汪景榮,張卓勇*,張振偉,相玉紅
1. 首都師范大學化學系,北京 100048 2. 首都師范大學物理系,太赫茲光電子學教育部重點實驗室,北京 100048
偏最小二乘法和THz-TDS在正品大黃鑒別中的應用
汪景榮1,張卓勇1*,張振偉2,相玉紅1
1. 首都師范大學化學系,北京 100048 2. 首都師范大學物理系,太赫茲光電子學教育部重點實驗室,北京 100048
太赫茲技術的發(fā)展近年來受到廣泛的關注并被應用于熱點。中草藥大黃的品質(zhì)鑒定對于中藥制劑的質(zhì)量控制具有重要的意義。利用大黃的太赫茲時域光譜結(jié)合偏最小二乘法(PLS)模型對基于41個正品和非正品大黃的中草藥鑒別模型進行了研究。首先采集大黃樣品的太赫茲時域光譜(THz-TDS)信號,然后將化學計量學方法用于這些大黃樣品太赫茲光譜的信號處理與建模,再建立基于太赫茲光譜的大黃品質(zhì)鑒定的偏最小二乘模型方法。應用S-G一階導數(shù)、去趨勢、標準正態(tài)變換、自標度化、均值中心化等方法對原始時域譜預處理再與未經(jīng)預處理的結(jié)果相比,偏最小二乘(PLS)模型的預測正確率從80%明顯提高到90%。在模型建立和模型檢驗中,采用留一法(LOO)選取訓練集和檢驗集樣本。利用留一法交叉驗證確定了PLS模型的最佳主因子數(shù)。結(jié)果表明,當采用均值中心化方法時,PLS模型的RMSECV和RMSEP的值均達到了最小,分別為0.076 6和0.169 0。研究結(jié)果表明,THz-TDS技術結(jié)合化學計量學方法能夠快速、準確的對大黃的真?zhèn)芜M行鑒別,直接使用太赫茲時域光譜而不使用計算后的吸收譜有兩個優(yōu)點: (1)在分頻測定和光譜信號處理時無需考慮樣品的厚度;(2)使光譜信號處理過程得到簡化。該技術也可以對其他中草藥進行鑒別和質(zhì)量控制。該法快速、簡單、無污染、無需樣品預處理,是一種有發(fā)展前景的中草藥無損檢測方法。
太赫茲時域光譜; 偏最小二乘法; 大黃
大黃是常用的傳統(tǒng)中草藥,為多年生草本植物,用藥歷史悠久。掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.exBalf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根及根莖,為中國藥典收錄的三種正品大黃[1]。近年來,隨著大黃用藥量的不斷增加,正品大黃已不能滿足需求,一些偽品大黃如華北大黃RheumfranzenbachiiMunt.、河套大黃RheumhotaoenseC.Y.ChengetKao、藏邊大黃RheumemodiiWall.等冒充正品大黃出現(xiàn)在市場上,嚴重影響了大黃的臨床效用[2]。正品大黃一般具有利膽退黃、保肝、止血、抗菌、瀉下等作用[3],而偽品大黃的瀉下作用較弱。因此,為了控制大黃藥材的質(zhì)量,保證大黃用藥的安全性和有效性,需對大黃進行準確鑒定。隨著中藥指紋圖譜技術的發(fā)展,各種色譜、光譜及其他儀器分析技術開始廣泛用于大黃的鑒定。楊美華等[4]應用RAPD方法對正品和偽品大黃進行指紋圖譜的研究,該法達到了在分子水平上鑒定正品和偽品大黃的目的。馮有龍等[5]利用HPLC對大黃及部分含大黃中成藥的真?zhèn)芜M行了鑒別。李磊等[6]采用高效液相色譜法建立大黃藥材的指紋圖譜,該法可以明顯區(qū)分正品與非正品大黃。但是這些指紋譜分析方法都需對樣品進行分離、浸取、濃縮等預處理,屬于有損分析,操作復雜且耗費時間,測試結(jié)果在一定程度上依賴于預處理技術。因此,發(fā)展一種無須預處理,就能快速、準確對大黃進行鑒別和質(zhì)量控制的方法,有著重要的意義。隨著數(shù)學、統(tǒng)計學、計算機等技術的發(fā)展,化學計量學結(jié)合近紅外光譜技術開始廣泛用于大黃的鑒別[7-8]。
太赫茲輻射,又稱T射線,是指頻率在0.1~10 THz范圍內(nèi)的電磁波,位于微波和紅外之間,是微觀電子學向宏觀光子學過渡的區(qū)域,與許多材料具有獨特的相互作用[9]。隨著太赫茲輻射技術的不斷發(fā)展,太赫茲光譜開始廣泛用于中草藥領域[10-11]。但是當待測樣品在太赫茲波段沒有明顯的特征吸收峰時,這些方法將無法對樣品進行準確鑒別。隨著計算機技術的不斷發(fā)展,化學計量學開始用于中草藥的太赫茲光譜分析[12]。但是這些方法都需要對測得的原始時域譜進行傅里葉變換,從而得到樣品的吸收譜和折射率譜,計算方法復雜,信息處理過程耗時。因此,發(fā)展一種快速、準確的中草藥無損鑒別方法十分必要。
偏最小二乘法(PLS)[13-14]是一種多元統(tǒng)計分析方法,主要通過對光譜矩陣和性質(zhì)矩陣同時進行分解,在分解時考慮兩者之間的相互關系,從而建立最佳的校正模型。Kennard-Stone(KS)法[15]作為一種校正樣本的選擇方法,其主要優(yōu)點是所選擇的的校正集樣本空間距離分布均勻,具有較好的代表性。
