大鼠正畸牙移動(dòng)過(guò)程中牙周膜骨硬化蛋白的表達(dá)

陳一文　高尚　許彤彤　張佳慧　李金城　李金成張慧彥　盧金金　胡敏　劉志輝.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科；.修復(fù)科，長(zhǎng)春 300

?

大鼠正畸牙移動(dòng)過(guò)程中牙周膜骨硬化蛋白的表達(dá)

陳一文1高尚1許彤彤1張佳慧1李金城1李金成1張慧彥1盧金金1胡敏1劉志輝2
1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科；2.修復(fù)科，長(zhǎng)春 130012

[摘要]目的觀(guān)察正畸牙移動(dòng)過(guò)程中大鼠牙周組織中骨硬化蛋白（Sclerostin）的表達(dá)及分布，研究Sclerostin在正畸牙移動(dòng)骨改建中的作用。方法選取24只Wistar大鼠，安裝加力裝置，加載50 g力近中移動(dòng)左側(cè)第一磨牙，分別于安裝加力裝置后的0、1、3、5、7、14 d處死大鼠，用蘇木精-伊紅（HE）染色觀(guān)察第一磨牙牙周組織形態(tài)學(xué)變化，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色觀(guān)察破骨細(xì)胞的數(shù)量變化，免疫組織化學(xué)染色方法探究第一磨牙牙周膜中Sclerostin的表達(dá)變化。結(jié)果HE染色顯示隨加力時(shí)間的延長(zhǎng)壓力側(cè)骨組織破壞逐漸加重，免疫組織化學(xué)染色顯示Sclerostin的表達(dá)逐漸增加，5 d時(shí)達(dá)到高峰，之后又逐漸降低，壓力側(cè)表達(dá)多于張力側(cè)。結(jié)論Sclerostin可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路或者直接或間接控制骨形態(tài)發(fā)生蛋白參與了正畸牙移動(dòng)骨改建過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]骨硬化蛋白；牙周膜；正畸牙移動(dòng)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China(81470764);Vital Science and Technology Project Supported by Jilin Provincial Science and Technology Department(20140204066SF);Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship(2013B78356).Correspondence: Hu Min, E-mail: humin@jlu.edu.cn.

正畸牙移動(dòng)是機(jī)械力作用下牙周組織發(fā)生改建來(lái)完成的，其中牙周膜的生物力學(xué)作用起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。牙周膜中包含具有分化潛能的成纖維細(xì)胞群體，它們對(duì)機(jī)械刺激高度敏感。機(jī)械刺激可以作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)換成生物反應(yīng)和不同細(xì)胞的行為變化，比如細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)表達(dá)，最終導(dǎo)致牙周組織的改造和適應(yīng)性變化。已有研究證實(shí)，體外培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞具有向成骨樣細(xì)胞分化的能力，表達(dá)成骨基因標(biāo)識(shí)及形成鈣結(jié)節(jié)[1]，也可表達(dá)骨硬化蛋白（Sclerostin）[2]。Sclerostin是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)成骨細(xì)胞具有抑制作用的糖蛋白，激素水平、機(jī)械刺激以及低氧等外部條件的改變能影響Sclerostin的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、免疫組織化學(xué)染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色，觀(guān)察加力不同時(shí)間段Sclerostin在牙周膜內(nèi)的分布和表達(dá)趨勢(shì)，探討Sclerostin在正畸牙移動(dòng)頜骨改建中的作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的8周齡雄性Wistar大鼠24只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重為180～220 g，本實(shí)驗(yàn)中所有的實(shí)驗(yàn)流程都遵循吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)方針。

1.2大鼠正畸牙移動(dòng)頜骨改建模型的建立

以Wistar大鼠的上頜切牙作為支抗，使用鎳鈦拉簧提供持續(xù)牽引力（50 g）近中移動(dòng)左側(cè)第一磨牙，右側(cè)第一磨牙作為對(duì)照側(cè)，不安裝加力裝置。每8 h分別檢查加力裝置脫落情況，如有損壞和脫落立即重新結(jié)扎。

