基于改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)加入法的碳酸飲料中防腐劑和甜味劑高通量篩查分析

王素方，劉 云，弓麗華，董春紅，符德學(xué)，王國慶*

1. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450001 2. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河南 鄭州 450003 3. 焦作大學(xué)懷藥工程研究中心，河南 焦作 454003

基于改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)加入法的碳酸飲料中防腐劑和甜味劑高通量篩查分析

王素方1，2，劉 云1，弓麗華1，董春紅3，符德學(xué)3，王國慶1*

1. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450001 2. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河南 鄭州 450003 3. 焦作大學(xué)懷藥工程研究中心，河南 焦作 454003

利用正交設(shè)計(jì)分別配制含有三種防腐劑、四種甜味劑的模擬水樣，采用核獨(dú)立成分分析(KICA)處理模擬水樣與加入不同含量標(biāo)準(zhǔn)品的飲料樣品的紫外光譜(UV)數(shù)據(jù)，得到其中待測添加劑或背景成分的UV輪廓的獨(dú)立組分(IC)信息，以IC的系數(shù)矩陣進(jìn)行支持向量回歸(SVR)分析，建立模擬樣品中防腐劑與甜味劑的UV-KICA-SVR預(yù)測模型。添加不同含量水平添加劑的碳酸飲料樣品，采用KICA處理其測試得到的UV光譜數(shù)據(jù)，得到與添加劑對應(yīng)的IC信息及量，加入量與預(yù)測量線性回歸方程截距即為飲料中添加劑含量。利用化學(xué)計(jì)量學(xué)“盲源信號分離”方法提取飲料樣品中的待測添加劑IC信息與樣品基質(zhì)信息，利用SVR對解析得到的IC信號回歸分析建模，改進(jìn)傳統(tǒng)單一組分測定的標(biāo)準(zhǔn)加入法，建立了碳酸飲料樣品中防腐劑和甜味劑高通量篩查分析的新方法。方法用于測定碳酸飲料中山梨酸鉀，苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯鈉三種防腐劑與糖精鈉、安賽蜜，阿斯巴甜和甘草酸銨四種甜味劑含量，檢測限(LOD)為0.2～1.0 mg·L-1，測定結(jié)果與傳統(tǒng)的色譜方法相當(dāng)。

獨(dú)立成分分析； 支持向量回歸； 標(biāo)準(zhǔn)加入法； 防腐劑； 甜味劑； 碳酸飲料

引 言

為了防止食品變質(zhì)腐爛，增強(qiáng)食品的味覺，在食品加工過程中添加防腐劑和甜味劑。根據(jù)中華人民共和國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[1]，食品中允許使用的防腐劑主要有對羥基苯甲酸甲酯鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉等，甜味劑主要有糖精鈉、安賽蜜，阿斯巴甜和甘草酸銨，同時(shí)為了避免這些添加劑過量攝入對人體的潛在傷害，規(guī)定了不同類型食品中添加劑允許的最大使用限量。

