湖南洞庭湖區(qū)12株H9N2亞型AIV全基因序列的進(jìn)化分析

黃建龍，譚　丹,，王昌建，張朝陽(yáng)，何世成，朱春霞，汪洪冰，鄧國(guó)華，劉道新

(1 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410014;2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001)

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湖南洞庭湖區(qū)12株H9N2亞型AIV全基因序列的進(jìn)化分析

黃建龍1，譚丹1,2，王昌建1，張朝陽(yáng)1，何世成1，朱春霞1，汪洪冰1，鄧國(guó)華2，劉道新1

(1 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410014;2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001)

[摘要]【目的】 從分子生物學(xué)角度了解H9N2亞型禽流感病毒在湖南省洞庭湖區(qū)的變異特點(diǎn)和進(jìn)化規(guī)律?！痉椒ā?對(duì)近年來(lái)洞庭湖區(qū)分離的12株H9N2亞型禽流感毒株的全基因進(jìn)行分段克隆測(cè)序，應(yīng)用Mega 5軟件包對(duì)病毒基因進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的繪制與分析?！窘Y(jié)果】 12株H9N2亞型禽流感毒株HA裂解位點(diǎn)均沒(méi)有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，屬于低致病性病毒。12株H9N2亞型禽流感病毒HA、NA基因進(jìn)化比較同步，均處于DK/HK/Y280/97分支，而6個(gè)內(nèi)部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)與高致病性禽流感H5亞型毒株呈現(xiàn)不同程度重組現(xiàn)象，且與H7N9亞型毒株基因的核苷酸同源性很高，很有可能為其提供內(nèi)部基因?！窘Y(jié)論】 湖南省洞庭湖地區(qū)H9亞型禽流感病毒的遺傳演化較為復(fù)雜，存在廣泛的基因重組現(xiàn)象。

[關(guān)鍵詞]H9N2亞型禽流感；遺傳進(jìn)化； 洞庭湖區(qū)；湖南省

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)為負(fù)鏈單股RNA病毒，由8個(gè)基因片段組成，按照片段長(zhǎng)度由大到小依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因。AIV感染的宿主范圍、組織親嗜性、致病力與HA的受體特異性、NA的唾液酸酶活性等密切相關(guān)，其內(nèi)部基因某些特殊性位點(diǎn)的突變對(duì)AIV宿主范圍、毒力及耐藥性等也有一定的影響。有研究認(rèn)為，我國(guó)H9亞型AIV多數(shù)帶有易于結(jié)合哺乳動(dòng)物受體的突變[1-2]，有專(zhuān)家預(yù)測(cè)H9N2亞型AIV基因相對(duì)頻繁的變異，使其可能成為毒力較強(qiáng)的毒株，成為下次流感大流行的亞型[3]。

自從1994年陳伯倫等[4]首次在中國(guó)從臨床病雞體內(nèi)分離到H9N2亞型禽流感毒株以來(lái)，H9N2亞型禽流感在我國(guó)的流行和傳播呈上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的危害[5-10]。禽流感病毒基因的頻繁變異給禽流感的防控帶來(lái)非常大的難度，本研究對(duì)近年來(lái)從湖南省洞庭湖區(qū)活禽市場(chǎng)及鴨場(chǎng)的正常監(jiān)測(cè)樣品中分離的12株H9N2亞型禽流感毒株進(jìn)行全基因遺傳進(jìn)化分析，旨在從分子生物學(xué)角度了解H9N2亞型AIV在湖南省洞庭湖區(qū)的變異特點(diǎn)和進(jìn)化規(guī)律，為該地區(qū)H9N2亞型禽流感的防控提供理論依據(jù)，從而有效預(yù)防和控制禽流感，保護(hù)人體健康和公共衛(wèi)生安全。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs和分子量Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶、LS TRIzol RNA 提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司，膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA生物工程公司，BigDye Terminator測(cè)序試劑盒3.1version 購(gòu)自ABI公司。

1.1.2主要儀器包括臺(tái)式離心機(jī)(Beckman X-22R)、高速離心機(jī)(Eppendorf 5242)、PCR儀(TaKaRa TP600)、可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)、紫外投射儀(GL-3120)、凝膠成像系統(tǒng)(GBOXHR)和測(cè)序儀(ABI 3500XL)。

1.1.3毒株12株H9N2亞型AIV均分離自湖南省洞庭湖區(qū)活禽市場(chǎng)及鴨場(chǎng)的正常監(jiān)測(cè)樣品，由哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離保存，經(jīng)HA-HI和RT-PCR試驗(yàn)鑒定為H9N2亞型AIV，具體毒株名稱(chēng)見(jiàn)表1。