1.3標(biāo)本制備

所有動(dòng)物分別于加力后的0、1、3、5、7、14 d心臟灌注法處死：腹腔注射4%水合氯醛（0.01 mL·g-1）麻醉，剪開(kāi)右心耳，從左心室心尖向心臟內(nèi)緩慢推入生理鹽水，待流出的液體清亮后用同樣的方法推入4%多聚甲醛溶液，至大鼠肌肉僵硬。取大鼠左側(cè)上頜磨牙及周?chē)M織，將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛溶液中。24 h后取出，常溫下浸泡10%中性乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液中脫鈣2個(gè)月，依次進(jìn)行脫水、透明、浸漬、包埋，按平行于第一磨牙近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，切片厚度為3 μm。選取第一磨牙牙根及牙周組織完整的切片經(jīng)過(guò)脫蠟透明后進(jìn)行HE染色、TRAP染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.4染色

1.4.1HE染色將制好的切片按照常規(guī)步驟進(jìn)行HE染色。

1.4.2免疫組織化學(xué)染色染色前，組織切片需用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。然后用過(guò)氧化氫酶阻斷劑在室溫下孵育10 min以抑制過(guò)氧化氫酶活性。接著用PBS緩沖液沖洗，滴加血清以減少背景染色。之后去除血清后滴加1︰100比例稀釋后的第一抗體，在4 ℃下濕盒中過(guò)夜孵育。然后用PBS沖洗，加入第二抗體，室溫下孵育10 min。最后滴加DAB顯色液使免疫反應(yīng)可見(jiàn)。

1.4.3TRAP染色按照試劑盒上的說(shuō)明嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.5圖像分析

在每張切片張力側(cè)與壓力側(cè)牙周組織分別隨機(jī)選取3個(gè)不重疊視野進(jìn)行圖像采集，采用Image Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量圖像的平均光密度（optical density，OD）和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)選取200×視野，針對(duì)陽(yáng)性染色且位于Howship陷窩同時(shí)細(xì)胞核數(shù)量不小于3者予以計(jì)數(shù)；光密度選取牙周膜區(qū)域的400×視野進(jìn)行測(cè)量。二者均由同一有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者重復(fù)3次后取平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)多組樣本進(jìn)行多組樣本均數(shù)的LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1大鼠牙周組織形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)組未加力時(shí)牙周組織形態(tài)完整良好，牙槽骨邊緣平整。加力1 d時(shí)，壓力側(cè)牙周膜厚度逐漸減小，張力側(cè)逐漸增寬；至加力3 d時(shí)，壓力側(cè)牙槽骨邊緣開(kāi)始出現(xiàn)較為明顯的骨吸收陷窩，其內(nèi)可見(jiàn)破骨細(xì)胞。隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，壓力側(cè)骨吸收范圍逐漸擴(kuò)大，骨組織的破壞明顯，至加力14 d時(shí)仍未見(jiàn)吸收陷窩修復(fù)的表現(xiàn)，剩余牙槽骨面積縮?。▓D1）。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組未加力時(shí)拉力側(cè)與壓力側(cè)均未發(fā)現(xiàn)有Sclerostin陽(yáng)性表達(dá)。隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，Sclerostin表達(dá)逐漸增加（圖2），在5 d時(shí)Sclerostin表達(dá)達(dá)到高峰，隨之表達(dá)逐漸降低，5 d和7 d時(shí)壓力側(cè)Sclerostin表達(dá)多于張力側(cè)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3）。

2.3TRAP染色結(jié)果

破骨細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與免疫組織化學(xué)結(jié)果相似，實(shí)驗(yàn)組未加力時(shí)少見(jiàn)破骨細(xì)胞，隨加力時(shí)間的增加，壓力側(cè)牙槽骨邊緣可見(jiàn)多核、胞漿紅染的破骨細(xì)胞（圖4），5 d時(shí)數(shù)量達(dá)到高峰，隨之逐漸降低，3、5和7 d組破骨細(xì)胞數(shù)量壓力側(cè)多于張力側(cè)（P<0.01）（圖5）。

圖2　加力不同時(shí)間牙周膜中Sclerostin的觀(guān)察結(jié)果　免疫組織化學(xué)染色　× 400Fig 2　Results of Sclerostin expression in periodontal ligament after applied orthodontic force for different days　immunohistochemical staining　× 400