本研究發(fā)展了一種直接應用大黃的太赫茲時域譜結(jié)合偏最小二乘法來對大黃進行快速、準確鑒別的新方法。該法與近紅外方法相比,具有以下優(yōu)點: (1)大多數(shù)中草藥中所含生物分子的低頻振動或轉(zhuǎn)動模式都處在THz波段,而近紅外光譜不能達到這一區(qū)域。(2)THz輻射脈沖寬度在皮秒到飛秒量級,可以對中藥進行時間分辨的瞬態(tài)光譜研究,而且通過采樣測量技術,能有效抑制背景輻射的干擾,得到信噪比很高的時域譜。(3)THz-TDS技術可以對許多大分子進行指紋識別,從而檢測物質(zhì)結(jié)構的微小差異[16]。而近紅外光譜主要是基于分子內(nèi)部振動的倍頻和合頻吸收,譜峰較寬,重疊嚴重且吸收強度較弱[17]。
實驗以41個大黃樣品為研究對象,應用大黃的太赫茲時域譜建立PLS定性分析模型。應用留一法交互驗證[18]選取PLS模型的最佳主因子數(shù),同時比較了不同的預處理方法對模型預測能力的影響。
1.1 PLS
采用NIPALS算法的PLS模型有效地克服了主成分分析的不足,在對光譜矩陣X進行主成分分解的同時也對性質(zhì)矩陣Y進行主成分分解,且通過迭代時交換X與Y的迭代矢量使兩個分解過程合二為一[19]。其主要原理[20-22]如下。
對光譜矩陣X和性質(zhì)矩陣Y進行線性分解,如式(1)和式(2)所示。
X=TPT+E
(1)
Y=UQT+F
(2)
其中,X是一個矩陣,n是光譜的行數(shù),p是光譜采樣點數(shù)。Y是一個由1和0構成的性質(zhì)矩陣,1代表正品大黃,0代表非正品大黃。T和U分別是X和Y的得分矩陣,P和Q是X和Y的載荷矩陣,E和F分別是X和Y的殘差矩陣。
對T和U進行線性回歸
U=TB
(3)
B=(TTT)-1TTY
(4)
由P得到預測集樣品光譜矩陣Xpred的得分矩陣Tpred,然后通過式(5)得到Y(jié)的預測值。
Ypred=TpredBQ
(5)
在應用PLS確定主因子數(shù)時,使計算所得主因子數(shù)之間方差盡可能最大的同時,還使主因子數(shù)與性質(zhì)最大程度相關。
1.2 KS法
KS法基于變量之間的歐式距離,從所有的樣本中依次挑選合適的樣本進入校正集[23-24]。首先將歐式距離最遠的兩個向量對選入校正集,隨后在迭代過程中將擁有最大最小距離的樣本選入校正集,以此類推,直到滿足要求的樣本數(shù)目[25]。該法能夠保證校正集中的樣本空間距離分布均勻,且具有代表性。
2.1 儀器及參數(shù)
實驗使用Z-3透射式THz時域光譜系統(tǒng),如圖1所示。系統(tǒng)的發(fā)射極為InAs晶體,探測極為ZnTe晶體。實驗中使用的激光器為Spectra-Physics公司的鎖模鈦寶石激光器。脈沖的中心波長為800 nm,頻率范圍為0.1~3 THz,積分時間為100 ms,測量速度為0.002 5 mm·s-1,步長為0.1 mm。使用MVDS-400 controller軟件來記錄測量數(shù)據(jù)。
Fig.1 Schematic diagram of THz-TDS measurement
2.2 樣品制備
用于實驗的大黃樣品共有41個,其中17個為正品大黃,24個為非正品大黃,均由北京同仁堂股份公司科學研究所提供。所有的大黃樣品經(jīng)干燥后粉碎,過60目篩,再次真空干燥2 h,留待制樣。實驗時,稱量150 mg樣品粉末于瑪瑙研缽中研磨,在6.5 t壓力下壓成厚度在0.9~1.2 mm之間,直徑為13 mm,兩表面平行且沒有裂紋的圓形薄片。
2.3 樣品太赫茲光譜的采集
室溫下,在系統(tǒng)內(nèi)通入氮氣保持相對濕度<1%,防止水汽對實驗的影響。將樣品從1~41編號,測量時隨機取出一個置于太赫茲脈沖的中心位置,探測樣品的時域波形。移動樣品,在其不同位置測量3次,以保證樣品具有代表性。每測完一個樣品,同時測量一次以氮氣為背景的參考信號。最后將所測得的樣品信號和參考信號取平均,即可得到41個大黃樣品的太赫茲時域譜。每條時域光譜有2 985個數(shù)據(jù)點。
2.4 模型的評價參數(shù)
應用PLS法建立大黃的太赫茲時域譜和性質(zhì)矩陣的定性分析模型。模型分別以校正集樣品的交互驗證均方根誤差(root-mean squared error of cross-validation, RMSECV)和預測集樣品的預測均方根誤差(root-mean squared error of prediction, RMSEP)作為評價指標。計算如式(6)和式(7)所示。
(6)
(7)
其中,yt, p為模型的預測值,yi, a為模型的實際值。在本文中,正品大黃的目標輸出為1,非正品大黃的目標輸出為0。為了使模型的預測精度更高,實驗中閾值設為0.2,即當模型的預測值小于0.2時,判定為非正品大黃; 當模型的預測值大于0.8時,判定為正品大黃。n為校正集樣品數(shù),m為預測集樣品數(shù)。