表 1　湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分離株

1.1. 4雞胚9～11日齡SPF雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2AIV的增殖

將供試AIV按104～109稀釋梯度接種10日齡SPF雞胚，48 h后取有血凝價(jià)(HA-HI試驗(yàn))且病毒稀釋度最高的雞胚尿囊液作為下一次純化種毒，如此純化3次后，以最適合的稀釋度接種9～11日齡SPF雞胚，48 h后收取雞胚尿囊液，經(jīng)過(guò)HA-HI試驗(yàn)驗(yàn)證及無(wú)菌檢測(cè)后分裝，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3AIV各基因片段的擴(kuò)增

采用RT-PCR方法擴(kuò)增12株湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分離株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段。反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5′-AGCAAAAGCAGG-3′， 所有擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中H9N2亞型AIV基因片段序列，選擇同源性最高的區(qū)域,由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。引物由博士生物公司合成。

1.4AIV基因組序列的測(cè)定

紫外透射儀測(cè)定PCR產(chǎn)物的濃度并按測(cè)序要求計(jì)算所需DNA量， PCR反應(yīng)結(jié)束后加入2.0 μL終止液。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物在終止反應(yīng)后加入體積分?jǐn)?shù)95%冰乙醇60 μL，混勻，于-20 ℃放置 15 min后， 4 ℃下12 000 r/min離心20 min，小心棄去上清液，加70 μL體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇， 4 ℃下 12 000 r/min離心10 min洗脫殘留的鹽，之后再重復(fù)操作一次，將沉淀倒于紙上于室溫下晾干，加入15 μL甲酰胺，使DNA沉淀充分溶解，最后全部加入測(cè)序板內(nèi)，并進(jìn)行高溫變性，采用測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5AIV各基因序列的獲得及基因同源性和進(jìn)化樹(shù)分析

采用DNAStar軟件中Seqman程序?qū)IV各個(gè)基因片段的原始序列進(jìn)行拼接，采用MegAlign程序?qū)Ω鱾€(gè)基因片段進(jìn)行核苷酸以及氨基酸的同源性比較；應(yīng)用Mega 5軟件包對(duì)AIV各個(gè)基因進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的繪制。

2結(jié)果與分析

2.1AIVHA基因編碼氨基酸序列及遺傳進(jìn)化分析

在洞庭湖區(qū)分離的12株H9N2亞型AIV的HA全長(zhǎng)為1 683 bp，編碼560個(gè)氨基酸,分為HA1和HA2片段。由表2可知，除毒株CK/HuN/591/11HA基因的裂解位點(diǎn)為PARSSR/GLF外，其余毒株的HA基因的裂解位點(diǎn)為PSRSSR/GLF，均無(wú)多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入。氨基酸序列分析表明，HA1上共有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別是29(NST)、141(NVS)、218(NRT)、299(NTT)、305(NVS)、313(NCS)，HA2上有2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別是492(NGT)、551(NGS)，其中CK/HuN/591/11毒株313(NCS)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸的突變?yōu)?13(NCP)，導(dǎo)致該潛在的糖基化位點(diǎn)缺失，有5株毒株增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)218(NRT)。12株AIV受體結(jié)合位點(diǎn)均有2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別是198位點(diǎn)由V突變?yōu)锳，234位點(diǎn)由Q突變?yōu)長(zhǎng)(表2)。

12株AIV的HA基因核苷酸同源性在87.8%～99.9%。有研究學(xué)者將H9亞型毒株劃為3個(gè)群系，分別是CK/BJ/1/94(DK/HK/Y280/97)、CK/HK/G9/97、QA/HK/G1/97。本研究的12株AIV均屬于DK/HK/Y280/97分支，與其核苷酸同源性在91.3%～92.0%，處于該分支的還有浙江、安徽、廣東及廣西分離的H9N2亞型AIV(圖1)。從進(jìn)化樹(shù)可以看出，分離的H9亞型AIV進(jìn)化比較同步，說(shuō)明屬于DK/HK/Y280/97分支的禽流感病毒一直在我國(guó)南方地區(qū)流行。

表 2　湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒HA基因特征位點(diǎn)氨基酸序列分析

備注：毒株1～12的名稱(chēng)同表1，“-”表示缺失。下表同。

Note:The strain names from 1 to 12 corresponded to Table 1,“-” indicates missing.The same below.