圖3　加力不同時(shí)間牙周膜中Sclerostin免疫組織化學(xué)染色平均OD值Fig 3　The mean OD of Sclerostin immunohistochemical staining　in periodontal ligament after applied orthodontic force for　different days

圖4　加力5 d時(shí)骨吸收陷窩內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)的破骨細(xì)胞　　TRAP 染色Fig 4　TARP-positive osteoclasts in Howship’s lacuna after applied　orthodontic force for 5 days　TRAP staining

圖5　不同加力時(shí)間TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig 5　Count of the TRAP-positive cells after applied orthodontic　force for different days

3　討論

3.1Sclerostin在正畸牙移動(dòng)頜骨改建中的作用

Sclerostin是由骨細(xì)胞等骨源性細(xì)胞分泌的一種，可以通過(guò)Wnt通道抑制骨形成的糖蛋白[3]，在破骨細(xì)胞生成、成骨細(xì)胞分化中起到較為重要的作用。

牙周膜細(xì)胞中包含具有多分化潛能的細(xì)胞群體，能分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等，能維持牙周組織代謝和平衡，并參與其改建的作用，是正畸過(guò)程中骨改建的關(guān)鍵[4]。國(guó)內(nèi)學(xué)者[2]在人牙周膜細(xì)胞礦化誘導(dǎo)過(guò)程中證實(shí)Sclerostin參與人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的分化過(guò)程。本研究通過(guò)建立大鼠正畸牙移動(dòng)模型，擬探究正畸力作用下Sclerostin的表達(dá)機(jī)制。

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

本研究實(shí)驗(yàn)組牙周膜中Sclerostin的表達(dá)在壓力側(cè)與張力側(cè)較對(duì)照組相比均增加，同時(shí)，5 d組和7 d組中Sclerostin的表達(dá)壓力側(cè)多于張力側(cè)（P<0.01）。提示在機(jī)械力的作用下，牙周膜細(xì)胞可能通過(guò)某種通路導(dǎo)致Sclerostin的表達(dá)增加。國(guó)外學(xué)者給予小鼠的尺骨持續(xù)施加機(jī)械力時(shí)，導(dǎo)致骨組織中Sclerostin的表達(dá)水平明顯降低[5]；尾部垂釣使小鼠后肢不受負(fù)荷，表現(xiàn)為骨組織中Sclerostin表達(dá)增多，Wnt/βcatenin信號(hào)活性降低[6]。國(guó)外學(xué)者[7]又證實(shí)在運(yùn)動(dòng)后血清中Sclerostin的含量下降。這些研究均表明Sclerostin的表達(dá)與機(jī)械刺激有關(guān)。然而，在正畸牙移動(dòng)過(guò)程中，壓力側(cè)的牙周膜處于失去應(yīng)力的狀態(tài)，而張力側(cè)牙周膜則受到張力的作用[8]。有學(xué)者[9]在加力1周后拆去第一磨牙的加力裝置，然后持續(xù)1周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其壓力側(cè)與張力側(cè)的Sclerostin表達(dá)均有增加，且含量高于持續(xù)加力組。所以可以合理地推斷，由于大鼠切牙生長(zhǎng)的特殊性，加力裝置的固位易于因切牙的磨耗而脫落，盡管實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天檢查3次修補(bǔ)脫落的加力裝置以盡量減少誤差，但是仍不可避免由于裝置的脫落，而導(dǎo)致的拉力側(cè)表達(dá)增加。