傳統(tǒng)的飲料中食品添加劑的測定多用色譜法，需要比較繁瑣的樣品預(yù)處理，儀器設(shè)備及試劑消耗等費(fèi)用較高[2]。光譜分析具有快速簡便、樣品處理簡單、費(fèi)用低廉的特點(diǎn)，但在測定多種添加劑共存、被測對象譜峰重疊嚴(yán)重時(shí)無法直接利用多元線性分析，往往需要借助偏最小二乘法、支持向量回歸(SVR)等方法[3-6]，但是當(dāng)食品基質(zhì)中有其他成分的背景干擾時(shí)會(huì)對測定造成一定的影響。為了有效消除背景對測定結(jié)果的影響，研究人員對標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行了改進(jìn)，這些改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)加入法多用于復(fù)雜基質(zhì)中1-2種成分的測定[7-9]。王國慶等[10]曾將SVR與UV光譜技術(shù)結(jié)合的改進(jìn)對標(biāo)準(zhǔn)加入法，建立了碳酸飲料中6色素篩查分析方法，但是此種UV-SVR法不能提供樣品中被測對象以外其他成分構(gòu)成的背景信號信息。本研究擬在UV-SVR建模時(shí)引入具有“盲源信號”分離潛能的新型化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[11-17]，分別對防腐劑、甜味劑兩類模擬水樣、飲料中加入不同含量添加劑的加標(biāo)樣品，測定其UV光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)核獨(dú)立成分分析(KICA)提取得到的獨(dú)立組分(IC)，以此作為添加劑及背景成分UV光譜輪廓定性信息，進(jìn)一步以添加劑IC的系數(shù)矩陣進(jìn)行SVR建模，對實(shí)際樣品則扣除背景信號后進(jìn)行SVR模型預(yù)測，以期建立一種基于不同添加劑類型的UV-KICA-SVR改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)加入法的碳酸飲料中添加劑高通量篩查分析方法。

1 原理與算法

1.1 核獨(dú)立成分分析

ICA[11-13]是一種統(tǒng)計(jì)信號處理技術(shù), 目的是在信息損失最小的情況下, 將重疊多變量信號(重疊信號)分解為一組統(tǒng)計(jì)上獨(dú)立的組分(源信號)。KICA是通過核函數(shù)將原始數(shù)據(jù)映射到高維特征空間后利用典型相關(guān)分析(CCA)，進(jìn)一步提取得到與源信號對應(yīng)的獨(dú)立組分(IC)。由于核函數(shù)的引入，KICA進(jìn)行化學(xué)信號處理時(shí)具有較強(qiáng)的穩(wěn)健性。

1.2 支持向量回歸分析

SVR算法的基本思想是通過一個(gè)非線性映射(核函數(shù))，將原始數(shù)據(jù)映射到高維特征空間，并在這個(gè)空間建立回歸模型。由于核函數(shù)的引入，SVR可以得到在常規(guī)空間難以得到的模型特征，既可用于線性過程建模，也能用于非線性過程建模[4-6]。

1.3 基于UV-KICA-SVR飲料樣品中添加劑高通量篩查分析

模擬樣品建模： 測試得到模擬混合樣品UV數(shù)據(jù)，進(jìn)行KICA解析得到IC及其系數(shù)矩陣，利用IC系數(shù)矩陣進(jìn)行SVR建模，得到水性基質(zhì)中添加劑測定的UV-KIVA-SVR定量模型。

實(shí)際樣品測定： 加標(biāo)飲料樣品中UV光譜經(jīng)KICA處理得到的IC信息，扣除其中待測添加劑以外基質(zhì)信息，代入U(xiǎn)V-KICA-SVR定量模型，預(yù)測得到加標(biāo)飲料樣品添加劑的預(yù)測量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Thermo Accela, PDA detector, 1250 pump)： 由Thermo公司生產(chǎn)； TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)： 由北京普析通用生產(chǎn)。

防腐劑與甜味劑： 對羥基苯甲酸甲酯鈉(AR)，山梨酸鉀(AR)，苯甲酸鈉(AR)，阿斯巴甜(AR)，安賽蜜(AR)，糖精鈉(AR)，甘草酸銨(AR)，均由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

飲料樣品： 芬達(dá)，雪碧，醒目，由可口可樂公司生產(chǎn)。美年達(dá)，激浪，由百事可樂公司生產(chǎn)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與模擬溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量的對羥基苯甲酸甲酯鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉等三種防腐劑，以及阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉、甘草酸銨等四種甜味劑，用蒸餾水溶解，制成0.1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液于50 mL容量瓶中，蒸餾水稀釋定容至50 mL，分別按照正交設(shè)計(jì)表配制4水平、3因素、53次試驗(yàn)用防腐劑模擬樣品系列與4水平、4因素、53次試驗(yàn)用的甜味劑模擬樣品系列，添加劑最大含量水平為允許限量的4倍。