2.5 數(shù)據(jù)處理和建模
應用KS法選取31個大黃樣本為校正集,其余10個樣本為預測集。應用多元散射校正(multiplicative scatter correction,MSC)、Savitzky-Golay五點三次多項式平滑(S-G平滑)、Savitzky-Golay五點三次一階導數(shù)(S-G一階導數(shù))、標準正態(tài)變換(standard normal variation,SNV)、去趨勢(Detrending)、自標度化(Autoscaling)、均值中心化(Mean centering)等方法對原始時域譜進行預處理,建立PLS分類模型,整個模型的校正主因子數(shù)通過留一法交互驗證選取,應用預測均方根誤差和正確率來評價模型對未知樣本的預測能力。同時比較不同的預處理方法對模型預測正確率的影響。
3.1 41個大黃樣品的太赫茲時域譜
41個大黃樣品的太赫茲時域光譜如圖2所示。兩類大黃樣品信號的振幅強度明顯低于參考信號,可能因樣品對太赫茲輻射的吸收和散射導致。樣品信號相對于參考信號有一定的時間延遲,這可能是由于不同樣品相對于氮氣有不同的折射率。從圖2可以看出,41個大黃的時域譜重疊在一起,僅憑肉眼難以區(qū)分出正品和非正品大黃,因此借助化學計量學方法進行鑒別。
Fig.2 Time-domain spectra of rhubarb
3.2 KS法劃分校正集和預測集
正品和非正品大黃化學組成復雜,樣本信息包含在相似性很強的時域光譜中。因此,在PLS建模過程中,選擇代表性強的樣本,不僅可以提高建模的速度,而且可以提高模型的預測精度和擴大模型的適用范圍。應用KS法選取3/4的樣本為校正集,1/4的樣本為預測集,所選的校正集和預測集的樣品編號如表1所示。
Table 1 Calibration set and!prediction set were selected by KS method
為了更清晰地反應所選校正集和預測集中樣品的分布情況,我們對41個樣品光譜做主成分分析,其得分圖如圖3所示。
Fig.3 Principal component scores of the calibration set and prediction set selected by KS method
31個校正集樣品在主成分得分圖上分布比較均勻,10個預測集樣品被包含在校正集中??梢姡A測集的光譜信息被包含在校正集的光譜信息之中,KS法可以提高模型的預測精度[25]。
3.3 PLS模型主因子數(shù)的選擇
在應用PLS建立校正模型時,參與回歸的最佳主因子數(shù)選取對模型的預測精度有重要影響。如果選取的主因子數(shù)太多,會將測量過程中產(chǎn)生的噪聲擬合到模型中,造成過擬合。如果選取的主因子數(shù)太少,會損失原始光譜矩陣中的有用信息,降低模型的預測精度,造成欠擬合。因此,合理選擇建模的最佳主因子數(shù)能夠有效利用光譜信息和濾除光譜噪聲[26]。本實驗不用對原始時域譜進行預處理,應用留一法對校正集進行交互驗證,根據(jù)RMSECV值來選取建模的最佳主因子數(shù)。選取1~10個主因子數(shù),依次計算其RMSECV值,當主因子數(shù)為3時,其RMSECV值最小。此時,計算模型對未知樣本的預測正確率為80%。模型的預測能力還不太理想。
3.4 不同的預處理方法對PLS模型的影響
由于在光譜測量時,原始時域譜中除包含樣品化學信息外,還可能存在其他無關信息和噪聲,如樣品背景和雜散光等[17]。因此,在建模時,應用一定的預處理方法,可以濾除原始光譜中的無關信息和噪聲,從而提高模型的預測能力和穩(wěn)健性。分別應用MSC、S-G平滑、S-G一階導數(shù)、SNV、detrending、autoscaling、mean centering等方法對原始時域譜進行預處理,應用留一法選取最佳的校正主因子數(shù),隨后建立PLS定性模型對預測集樣本進行預測,所得結(jié)果如表2所示。
Table 2 Effects of different pretreatment methods on the PLS model
原始時域譜經(jīng)S-G平滑處理后和未經(jīng)預處理的建模主因子數(shù)、RMSECV、RMSEP值都相等,且對未知樣品的預測正確率均為80%,沒有顯著的提高。這可能是由于應用S-G平滑對原始時域譜處理時,在去除光譜噪聲的同時也去除了原始光譜中與性質(zhì)矩陣相關的信息。應用MSC對原始時域譜進行預處理后,模型的預測正確率反而下降到60%。這可能與原始光譜數(shù)據(jù)和MSC算法兩方面有關系。MSC算法假定散射與波長及樣品的濃度變化無關[17],而對于大黃樣本的光譜數(shù)據(jù),真?zhèn)未簏S的化學成分復雜,組分性質(zhì)變化較大,應用MSC來校正達不到預期的效果,反而可能會引入過多的噪聲。
