在棉花枯萎病新殺菌劑毒力測(cè)定中助溶劑的篩選?

黃倩 韓新才 王文生 高玲 易婷 吳佩 吳麗娜

引用：黃倩，韓新才，王文生，等. 在棉花枯萎病新殺菌劑毒力測(cè)定中助溶劑的篩選[J]. 棉花科學(xué)，2016，38（3）：14-17.

Cite： Huang Qian， Han Xincai， Wang Wensheng， et al. The Cosolvent Screening of New Fungicides in Cotton Fusarium Wilt Toxicity Test[J]. Cotton Sciences， 2016， 38 （3）： 14-17.

摘要：為了篩選對(duì)棉花枯萎病新殺菌劑毒力測(cè)定沒有干擾的安全助溶溶劑。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了3種有機(jī)溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力和安全性。結(jié)果表明：丙酮、DMF和DMSO對(duì)棉花枯萎病菌的EC50值分別是161395.4、2704.8、1848.5 mg/L，以丙酮的毒力最低；其相對(duì)安全的質(zhì)量濃度區(qū)間分別為0～161395.4、0～2704.8、0～1848.5 mg/L，抑菌率分別為0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%，以丙酮最為安全。因而首選安全助溶有機(jī)溶劑為丙酮，其安全質(zhì)量濃度區(qū)間為0～50000 mg/L。

關(guān)鍵詞：棉花；枯萎病菌；毒力測(cè)定；安全溶劑；助溶劑

中圖分類號(hào)：S482.92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：2095-3143（2016）03-0014-04

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2016.03.003

The Cosolvent Screening of New Fungicides in Cotton Fusarium Wilt Toxicity Test

Huang Qian， Han Xincai， Wang Wensheng，

Gao Ling， Yi Ting， Wu Pei， Wu Lina

（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education， Wuhan Institute of Technology， Wuhan 430073， China）

Abstract： In order to filter out the security cosolvent which has no interference in cotton Fusarium Wilt toxicity test of new fungicides， we adopt the growth rate method testing the toxicity and safety of three kinds of organic solvents for cotton Fusarium Wilt. The rusults show that the EC50 value of acetone， N，N-dimethyl formamide （DMF） and dimethyl sulfoxide （DMSO） of cotton Fusarium Wilt are 161395.4， 2704.8， 1848.5 mg/L， respectively， the toxicity of acetone is the lowest； their mass concentration interval of relative safety are 0～161395.4， 0～2704.8， 0～1848.5 mg/L， the bacteriostatic ratio are 0～9.2%， 0～22.2%， 0～6.8%， respectively， the acetone is the most safe. Thus， the first choice of security organic cosolvent is acetone， its safe mass concentration interval is 0～50000 mg/L.

Key words：Cotton； Fusarium Wilt； Toxicity test； Security solvent； Cosolvent

0引言

棉花是世界上最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的三大作物之一，棉花枯萎病是由土壤傳播的病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染棉花維管束而引起的一種毀滅性棉花病害[1]，是影響世界棉花高產(chǎn)的重要因素，由于棉花枯萎病防治難度較大，缺乏有效的防治藥劑[2-4]，因此，研究開發(fā)有效的創(chuàng)新型藥劑，是防治棉花枯萎病殷切期望的。

為了有效防治棉花枯萎病，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者進(jìn)行了有效藥劑的研發(fā)[3-6]，新殺菌劑研發(fā)也有一些報(bào)道[7]。而在新化合物殺菌活性研究中，必須進(jìn)行新化合物對(duì)棉花枯萎病菌室內(nèi)毒力測(cè)定，但進(jìn)行新化合物室內(nèi)毒力測(cè)定的問題是相當(dāng)多的化學(xué)合成的新化合物不溶于水，因此，毒力測(cè)定時(shí)，先要加入有機(jī)溶劑助溶。助溶的有機(jī)溶劑（簡(jiǎn)稱：助溶劑），如果對(duì)棉花枯萎病菌沒有殺菌作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果就沒有干擾，它作為助溶劑就是安全的；如果它有殺菌活性，測(cè)定的新化合物的殺菌率和毒力，就包含新化合物與助溶劑兩者的殺菌率和毒力，干擾了新化合物的毒力測(cè)定結(jié)果，它就是不安全的[8]。因此，研究測(cè)定助溶劑對(duì)棉花枯萎病菌是否有殺菌活性、殺菌毒力大小，篩選出殺菌毒力微小的安全有機(jī)助溶劑及其安全添加濃度區(qū)間，對(duì)于化學(xué)合成的新化合物的殺菌活性科學(xué)評(píng)定以及棉花枯萎病新型殺菌劑的研發(fā)具有重要意義。