2.3 飲料樣品及其加入標(biāo)準(zhǔn)品混合樣的光譜測定

準(zhǔn)確移取5 mL樣品于50 mL容量瓶內(nèi)，超聲除去CO2氣體。按表1和表2添加不同含量的防腐劑和甜味劑，用蒸餾水定容至50 mL。以蒸餾水作參比，使用1.0 cm比色皿測定其UV光譜，掃描間隔為1.0 nm，掃描波長范圍190～400 nm。

Table 1 Different amount of preservatives adding into the beverages

Table 2 Different amount of sweeteners adding into the beverages

3 結(jié)果與討論

3.1 單一防腐劑與甜味劑UV測定時(shí)的檢出限

三種防腐劑及四種甜味劑的光譜吸收峰嚴(yán)重重疊，尤其是山梨酸鉀和對羥基苯甲酸甲酯鈉的特征吸收峰幾乎完全重疊，加之多種添加劑共存時(shí)其間還有可能以一定的方式結(jié)合等造成偏離比耳定律的現(xiàn)象發(fā)生，難以直接利用多元線性回歸分析同時(shí)測定多種防腐劑和甜味劑含量。

分別在三種防腐劑與四種甜味劑的最大特征波長處進(jìn)行回歸分析，得到單一添加劑組分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)各回歸方程及其回歸標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到幾種添加劑的檢出限(LOD)分別為對羥基苯甲酸甲酯鈉0.4 mg·L-1，山梨酸鉀0.2 mg·L-1, 苯甲酸鈉0.2 mg·L-1, 安賽蜜0.4 mg·L-1, 糖精鈉1.0 mg·L-1, 阿斯巴甜0.8 mg·L-1, 甘草酸銨0.8 mg·L-1。

3.2 模擬水樣中特征光譜輪廓提取與UV-KICA-SVR建模

3.2.1 模擬水樣中純組分UV輪廓的提取

采用主成分分析(PCA)確定防腐劑和甜味劑模擬混合樣中吸光因子數(shù)均為3，分別用KICA提取其中IC得到3個(gè)UV輪廓如圖1、圖2所示。

將圖1中IC數(shù)據(jù)矩陣與防腐劑純組分光譜矩陣做相關(guān)性分析得到對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(r)： IC1-對羥基苯甲酸甲酯鈉，0.640 8； IC2-苯甲酸鈉，0.856 9； IC3-山梨酸鉀，0.960 0。說明KICA有效提取了模擬防腐劑水樣中純組分的UV光譜輪廓特征，混合組分IC可以作為樣品定性分析。四種甜味劑模擬水樣中僅有三種吸光因子數(shù)，原因是阿斯巴甜與糖精鈉的在205～240 nm范圍內(nèi)光譜曲線變化趨勢基本相同，只是在高吸收的近紫外(190～205 nm)有一定的差別，在240 nm以上UV波長范圍基本上無吸收，此二者UV嚴(yán)重重疊，在KICA處理時(shí)將其作為同一IC[16-17]。

Fig.1 UV spectral profiles extracted from the simulated preservatives watefr solutions

Fig.2 UV spectral profiles extracted from the simulated sweeteners watefr solutions

圖2中，3個(gè)IC與甜味劑數(shù)據(jù)矩陣的相關(guān)系數(shù)(r)分別為： IC1-甘草酸銨，0.965 4； IC2-安賽蜜，0.991 9； IC3-阿斯巴甜，0.893 8； IC3-和糖精鈉，0.890 5。說明三種IC體現(xiàn)的四種甜味劑的UV光譜輪廓特征，其中IC3代表了阿斯巴甜與糖精鈉UV光譜特征。