2.2AIVNA基因編碼氨基酸序列及遺傳進(jìn)化分析

由表3可知，對(duì)供試的12株H9N2亞型禽流感病毒NA基因進(jìn)行氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，所有的H9N2亞型毒株NA蛋白頸部均有63-65位的缺失，對(duì)應(yīng)其潛在糖基化位點(diǎn)61(NIT)消失，具體的糖基化位點(diǎn)及可能的HB受體結(jié)合位點(diǎn)存在一定突變。

圖 1　湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的HA基因進(jìn)化樹(shù)

本研究還發(fā)現(xiàn)，供試的12株病毒NA基因核苷酸同源性在92.7%～99.9%，與近期在浙江、廣東、山東等地分離到的H9N2亞型AIV毒株集中于同一分支上，屬于DK/HK/Y280/97(圖2)。

圖 2湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的NA基因進(jìn)化樹(shù)

Fig.2Phylogenetic tree of H9N2 subtype AIVNAgene from Dongting Lake region,Hunan

2.3AIV內(nèi)部基因序列特殊氨基酸位點(diǎn)分析及遺傳進(jìn)化分析

2.3.1M基因本研究中，12株H9N2亞型禽流感病毒的M基因均包含2個(gè)閱讀框架(M1 和M2)，在M2基因編碼的氨基酸中，與病毒抗藥性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)27(V)、30(A)及 31(S)有些發(fā)生了突變。對(duì)M基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果(圖3)顯示，有些H5、H7亞型毒株與供試的H9N2亞型毒株處在同一分支中，說(shuō)明H5、H7、H9亞型毒株之間可能存在M基因的交換。

從圖3可以看出，M基因進(jìn)化樹(shù)可以分為2大分支，第1分支中有同期在湖南家禽中分離的H5N1亞型毒株及2013年在上海、江蘇、杭州等沿海地區(qū)分離的H7N9亞型毒株，分離的10株H9N2亞型毒株處于該分支，與其他毒株的核苷酸同源性為97.7%～99.1%，說(shuō)明它們之間可能存在著基因的重組；第2分支僅有3株毒株，其中同時(shí)從環(huán)境中分離的H9N2、H5N1毒株之間核苷酸同源性為98.9%，可能它們來(lái)源于共同的祖先。

2.3.2PB2 基因序列分析表明，供試12株AIVPB2基因核苷酸同源性在97.2%～99.9%，氨基酸同源性在97.6%～99.9%。 從進(jìn)化樹(shù)(圖4)可以看出，不同亞型毒株的PB2基因分別處于不同的小分支，但它們的核苷酸同源性比較高，同時(shí)可以看出分離的這些H9N2亞型毒株較引起人感染的H7亞型禽流感毒株P(guān)B2基因進(jìn)化更原始些，這也證實(shí)了致人發(fā)病的H7N9亞型禽流感毒株的PB2基因均由H9亞型毒株提供。

2.3.3PB1基因序列分析表明，供試12株AIVPB1 基因毒株核苷酸同源性在95.3%～100%，氨基酸同源性在97.8%～100%。從圖5可以看出，在各分支中分散有H9N2、H5N1、H7亞型毒株，說(shuō)明H5、H9、H7亞型毒株之間發(fā)生了PB1基因的重組。

圖 3湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的M基因進(jìn)化樹(shù)

Fig.3Phylogenetic tree of H9N2 subtype AIVMgene from Dongting Lake region,Hunan

2.3.4PA基因序列分析表明，供試12株AIVPA基因核苷酸同源性在95.7%～100%，氨基酸同源性在95.8%～100%。從圖6可以看出，在供試12株H9N2亞型AIV毒株中，有2株H5N1亞型毒株散在于其中，說(shuō)明可能H9亞型毒株為H5N1亞型毒株提供了PA基因。

2.3.5NP基因12株AIV毒株NP基因核苷酸同源性在95.7%～100%，氨基酸同源性在95.8%～99.9%。由圖7可知，有H5N1、H7N9亞型毒株與供試的毒株處于同一分支，表明H5N1、H7N9亞型毒株的NP基因可能是由H9亞型毒株提供的。

2.3.6NS基因12株AIV毒株NS基因核苷酸同源性在95.7%～100%，氨基酸同源性在95.8%～99.9%。由圖8可知，分離的H5N1、H7N9亞型毒株與H9亞型毒株處于同一分支，說(shuō)明這些毒株之間發(fā)生了NS基因的交換或重組。