本研究結(jié)果還顯示，牙周膜中Sclerostin的表達(dá)和牙周組織中的破骨細(xì)胞均先逐漸增加，至5 d達(dá)到峰值，隨后逐漸地減少，14 d時(shí)Sclerostin的表達(dá)減少到接近3 d水平，推測(cè)原因可能有以下兩種：一是由于Sclerostin和Noggin可競(jìng)爭(zhēng)性與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）結(jié)合并抑制其作用[10]。骨改建過(guò)程是骨吸收與骨形成的動(dòng)態(tài)平衡，二者同時(shí)進(jìn)行。BMP促進(jìn)骨形成的作用已經(jīng)廣泛得到證實(shí)，而Noggin作為其最具親和力的一種細(xì)胞外拮抗劑，可特異性地被細(xì)胞表面的BMP受體結(jié)合來(lái)拮抗BMP的作用[11]。在正畸力的持續(xù)作用下，BMP的表達(dá)趨勢(shì)逐漸增加至5 d出現(xiàn)峰值，隨后逐漸下降，且張力側(cè)多于壓力側(cè)[12]，進(jìn)而誘導(dǎo)其負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑Noggin合成，但表達(dá)較BMP稍顯延遲，7 d時(shí)達(dá)到峰值，以抑制其過(guò)度表達(dá)。因此推測(cè)Sclerostin同BMP的分泌接近同步，而被延遲分泌的Noggin抑制，三者共同參與骨改建的調(diào)節(jié)，綜合表現(xiàn)為壓力側(cè)骨吸收，張力側(cè)骨形成；二是Sclerostin通過(guò)抑制Wnt/ β-catenin信號(hào)通路抑制骨形成[6]。Sclerostin在胚胎發(fā)育早期時(shí)可以抑制Wnt，通過(guò)結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）-5/6受體以及破壞由Wnt誘導(dǎo)的Frizzled-LRP復(fù)合體形成而抑制Wnt蛋白的形成[13]，調(diào)節(jié)骨量[14]。對(duì)敲除SOST基因的小鼠進(jìn)行尾部懸吊，發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性未降低，也未產(chǎn)生骨喪失現(xiàn)象；缺乏LRP-4的成骨細(xì)胞系表現(xiàn)為Sclerostin表達(dá)增加，證實(shí)是由于解除了對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制和Sclerostin對(duì)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）含量變化的感應(yīng)，LRP-4在成骨細(xì)胞系中通過(guò)作為Sclerostin的受體反向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路和促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成[15]。由此可見(jiàn)，Sclerostin可以通過(guò)直接或間接調(diào)控BMP和抑制Wnt/ β-catenin信號(hào)通路參與正畸牙移動(dòng)頜骨改建過(guò)程。

3.3臨床意義及展望

目前臨床上對(duì)促進(jìn)骨改建的療法較少。由于Sclerostin具有抑制骨形成的作用，故推測(cè)其抗體可能具有促進(jìn)骨形成的作用。有學(xué)者[16]將螺釘植入大鼠脛骨，注射Sclerostin抗體后進(jìn)行拉力測(cè)試，發(fā)現(xiàn)骨小梁厚度和骨體積分?jǐn)?shù)較對(duì)照組有所增加，證實(shí)Sclerostin抗體在骨改建時(shí)可以增加骨形成。Sclerostin抗體的臨床應(yīng)用正在進(jìn)行探索，希望在調(diào)控骨改建、牙齒移動(dòng)速度和提高骨量方面能有所應(yīng)用，為正畸和種植等技術(shù)提供新的思路，為臨床干預(yù)治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lancet, 2004, 364(9429):149-155.

[2]林婷婷, 陸爾奕.SOST基因在人牙周膜細(xì)胞礦化誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)[J].上?？谇会t(yī)學(xué), 2012, 21(2):139-144.Lin TT, Lu EY.Effect of induced-mineralization on the expression of SOST in human periodontal ligament cells[J].Shanghai J Stomatol, 2012, 21(2):139-144.

[3]Poole KE, van Bezooijen RL, Loveridge N, et al.Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation[J].FASEB J, 2005, 19(13):1842-1844.

[4]King GJ, Keeling SD, McCoy EA, et al.Measuring dental drift and orthodontic tooth movement in response to various initial forces in adult rats[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop, 1991, 99(5):456-465.

[5]Robling AG, Bellido T, Turner CH.Mechanical stimulation in vivo reduces osteocyte expression of sclerostin[J].J Musculoskelet Neuronal Interact, 2006, 6(4):354.

[6]Lin C, Jiang X, Dai Z, et al.Sclerostin mediates bone response to mechanical unloading through antagonizing Wnt/ beta-catenin signaling[J].J Bone Miner Res, 2009, 24(10): 1651-1661.

[7]Kerschan-Schindl K, Thalmann MM, Weiss E, et al.Changes in serum levels of myokines and Wnt-antagonists after an ultramarathon race[J].PLoS ONE, 2015, 10(7):e0132478.