3.2.2 模擬水樣UV-KICA-SVR建模

分別計(jì)算得到模擬防腐劑、甜味劑樣品IC的系數(shù)矩陣各53組，均勻選取26組作為校正集，13組作為交互檢驗(yàn)集，13組作為預(yù)測集。采用SVR建模，基于以往研究基礎(chǔ)[10]，選擇采用徑向基核函數(shù)，設(shè)定σ=220，ε=0，γ=10×107。以交互檢驗(yàn)均方根誤差(RMSECV)、預(yù)測集均方根誤差(RMSE)和預(yù)測值與實(shí)際值之間回線性歸分析的相關(guān)系數(shù)來考查所建模型的性能和預(yù)測效果。結(jié)果表明，七種添加劑的RMSECV在0.009 8～0.074 8之間，RMSF在0.010 4～0.073 7之間，R2均大于0.99。檢驗(yàn)集與和預(yù)測集的誤差均較小且總體上大小相當(dāng)，預(yù)測結(jié)果與實(shí)際加入量具有很好的線性相關(guān)性，說明建立即使在樣品中樣品光譜峰嚴(yán)重重疊、某些相似光譜成分視為相同IC的情況下，UV-KICA-SVR模型具有較好的準(zhǔn)確性。

3.3 飲料中添加劑UV-KICA-SVR改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)加入法篩查

3.3.1 待測樣品與背景信號的提取

采用KICA分別處理飲料中添加不同含量防腐劑、甜味劑樣品的UV光譜數(shù)據(jù)，提取得到的IC信息分別如圖3、圖4所示。

Fig.3 Independent components extracted from beverages added different preservative levels

Fig.4 Independent components extracted from beverages added different sweetener levels

圖3與圖1對應(yīng)的IC1，IC2，IC3相關(guān)系數(shù)分別為0.961 2，0.842 3，0. 879 0，IC4則體現(xiàn)為為背景信號； 圖4與圖2中對應(yīng)的IC1，IC2，IC3相關(guān)系數(shù)分別為0.899 7，0.868 6，0.851 0，IC4則體現(xiàn)為為背景信號。分類建模時(shí)提取得到的樣品背景信號IC4明顯不同，說明標(biāo)準(zhǔn)加入法不同類型添加劑測定時(shí)的背景信號不同，在用SVR進(jìn)行實(shí)際樣品的含量預(yù)測時(shí)，將IC4圖光譜信息扣除，即將其作為標(biāo)準(zhǔn)添加以外成分的背景信號，有效消除標(biāo)準(zhǔn)加入法背景信號的干擾。

3.3.2 飲料樣品中防腐劑和甜味劑高通量篩查分析

分別計(jì)算扣除IC4背景信號后3個(gè)IC的系數(shù)矩陣，以此作為UV-KICA-SVR預(yù)測模型輸入。市場上四種品牌碳酸飲料中防腐劑、甜味劑預(yù)測結(jié)果如表3所示。

Table 3 Regression equations between additives with different adding level and the predicted amounts by UV-KICA-SVR

Note:yPredicted amounts;x: Added mounts

由表3可以看出，添加量與預(yù)測量的回歸方程的R2達(dá)到了0.99以上，說明所建立的UV-KICA-SVR在多種添加劑共存，同時(shí)還有其他基質(zhì)成分存在的情況下，對實(shí)際飲料樣品中待測成分具有良好的預(yù)測能力。當(dāng)取添加量為0時(shí)，得到回歸直線的截距，此值即飲料樣品中相應(yīng)的添加劑的含量(個(gè)別負(fù)值可作未檢出處理)?；貧w方程的斜率為實(shí)際樣品測定時(shí)的平均回收率[18]，可以看出同一飲料樣品不同添加劑測定的回收率不同，不同樣品中相同添加劑測定的回收率也不盡相同，說明待測成分與樣品基質(zhì)等對特定添加劑測定的回收率影響不同。