3討論

HA是病毒毒力和宿主特異性的主要決定因素[11]，大多數(shù)高致病力毒株的HA在其裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)堿性氨基酸插入，在無(wú)類(lèi)胰蛋白酶的情況下就能發(fā)生裂解，造成感染禽全身系統(tǒng)衰竭，導(dǎo)致死亡。分離的12株H9N2亞型毒株中，除毒株CK/HuN/591/11HA基因的裂解位點(diǎn)為PARSSR/GLF，其余毒株HA的裂解位點(diǎn)為PSRSSR/GLF，均沒(méi)有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，屬于低致病性病毒。有研究表明，HA基因226位及228位受體結(jié)合位點(diǎn)決定宿主特異性的關(guān)鍵性位點(diǎn)[12-13]，如第226位氨基酸殘基為Gln，則具有SAa-2,3Gal受體結(jié)合特異性；若為L(zhǎng)eu，則具有SAa-2,6Gal受體結(jié)合特異性；如果第226位氨基酸殘基為Met，則同時(shí)具有對(duì)SAa-2,3Gal和SAa-2,6Gal的結(jié)合能力。本研究中，12株AIV毒株受體結(jié)合位點(diǎn)中的234位點(diǎn)由Q突變?yōu)長(zhǎng)，說(shuō)明其易于結(jié)合哺乳動(dòng)物，這與桑曉宇等[2]的研究結(jié)果相似。所有12株H9N2亞型毒株M2基因編碼的氨基酸位點(diǎn)中的31位由S替換為N，產(chǎn)生了抗金剛烷胺類(lèi)藥物的耐藥性，可能是這些毒株長(zhǎng)期在自然界進(jìn)化過(guò)程中，在家禽體內(nèi)長(zhǎng)期受到藥物的刺激而產(chǎn)生了耐藥性。

本研究分離的12株H9N2亞型毒株進(jìn)化比較同步，處于 DK/HK/Y280/97分支，與現(xiàn)有我國(guó)南方地區(qū)流行的毒株相一致[14]。從本研究供試的AIV 6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)化樹(shù)可以看出，供試毒株與H5、H9亞型毒株處于同一分支，它們之間可能存在著基因的重組，尤其是此次流行的人感染H7N9亞型禽流感毒株內(nèi)部基因與本研究分離的H9亞型毒株核苷酸同源性很高；同時(shí)研究結(jié)果也證明，引起H7N9亞型禽流感感染人的毒株內(nèi)部基因全來(lái)自于H9亞型毒株[15]，因此應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)H9亞型禽流感的監(jiān)測(cè)，關(guān)注H9亞型的遺傳進(jìn)化情況。

總之，湖南省H9亞型禽流感病毒的遺傳演化較為復(fù)雜，存在廣泛的基因重排現(xiàn)象，必須提高對(duì)其危害性的認(rèn)識(shí)，在防控工作上對(duì)其要有足夠的重視，才能有效地防止禽流感疫情的發(fā)生。

圖 4　湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的PB2基因進(jìn)化樹(shù)

圖 5　湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的PB1基因進(jìn)化樹(shù)

圖 6湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的PA基因進(jìn)化樹(shù)

Fig.6Phylogenetic tree of H9N2 subtype AIVPAgene from Dongting Lake region,Hunan

圖 7　湖南洞庭湖區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的NP基因進(jìn)化樹(shù)

圖 8湖南洞庭湖區(qū) H9N2亞型禽流感病毒的NS基因進(jìn)化樹(shù)

Fig.8Phylogenetic tree of H9N2 subtype AIVNSgene from Dongting Lake region,Hunan

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Genetic evolution analysis of twelve H9N2 subtype avian influenza virus in Dongting Lake,Hunan

HUANG Jian-long1,TAN Dan1,2,WANG Chang-jian1,ZHANG Chao-yang1,HE Shi-cheng1,ZHU Chun-xia1, WANG Hong-bing1,DENG Guo-hua2,LIU Dao-xin1

(1HunanProvincialAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Changsha,Hunan410014,China;2AnimalInfluenzaLaboratoryoftheMinistryofAgricultural,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang150001,China)

Abstract:【Objective】 The study explored the genetic variation characteristics and evolution of H9N2 subtype avian influenza virus isolated from Dongting Lake area from the perspective of molecular biology.【Method】 Twelve strains of H9N2 subtype avian influenza virus were isolated from Dongting Lake area,and the gene fragments were amplified,sequenced and analyzed using Mega 5.【Result】 All the twelve strains of H9N2 subtype avian influenza virus belonged to low pathogenic avian influenza virus,because their cracking sites did not have inset of continuous alkaline amino acids.The HA and NA gene evolution of the twelve strains of H9N2 subtype avian influenza virus were synchronous in DK/HK/Y280/97 branch.Six internal genes (M,PB2,PB1,PA,NA,and NS)showed different degrees of recombination with H5 highly pathogenic avian influenza virus,and the homology were high with H7N9.【Conclusion】 The genetic evolution of H9 subtype avian influenza virus was complex and gene rearrangements existed in Dongting Lake region.

Key words:H9N2 subtype avian influenza virus;genetic evolution;Dongting Lake area;Hunan province

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.001

[收稿日期]2014-06-30

[基金項(xiàng)目]國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB505001)

[作者簡(jiǎn)介]黃建龍(1982-)，男，浙江龍游人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病預(yù)防控制研究。E-mail：to_huangjianlong@126.com[通信作者]鄧國(guó)華(1971-)，男，湖南望城人，研究員，博士研究生，主要從事禽流感病毒分子生物學(xué)研究。E-mail：dgh1971 @163.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]S851.3;Q78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)03-0001-10