發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用[2-4]，然而其他β-內(nèi)酰胺類抗生素尚未見(jiàn)報(bào)道具有此功能。所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用液壓沖擊腦損傷大鼠模型，探討Cef的腦保護(hù)作用及作用機(jī)制。干濕比重法測(cè)量腦組織含水量發(fā)現(xiàn)：在液壓腦損傷的大鼠模型中，Cef處理能夠明顯減輕腦組織含水量，緩解腦水腫改變。本結(jié)果提示，Cef對(duì)腦損傷具有一定的治療效果，與先前的文獻(xiàn)報(bào)道相一致。肖國(guó)民等[6]報(bào)道在大鼠致傷后立即一次性給予Cef 200 mg/kg，可以明顯減輕腦水腫并改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。潘向東等[7]發(fā)現(xiàn)Cef通過(guò)降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠谷氨酸鹽水平，減輕海馬CAl區(qū)神經(jīng)元死亡及腦水腫。但是有關(guān)Cef腦保護(hù)作用機(jī)制的研究較少。有研究報(bào)道顯示，Cef可以激活谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1的表達(dá)及功能，從而阻斷興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組大鼠大腦皮層組織中TNF-α和IL-1β水平改變，結(jié)果顯示，Cef能夠明顯降低腦損傷后TNF-α和IL-1β水平，減輕大腦皮層的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。腦損傷后出現(xiàn)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的多因素共同參與的級(jí)聯(lián)過(guò)程，是后續(xù)多種繼發(fā)性腦損傷的病理生理基礎(chǔ)。本發(fā)現(xiàn)揭示Cef降低炎性因子的表達(dá)可能是其在腦損傷大鼠模型中發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。同時(shí)證實(shí)了Cef抗菌之外的另一作用——抗感染作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是生物體中非常重要的固有免疫模式識(shí)別受體，廣泛分布于各種免疫細(xì)胞及多種組織中，在固有免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要作用[9-11]。在TLRs的受體家族中，TLR4是最早被發(fā)現(xiàn)的成員。在腦組織內(nèi)，TLR4主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中[12]。值得注意的是腦組織中TLR4的異常表達(dá)在中風(fēng)、多發(fā)性硬化和阿爾茲海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的免疫病理過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注動(dòng)物損傷模型中TLR4不僅能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，而且還可以觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的活化與創(chuàng)傷性疾病神經(jīng)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和嚴(yán)重的神經(jīng)變性密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)的免疫印跡結(jié)果提示，Cef處理可逆轉(zhuǎn)腦損傷后TLR4的高表達(dá)，限制TLR4誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)液壓沖擊制備大鼠腦損傷模型，研究證實(shí)Cef治療可以減輕腦水腫，對(duì)腦損傷發(fā)揮一定的腦保護(hù)作用。進(jìn)一步探討其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Cef通過(guò)降低TLR4誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)促進(jìn)腦損傷的修復(fù)。揭示了Cef抗菌作用之外的另一重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Effect of ceftriaxone on TLR4 mediated nerve inflammatory reaction after hydraulic brain injury in rats*

LiPing,XieDongxing,LiuWei,WangDanyi,ZhouHongxia△

(DepartmentofFunctionalLaboratory,TangshanWorker′sHospital,Tangshan,Hebei063000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of ceftriaxone(Cef) on TLR4 mediated nerve inflammatory reaction after hydraulic brain injury in rats.MethodsSeventy-two male SD rats were randomly divided into the sham operation group,brain injury group and ceftriaxone treatment group(n=24).The rat model of brain injury was prepared by the hydraulic impact method.The Cef treatment group was treated with Cef(200 mg/kg) on 5 d before injury for successive 5 d.The wet-dry weight method was used to detect the water content in the brain tissue in each group.The levels of TNF-α and IL-1β in the cerebral cortex were tested with the ELISA method.The expression of TLR4 protein in the cerebral cortex was measured by immunohistochemical staining and Western blot methods.ResultsCompared with the brain injury group,the brain tissue water content caused by the hydraulic impact in the Cef treatment group was significantly reduced(P<0.05),the levels of TNF-α and IL-1β in the cerebral cortex tissue were decreased(P<0.05),and the expression of TLR4 protein was significantly down-regulated(P<0.05).ConclusionCef could down-regulate the expression of inflammatory factors and improve the cerebral edema by inhibiting TLR4 mediated nerve inflammation reaction.

[Key words]brain injuries;ceftriaxone;brain edema;inflammation

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.006

基金項(xiàng)目：河北省唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(12140209A-31)。

作者簡(jiǎn)介：李萍(1969-)，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事腦損傷基礎(chǔ)研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:15633910346;E-mail:lipinggnjy@yeah.net。

[中圖分類號(hào)]R605.97

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)06-0737-03

(收稿日期：2015-06-22修回日期：2015-10-09)