[8]Nishiyama Y, Matsumoto T, Lee JW, et al.Changes in the spatial distribution of sclerostin in the osteocytic lacunocanalicular system in alveolar bone due to orthodontic forces, as detected on multimodal confocal fluorescence imaging analyses[J].Arch Oral Biol, 2015, 60(1):45-54.

[9]Yadav S, Assefnia A, Gupta H, et al.The effect of lowfrequency mechanical vibration on retention in an orthodontic relapse model[J].Eur J Orthod, 2016, 38(1):44-50.

[10]Winkler DG, Yu C, Geoghegan JC, et al.Noggin and sclerostin bone morphogenetic protein antagonists form a mutually inhibitory complex[J].J Biol Chem, 2004, 279(35): 36293-36298.

[11]Zimmerman LB, De Jesús-Escobar JM, Harland RM.The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4[J].Cell, 1996, 86(4):599-606.

[12]楊琳琳.正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中BMP-2在牙周組織中表達(dá)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[D].大連: 大連醫(yī)科大學(xué), 2010.Yang LL.Expression of BMP-2 in periodontal tissues during orthodontic tooth movement in an animal experimental study [D].Dalian: Dalian Medical University, 2010.

[13]Collette NM, Genetos DC, Murugesh D, et al.Genetic evidence that SOST inhibits WNT signaling in the limb[J].Dev Biol, 2010, 342(2):169-179.

[14]Cui Y, Niziolek PJ, MacDonald BT, et al.Lrp5 functions in bone to regulate bone mass[J].Nat Med, 2011, 17(6):684-691.

[15]Xiong L, Jung JU, Wu H, et al.Lrp4 in osteoblasts suppresses bone formation and promotes osteoclastogenesis and bone resorption[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(11):3487-3492.

[16]Agholme F, Li X, Isaksson H, et al.Sclerostin antibody treatment enhances metaphyseal bone healing in rats[J].J Bone Miner Res, 2010, 25(11):2412-2418.

（本文編輯杜冰）

Sclerostin expression in periodontal ligaments during movement of orthodontic teeth in rats

Chen Yiwen1, Gao Shang1,

Xu Tongtong1, Zhang Jiahui1, Li Jincheng1, Li Jincheng1, Zhang Huiyan1, Lu Jinjin1, Hu Min1, Liu Zhihui2.(1.Dept.of Orthodontics, School of Stomatology, Jilin University, Changchun 130012, China;2.Dept.of Prosthodontics, School of Stomatology, Jilin University, Changchun 130012, China)

[Key words]Sclerostin;periodontal ligament;orthodontic tooth movement

[Abstract]ObjectiveThis study aims to observe the expression of Sclerostin during movement of orthodontic teeth and determine the effect of this protein on remodeling of periodontal tissues.Methods Twenty-four Wistar rats were chosen.Orthodontic forces were applied between the bilateral incisor and first molar to achieve mesial movement.Rats in each group were executed at different time points (0, 1, 3, 5, 7, 14 d).Morphology of periodontal tissue was observed by hematoxylineosin(HE) staining.The number of osteoclasts were observed by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining.Sclerostin expression were observed by immunohistochemical staining.Results HE staining revealed that the resorption of alveolar bone intensified with prolonged movement.Results of immunohistochemical and TRAP staining revealed that Sclerostin expression and number of osteoclasts were related to duration of movement of orthodontic tooth.After staining for 5 days, the number of osteoclasts and Sclerostin expression reached their peak and then began to decline.The numbers of osteoclasts and the expression level of Sclerostin were higher at the compressive side than those at the tensive side.ConclusionSclerostin affected orthodontic tooth movement by inhibiting the Wnt signaling pathway and by indirectly or directly controlling bone morphogenetic protein.

[中圖分類(lèi)號(hào)]R 783.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.005

[收稿日期]2015-12-01； [修回日期]2016-03-05

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（81470764）；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)科技計(jì)劃（20140204066SF）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（2-013B78356）

[作者簡(jiǎn)介]陳一文，學(xué)士，E-mail：397329354@qq.com

[通信作者]胡敏，教授，博士，E-mail：humin@jlu.edu.cn