本文進(jìn)行丙酮（Acetonc）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N- Dimethyl formamide，簡(jiǎn)稱DMF）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，簡(jiǎn)稱DMSO）3種常用有機(jī)溶劑對(duì)Fusarium oxysporum 的毒力測(cè)定和安全性篩選，旨在探明這3種有機(jī)溶劑作為助溶劑，在棉花枯萎病新殺菌劑或新化合物殺菌活性測(cè)定中的安全性，為棉花枯萎病新殺菌劑毒力測(cè)定時(shí)，助溶有機(jī)溶劑的選擇和安全質(zhì)量濃度設(shè)定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試藥劑

丙酮（Acetonc），分析純AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；N，N-二甲基甲酰胺（N，N- Dimethyl formamide，簡(jiǎn)稱DMF），分析純AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，簡(jiǎn)稱DMSO），分析純AR，天津市博迪化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 供試菌株

棉花枯萎病菌（Fusarium Wilt）菌株，為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院陳守文教授提供。

1.3 藥劑抑菌率測(cè)定方法

分別取一定量的以上3種供試藥劑，制備一定質(zhì)量濃度的母液，每種藥劑分別用無菌水稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，在無菌工作臺(tái)上用無菌吸管吸取1 mL藥液（以無菌水為對(duì)照）加入到直徑為7.5 cm培養(yǎng)皿中，再用無菌注射器加入9 mL熔化后的50℃～60℃的PDA培養(yǎng)基，使藥劑與培養(yǎng)基混勻，冷卻至室溫。然后，向培養(yǎng)皿中接種直徑為5 mm的棉花枯萎病菌菌塊，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，待對(duì)照接近長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，3次重復(fù)，取平均值，計(jì)算藥劑的菌絲抑菌率。

菌絲抑菌率（%）=

1.4 毒力回歸分析

以藥劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為自變量X，以菌絲抑菌率機(jī)率值為因變量Y，計(jì)算出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)R，根據(jù)回歸方程求出抑菌中質(zhì)量濃度EC50值。此過程用軟件SPSS 16.0計(jì)算完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)助溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力回歸分析

實(shí)驗(yàn)選擇的3種有機(jī)助溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力測(cè)定結(jié)果見表1。從表1可以看出：丙酮、DMF、DMSO對(duì)棉花枯萎病菌的毒力回歸方程分別為y=-9.8235+2.8425x、y=-0.5508+1.6224x、y=-2.2364+1.6961x；建立該回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R）分別為0.9805、0.9805、0.9979，相關(guān)性較好；抑菌中質(zhì)量濃度EC50值分別為163195.4、2704.8、1848.5 mg/L。根據(jù)EC50的大小，EC50值越小，表明毒力越大，3種不同有機(jī)溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力大小為：DMSO>DMF>丙酮。毒力越大，作為助溶劑，對(duì)新殺菌劑或新化合物殺菌毒力測(cè)定干擾就越大，越不安全。 因此，助溶劑的安全性與毒力相反，這三種助溶劑的安全順序是丙酮>DMF>DMSO。

2.2 有機(jī)助溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用和安全性分析

3種不同有機(jī)溶劑，在不同質(zhì)量濃度區(qū)間對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌作用不同（表2）。丙酮、DMF和DMSO分別在0～50000、0～1250 和0～2500 mg/L質(zhì)量濃度區(qū)間，對(duì)棉花枯萎病菌都有抑菌活性，其抑菌率分別為0～9.2%、0～22.2%和0～6.8%（表2），說明上述3種有機(jī)溶劑在各自不同質(zhì)量濃度區(qū)間，對(duì)棉花枯萎病菌均有一定的殺滅效果，它們用作棉花枯萎病新殺菌劑或新化合物毒力測(cè)定的助溶劑，都具有一定的不安全性，都不是絕對(duì)安全的。