應用S-G一階導數(shù)、去趨勢、標準正態(tài)變換、自標度化、均值中心化等方法對原始時域譜預處理后,PLS模型的預測正確率從80%顯著提高,達90%。S-G一階導數(shù)和標準正態(tài)變換兩種預處理方法,建模的主因子均為3。與未經(jīng)預處理的PLS模型相比,主因子數(shù)沒有發(fā)生變化,也就沒有達到使模型更加簡潔的目的。同時,RMSEP值卻有明顯的增大。而經(jīng)去趨勢預處理后的建模主因子數(shù)明顯減少,由3降到1,達到了簡化模型的目的,但同時RMSEP值也增加了。與S-G一階導數(shù)、標準正態(tài)變換預處理方法相比,自標度化和均值中心化的建模主因子數(shù)增加了一倍,在保持正確率為90%的同時,RMSECV和RMSEP值卻明顯下降。其中,均值中
心化的RMSECV和RMSEP值最小,達到了最理想的建模效果。這可能是均值中心化方法將光譜的變化與大黃樣品組成的變化關聯(lián)起來,使樣品光譜之間的差異增大,從而使模型的預測能力得到有效提高。應用均值中心化對原始時域譜進行預處理后,根據(jù)留一法選取的PLS建模主因子數(shù)和RMSECV值的關系如圖4所示。
Fig.4 RMSECV obtained by preprocessing method of mean centering for the time domain spectra with respect to PLS component number
由圖4可知,大黃的原始時域譜經(jīng)均值中心化預處理后,RMSECV值隨建模主因子數(shù)的變化呈現(xiàn)出理想的變化趨勢。RMSECV值最小時主因子數(shù)為6,此為建立PLS模型的最佳主因子數(shù)。
應用THz-TDS系統(tǒng)在室溫下測量了41個大黃樣品的THz時域譜,所測太赫茲時域光譜直接用于光譜預處理和建模。應用不同的預處理方法結(jié)合PLS建立了大黃的定性分析模型。整個模型的最佳主因子數(shù)通過留一法交互驗證來選取。實驗結(jié)果表明,原始時域譜未做預處理時,建模主因子數(shù)為3,預測正確率為80%。應用S-G一階導數(shù)、去趨勢、標準正態(tài)變換、自標度化、均值中心化等方法對原始時域譜預處理后,預測正確率從80%明顯提高到90%。其中,應用均值中心化預處理后,與其他方法所得結(jié)果相比,建模的主因子數(shù)雖然達到了6,但是RMSECV和RMSEP的值均達到了最小,分別為0.0766和0.1690,使模型的預測能力達到最好。該法簡便、無污染,無需對樣品預處理,就能準確鑒別正品與非正品大黃,還可以用于其他中草藥生產(chǎn)中的質(zhì)量控制。
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*Corresponding author
Identification of Official Rhubarb Samples by Using PLS and Terahertz Time-Domain Spectroscopy
WANG Jing-rong1, ZHANG Zhuo-yong1*, ZHANG Zhen-wei2, XIANG Yu-hong1
1. Department of Chemistry, Capital Normal University, Beijing 100048, China 2. Department of Physics, Capital Normal University, Key Laboratory of Terahertz Optoelectronics, Ministry of Education, Beijing 100048, China
The development of terahertz technology is attracting broad intention in recent years. The quality identification is important for the quality control of Chinese medicine production. In the present work, terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS) combined with partial least squares (PLS) were used for the identification model building and studied based on 41 official and