模型預(yù)測結(jié)果與采用HPLC測試結(jié)果進(jìn)行了對比，對于飲料樣品中防腐劑或甜味劑的陽性檢出，UV-KICA-SVR法與HPLC法結(jié)果大體相當(dāng)，誤差不超過0.5 mg·L-1； 一些樣品HPLC未檢出防腐劑或甜味劑，采用本法預(yù)測出某些較低的含量，這些值低于本法的檢測限，可作未檢出或疑似陽性樣品處理，必要時(shí)可以將樣品進(jìn)行濃縮凈化等預(yù)處理后進(jìn)一步確認(rèn)。出現(xiàn)低于檢測限的預(yù)測結(jié)果可能原因是部分防腐劑、甜味劑的UV光譜輪廓高度重疊，使得與其光譜特征相似的添加劑成分在SVR模型輸入上形成部分投影而產(chǎn)生； 或者在與其他添加劑等成分共存時(shí)，由于協(xié)同效應(yīng)[19]等因素，使得多元校正模型的預(yù)測能力較之于單一成分測定有所提高。

4 結(jié) 論

采用UV-KICA-SVR改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)加入法分類建立校正模型，能夠?qū)?shí)際飲料樣品中的防腐劑、甜味劑含量進(jìn)行預(yù)測。此法在實(shí)際樣品分析時(shí)，能夠得到樣品中待測組分與其他背景成分的光譜輪廓特征，在進(jìn)行SVR建模時(shí)可以扣除背景信號，從而對實(shí)際樣品進(jìn)行食品添加劑成分的定量篩查獲得樣品的定性或半定性信息。

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*Corresponding author

High Throughput Screening Analysis of Preservatives and Sweeteners in Carbonated Beverages Based on Improved Standard Addition Method

WANG Su-fang1, 2, LIU Yun1, GONG Li-hua1, DONG Chun-hong3, FU De-xue3, WANG Guo-qing1*

1. School of Materials and Chemical Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450001, China 2. Inspection & Quarantine Technology Centre, Henan Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau of China, Zhengzhou 450003, China 3. Research Center of Huaiqing Chinese Medicine, Jiaozuo University, Jiaozuo 454003, China

Simulated water samples of 3 kinds of preservatives and 4 kinds of sweeteners were formulated by using orthogonal design. Kernel independent component analysis (KICA) was used to process the UV spectra of the simulated water samples and the beverages added different amounts of the additive standards, then the independent components (ICs), i.e. the UV spectral profiles of the additives, and the ICs’ coefficient matrices were used to establish UV-KICA-SVR prediction model of the simulated preservatives and sweeteners solutions using support vector regression (SVR) analysis. The standards added beverages samples were obtained by adding different amounts level of additives in carbonated beverages, their UV spectra were processed by KICA, then IC information represented to the additives and other sample matrix were obtained, and the sample background can be deducted by removing the corresponding IC, other ICs’ coefficient matrices were used to estimate the amounts of the additives in the standard added beverage samples based on the UV-KICA-SVR model, while the intercept of linear regression equation of predicted amounts and the added amounts in the standard added samples is the additive content in the raw beverage sample. By utilization of chemometric “blind source separation” method for extracting IC information of the tested additives in the beverage and other sample matrix, and using SVR regression modeling to improve the traditional standard addition method, a new method was proposed for the screening of the preservatives and sweeteners in carbonated beverages. The proposed UV-KICA-SVR method can be used to determine 3 kinds of preservatives and 4 kinds of sweetener in the carbonate beverages with the limit of detection (LOD) are located with the range 0.2～1.0 mg·L-1, which are comparable to that of the traditional high performance liquid chromatographic (HPLC) method.

Independent component analysis; Support vector regression; Standard addition method; Preservative; Sweetener; Carbonate beverage

Aug. 31, 2014; accepted Dec. 16, 2014)

2014-08-31，

2014-12-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21075113)，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK114)和河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(122300410004)資助

王素方，1966年生，河南出入境檢驗(yàn)檢疫局高級工程師 e-mail: wangsf@haciq.gov.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: gqwang@zzuli.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0482-05