同時(shí)，從表2可以看出，3種有機(jī)溶劑，其各自最低抑菌質(zhì)量濃度和最低抑菌率不同。丙酮、DMF和DMSO三種有機(jī)溶劑在質(zhì)量濃度分別低至50000、1250、2500 mg/L時(shí)，其對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌率分別為9.2%、22.2%、6.8%；作為助溶劑，這3種有機(jī)溶劑的相對(duì)安全的質(zhì)量濃度區(qū)間分別為0～50000、0～1250、0～2500 mg/L，其抑菌率分別為0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%。因?yàn)楸馁|(zhì)量濃度50000 mg/L比DMSO的質(zhì)量濃度2500 mg/L高20倍，而抑菌率差異不大，分別為9.2%、6.8%，說明丙酮的安全性高于DMSO約20倍。因此，在三種有機(jī)溶劑中，最安全的助溶劑是丙酮，其相對(duì)的安全質(zhì)量濃度區(qū)間為0～50000 mg/L。

3 討論

在農(nóng)藥新殺菌劑殺菌活性的毒力測(cè)定中，對(duì)不溶于水的新化合物，添加少量有機(jī)溶劑助溶，是很普遍現(xiàn)象，通常認(rèn)為，加入少量助溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。通過研究證明，添加的助溶劑對(duì)植物病原菌棉花枯萎病菌均有一定的毒力，這與文獻(xiàn)報(bào)道的有機(jī)助溶劑對(duì)草坪褐斑病菌也有一定毒力是類似的 [8]。因此，在新殺菌劑毒力測(cè)定之前，進(jìn)行安全助溶劑篩選和安全質(zhì)量濃度區(qū)間的測(cè)定，對(duì)新殺菌劑毒力的科學(xué)評(píng)價(jià)具有重要意義。

丙酮、DMF、DMSO除了是最常用的有機(jī)溶劑外，它們均有各自的廣泛用途[9-10]，有關(guān)這三種物質(zhì)各方面應(yīng)用的研究報(bào)告很多，而作為助溶劑，應(yīng)用于農(nóng)藥毒力測(cè)定工作的研究報(bào)告很鮮見 [8]，通過測(cè)定3種有機(jī)溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力，進(jìn)行安全助溶劑的篩選，得出如下結(jié)論：（1）丙酮、DMF和DMSO這3種有機(jī)溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力大小為：DMSO>DMF>丙酮，安全性與毒力大小相反，這3種有機(jī)溶劑作為助溶劑的安全順序是：丙酮>DMF>DMSO；（2）丙酮、DMF和DMSO分別在各自不同質(zhì)量濃度區(qū)間，對(duì)棉花枯萎病菌都有殺菌活性，因此，這3種有機(jī)溶劑作為助溶劑，對(duì)棉花枯萎病菌都不是絕對(duì)安全；（3）在棉花枯萎病新殺菌劑毒力測(cè)定時(shí)，這3種有機(jī)溶劑的相對(duì)安全的質(zhì)量濃度區(qū)間分別為0～50000、0～1250、0～2500 mg/L，在此安全質(zhì)量濃度區(qū)間，其抑菌率分別為0～9.2%、0～22.2%、0～6.8%，其中，首選安全助溶劑為丙酮，其相對(duì)安全質(zhì)量濃度區(qū)間為0～50000 mg/L。在新化合物殺菌毒力測(cè)定的實(shí)際操作中，加入丙酮作為助溶劑的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于50000 mg/L，因此，丙酮作為安全助溶劑，在棉花枯萎病菌毒力測(cè)定中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

通過本實(shí)驗(yàn)，基本弄清楚了3種有機(jī)溶劑作為助溶劑對(duì)棉花枯萎病菌的毒力大小與相對(duì)安全質(zhì)量濃度區(qū)間，篩選出了安全助溶劑丙酮以及相對(duì)安全的添加質(zhì)量濃度區(qū)間，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為棉花枯萎病新的殺菌劑研發(fā)和應(yīng)用，提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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