unofficial rhubarb samples. First, the THz-TDS spectra of rhubarb samples were collected and were preprocessed by using chemometrics methods rather than transformed to absorption spectra. The identification models were then established based on the processed terahertz time domain spectra. The spectral preprocessing methods include Savitzky-Golay (S-G) first derivative, detrending, standard normal transformation (SNV), autoscaling, and mean centering. The identification accuracy of 90% was accomplished by using proper pretreatment methods, which was higher than the classified accuracy of 80% without any preprocessing for the time domain spectra. The component number of the PLS model was evaluated by leave-one-out cross-validation (LOOCV). The minimum values of the root-mean squared error of cross-validation (RMSECV) and root-mean squared error of prediction (RMSEP) were 0.076 6 and 0.169 0 by using mean centering method, respectively. The results of this work showed that the combination of terahertz time domain spectroscopy technology with chemometrics methods, as well as PLS can be applied for the recognition of genuine and counterfeit Chinese herbal medicines, as well as official and unofficial rhubarbs. The advantage of using terahertz time domain spectra directly with no transformation into absorption spectra is: (1) the thickness of samples could not be considered in the model establishment, and (2) the spectral processing was simplified. The proposed method based on the combination of THz-TDS and chemometrics proved to be rapid, simple, non-pollution and solvent free, which is suitable to be developed as a promising tool for quality control of many other Chinese herbal medicines.
Terahertz time-domain spectroscopy; Partial least squares; Rhubarb
Aug. 11, 2014; accepted Dec. 20, 2014)
2014-08-11,
2014-12-20
國家重大科學儀器專項項目(2012YQ140005)和國家自然科學基金項目(21275101;11204191)資助
汪景榮,1986年生,首都師范大學化學系碩士研究生 e-mail: jingrong626@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: gusto2008@vip.sina.com
O657.3; O433.1
A
10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0316-06